Abstract
目的
冠心病以其极高的发病率严重威胁着人类的健康，对冠心病药物治疗及作用靶点的研究仍非常迫切。本研究旨在运用核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR)代谢组学技术建立冠心病血瘀证及痰浊证的指纹代谢图谱，寻找这2种证型的血浆标志性代谢物，并揭示血府逐瘀汤治疗冠心病血瘀证的机制。
方法
采集符合纳入标准的69例冠心病血瘀证患者、60例冠心病痰浊证患者及40例健康对照受试者的清晨空腹血浆，基于1H-NMR构建冠心病血瘀证及痰浊证的1H-NMR指纹代谢图谱。使用多元统计分析方法主成分分析(principal component analysis，PCA)、正交化偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)寻找冠心病血瘀证及冠心病痰浊证的标志性代谢物。随机抽取冠心病血瘀证患者30例，予血府逐瘀汤治疗30 d，对治疗前后的清晨空腹血浆进行1H-NMR检测，分析冠心病血瘀证患者服药前后标志性代谢物的变化。
结果
冠心病血瘀证组与对照组存在显著性差异的代谢物有以下15种：3-羟基丁酸、乳酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙酮酸、磷脂酰胆碱、甘油磷脂酰胆碱、甘氨酸、葡萄糖、苯丙氨酸、柠檬酸、酪氨酸、甲酸盐、极低密度脂蛋白，除葡萄糖、3-羟基丁酸、极低密度脂蛋白水平升高外，其他12种代谢物水平均下降。冠心病痰浊证组与对照组存在显著性差异的代谢物有以下16种：缬氨酸、乳酸、丙氨酸、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、谷氨酸、谷氨酰胺、丙酮酸、肌酸、胆碱、甘氨酸、葡萄糖、苯丙氨酸、柠檬酸、组氨酸、酪氨酸、甲酸盐，除葡萄糖和胆碱2种水平升高外，其他14种代谢物水平均下降。冠心病血瘀证患者服用血府逐瘀汤治疗后胆碱、磷脂/甘油磷脂类、肌酸、脂质、柠檬酸水平升高，乳酸水平下降。
结论
1H-NMR结合多元统计学方法能够建立诊断冠心病血瘀证和痰浊证证型的有效模型，找到证型相关标志性代谢物；血府逐瘀汤可通过调节脂质代谢、能量代谢治疗冠心病血瘀证。
Keywords: 冠心病血瘀证, 冠心病痰浊证, 代谢组学, 核磁共振氢谱, 血府逐瘀汤
Abstract
Objective
Coronary heart disease (CHD) is a serious threat to human health because of its high morbidity. It is very urgent to study the pathogenesis of CHD and the effective drug target. The purpose of this paper is using the 1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR) metabolomics technology to establish the metabolic fingerprint and find the potential biomarker metabolites of CHD with blood-stasis syndrome and phlegm syndrome, and to reveal the metabolic mechanism of Xuefu Zhuyu Decoction for the treatment of CHD with blood stasis syndrome.
Methods
The plasma samples of 69 patients with CHD blood-stasis syndrome, 60 patients with CHD phlegm syndrome, and 40 healthy volunteers were collected in this study. Based on the 1H-NMR metabolomics technology, the metabolic fingerprint of CHD with blood-stasis syndrome and phlegm syndrome was established. Multivariate statistical analysis methods including principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) were used to find the potential biomarker metabolites of CHD with blood-stasis syndrome and phlegm syndrome. Xuefu Zhuyu Decoction was used to randomly selected blood-stasis syndrome patient. The plasma samples of pre-treatment and post-treatment were collected. 1H-NMR and multivariate statistical analysis were used to analyze the changes of metabolites in patients with CHD blood-stasis syndrome before and after Xuefu Zhuyu Decoction treatment.
Results
A total of 15 potential biomarkers were identified in the plasma of patients with CHD blood-stasis syndrome, including 3-hydroxybutyrate (3-HB), lactate, alanine, glutamate, glutamine, pyruvate,phosphatidylcholine (PC), glycerylphosphorylcholine (GPC), glycine, glucose, phenylalanine, citrate,tyrosine, formate,very low density lipoprotein (VLDL). The levels of glucose, 3-HB, and VLDL increased, while the levels of other 12 metabolites decreased. A total of 16 potential biomarkers were identified in the plasma of patients with CHD phlegm syndrome, including valine, lactate, alanine, N-acetyl-β-glucosaminidase (NAG), glutamate, glutamine, pyruvate, creatine, choline, glycine, glucose, phenylalanine, citrate, histidine, tyrosine, and formate. The levels of glucose and choline increased, while the levels of other 12 metabolites decreased. After treatment with Xuefu Zhuyu Decoction, the levels of choline, phospholipids/glycerolipids, creatine, lipids, and citrate increased, while the level of lactate decreased in patients with CHD blood-stasis syndrome.
Conclusion
1H-NMR combined with multivariate statistical method could effectively establish the diagnostic model for CHD blood-stasis syndrome and CHD phlegm syndrome, and find the metabolites related to the syndrome type. The metabolic mechanism of Xuefu Zhuyu Decoction on CHD blood-stasis syndrome may be associated with regulation of lipid metabolism and energy metabolism.
Keywords: coronary heart disease blood-stasis syndrome, coronary heart disease phlegm syndrome, metabolomics, 1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy, Xuefu Zhuyu Decoction
冠心病是以动脉粥样硬化为主要病理改变的缺血性心脏疾病，临床以胸闷、胸痛为主要特征，严重威胁着人类健康，也是现阶段全球范围造成死亡的最主要原因[1-2]。冠心病属于中医的“胸痹”的范畴，关键的病理为痰凝血瘀，基本的病机是心脉瘀阻，最常见的证型为血瘀证和痰浊证。血府逐瘀汤是中医治疗“胸痹”的经典方，具有活血化瘀、行气止痛之效，现代医家用血府逐瘀汤治疗冠心病取得了显著的临床疗效[3-4]。
中医证候是疾病发生和演变过程中特定阶段以及患者个体当时所处特定内外环境的本质反映，能够不同程度地揭示病因、病位、病性、邪正盛衰、病势等病机整体内容，是对致病因素与机体反应性两方面情况的综合反应。非靶向代谢组学以整体研究为其特征，通过全面分析疾病证候的代谢指纹谱，结合生物信息学方法，找出特征代谢物，以确定“证相关代谢谱群”，为中医证型的研究提供了重要手段。核磁共振氢谱(1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR)作为代谢组学的检测手段之一，具有快速、准确、专属性高的特点，它不破坏样品的结构和性质，混合物中不同代谢物的1H-NMR响应系数一致，属于无偏向检测技术；且1H-NMR中信号强度与样品浓度成正比，可对代谢物进行定量分析[5]。因此，本研究采用1H-NMR代谢组学检测技术分析冠心病血瘀证、冠心病痰浊证患者血浆的代谢组学变化，以期寻找揭示其证候本质的标志性代谢物，并探讨血府逐瘀汤治疗冠心病血瘀证的代谢机制。
1. 对象与方法
1.1. 对象
收集2016年1至5月于中南大学湘雅医院确诊为冠心病的患者129例。冠心病的诊断参照2002年美国心血管学会和美国心脏病协会制订的标准：冠状动脉造影结果显示主要冠状动脉(左前降支、左回旋支、右冠状动脉)中至少有1支内径狭窄≥50%。根据国家中医药管理局发布的《中医病症诊断疗效标准》[6]，将患者分为血瘀证组和痰浊证组。冠心病痰浊证：“心胸窒闷或如物压，气短喘促，多形体肥胖，肢体沉重，脘痞，痰多口粘，舌苔浊腻，脉滑”；冠心病血瘀证：“心胸阵痛，如刺如绞，固定不移，入夜为甚，伴有胸闷心悸，面色晦暗。舌质紫暗，或有瘀斑，舌下络脉青紫，脉沉涩或结代”。由3名中医师确诊，诊断一致者方可纳入相应组别。
另设年龄、性别与血瘀证组和痰浊证组匹配的对照组。对照组纳入标准为无任何冠心病证据。无血管造影指征的对照组受试者不进行血管造影检查。对照组排除标准：1)白细胞减少、血小板减少、有严重感染史者；2)有高血压心脏病、慢性肺源性心脏病、贫血性心脏病、脑血管病、糖尿病性心肌病或其他恶性肿瘤者；3)肝肾功能不全者；4)孕妇、哺乳期妇女。
血瘀证组69例，其中男36例、女33例，年龄54~75(64.7±9.3)岁；痰浊证组60例，其中男34例、女26例，年龄45~78(61.1±16.0)岁；对照组40例，其中男23例、女17例，年龄48~74(61.0±12.8)岁。3组性别组成、年龄的差异无统计学意义(均P>0.05)。进一步在冠心病血瘀证患者中随机抽取30例使用血府逐瘀汤治疗。本研究经中南大学湘雅医院伦理委员会批准(批准号：201303094)，所有受试者及其家属知情同意并签署知情同意书。
1.2. 方法
1.2.1. 血府逐瘀汤的治疗
30例冠心病血瘀证患者使用的血府逐瘀汤为原方现代制剂(国药准字Z12020223，天津宏仁堂药业有限公司生产)，药物组成是当归、生地、川芎、桃仁、红花、赤芍、枳壳、柴胡、牛膝、桔梗、甘草。治疗方案为每次6粒，每日2次，每疗程30 d。
1.2.2. 样本的收集和制备
使用含有肝素钠抗凝剂的试管采集受试者晨起空腹静脉血3 mL，静置30 min后离心(4 ℃，3 000 r/min，15 min)，取上清血浆，置于-80 ℃冰箱保存备用。
检测前将血浆样本在室温下解冻，在1.5 mL EP管中加入200 μL的血浆样本，400 μL的缓冲液 (0.045 mmol/L NaH2PO4/K2HPO4，pH值为7.4，100% D2O)，震荡混匀后离心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)，取550 μL上清液至5 mm样品管中待检。
1.2.3. 检测方法
采用超导傅里叶核磁共振谱仪(瑞士Bruker公司，型号Bruker AVIII 600 MHz)进行检测，质子的共振频率为600.13 MHz。采用有预饱和压水的1D CPMG脉冲序列，检测各个样本的小分子代谢物成分。基本参数如下：90°脉宽为10 s，采样点数为32 K，谱宽20 ppm，采样时间为1.36 s，扫描次数为64，空扫次数为8，采样温度为298 K。
对采集的所有一维1H-NMR谱图的自由感应衰减(free induction decay，FID)谱图信号加上增宽因子为1 Hz的指数窗函数后进行傅立叶变换，以提高信噪比；使用Mestrenova软件9.0.1校正谱图的相位和基线；使用α-葡萄糖低场的信号(δ 5.23)进行化学位移定标。使用AMIX软件(V3.9.2)对定标后的谱图在0.6~9.0 ppm区域分段积分，积分区间宽为0.002 ppm，去除水峰(4.14~5.20 ppm)和尿素峰(5.50~6.60 ppm)。
1.3. 统计学处理
将1H-NMR谱图的数据进行初步处理后导入SIMCA-P软件包(V14，Umetrics，Sweden)，采用主成分分析(principal component analysis，PCA)、正交化偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)进行多元统计分析。数据采用自适换算标准化方式进行处理。采用7倍交叉验证、200次重复排列置换检验评价OPLS-DA模型的准确性。采用OPLS-DA分析中的相关系数(r)来确定2组间血浆的差异代谢物。在对数据进行回溯转换后，采用Matlab软件(V7.0.4，Mathworks Inc.，USA)绘制针对每个变量的皮尔森相关系数负载图，找出组间有显著性差异的化学成分，并进行颜色编码，颜色反映代谢物变化的显著性，从冷色(蓝色)到暖色(红色)表示显著性逐渐升高。通过查阅相关系数表，确定相关系数|r|>0.301作为临界值(P<0.05)，来判别组间差异代谢物，r>1说明差异物质上调，r<1说明差异物质下调。
对使用血府逐瘀汤治疗的冠心病血瘀证患者治疗前、后的血浆代谢物的峰面积进行手动积分，将峰面积表导入SIMCA-P软件包再次进行PCA和OPLS-DA多变量统计分析。使用OPLS-DA模型的变量重要性投影(variable importance projection，VIP)值对差异性代谢物进行预选(VIP>1说明对分类有贡献)。
2. 结 果
2.1. 1H-NMR谱图
选择3组的代表性1H-NMR谱图，根据一维谱图谱峰的化学位移，并对照相关研究[7-8]和共享数据库对核磁共振信号进行代谢物归属(图1)。
图1.
冠心病血瘀证组、冠心病痰浊证组及对照组的代表性 1H -NMR图谱
Figure 1 Typical spectra of plasma samples in the group of coronary heart disease blood-stasis syndrome, the group of coronary heart disease phlegm syndrome, and the group of control
B: Coronary heart disease with blood-stasis syndrome; P: Coronary heart disease with phlegm syndrome; C: Control; 3-HB: 3-hydroxybutyrate; NAG: N-acetyl-glycoprotein; OAG: O-acetyl-glycoprotein; PC: Phosphorycholine; GPC: Glycerophosphorycholine; L1: LDL, CH3-(CH2)n-; L2: VLDL, CH3-(CH2)n-; L3: LDL, CH3-(CH2)n-; L4: VLDL, CH3-(CH2)n-; L5: VLDL, -CH2-CH2-C=O; L6: Lipids, -CH2-CH=CH-; L7: Lipids, -CH2-C=O; L8: Lipids, =CH-CH2-CH=; L9: Lipids, -CH=CH-.
2.2. 冠心病痰浊证、血瘀证的模式识别及差异代谢物质鉴定
2.2.1. PCA模式识别
3组的PCA三维散点得分图(图2)可完全分开，PCA模型获得2个主成分，模型可解释的变量R2X为87.2%，模型的可预测度Q2为74.4%，均较高，说明模型可靠。
图2.
冠心病血瘀证组、冠心病痰浊证组及对照组的PCA三维散点得分图
Figure 2 Three-dimensional scatter score map of PCA in the group of coronary heart disease blood-stasis syndrome, the group of coronary heart disease phlegm syndrome, and the group of control
B: Coronary heart disease with blood-stasis syndrome; P: Coronary heart disease with phlegm syndrome; C: Control
2.2.2. OPLS-DA模式识别
冠心病血瘀证组与对照组的OPLS-DA得分图(3A)示OPLS-DA模型的R2X为85.5%，Q2为82%。使用200次重复排列置换检验，得到R2为0.264，Q2为-0.329，表明模型不存在过拟合。在冠心病血瘀证组与对照组的相关系数负载图(3B)中，颜色代表代谢物变化的显著性，从冷色(蓝色)到暖色(红色)显著性逐渐升高。冠心病血瘀证组与对照组存在显著性差异的代谢物有以下15种：3-羟基丁酸(3-hydroxybutyrate，3-HB)、乳酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙酮酸、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、甘油磷脂酰胆碱(glycerylphosphorylcholine，GPC)、甘氨酸、葡萄糖、苯丙氨酸、柠檬酸、酪氨酸、甲酸盐、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)，除葡萄糖、3-HB及VLDL水平升高外，其他12种代谢物水平均下降(表1)。
表1.
组间差异代谢物及其相关系数
Table 1 Differential metabolites and correlation coefficients between groups
| Metabolic substance | Chemical shift | r | |
|---|---|---|---|
| P vs C | B vs C | ||
| Valine | 0.99(d), 1.04(d) | -0.554 | |
| 3-HB | 1.20(d) | 0.395 | |
| Lactate | 1.32(d), 4.11(q) | -0.600 | -0.649 |
| Alanine | 1.48(d) | -0.544 | -0.389 |
| NAG | 2.03(s) | -0.376 | |
| Glutamate | 2.06(m), 2.35(m) | -0.727 | -0.779 |
| Glutamine | 2.13(m), 2.46(m) | -0.794 | -0.779 |
| Metabolic substance | Chemical shift | r | |
|---|---|---|---|
| P vs C | B vs C | ||
| Pyruvate | 2.37(s) | -0.492 | -0.440 |
| Creatine | 3.03(s), 3.94(s) | -0.523 | |
| Choline | 3.20(s) | 0.410 | |
| PC | 3.22(s) | -0.339 | |
| GPC | 3.22(s) | -0.339 | |
| Glycine | 3.56(s) | -0.580 | -0.650 |
| Glucose | 3.42(t), 3.54(dd), 3.71(t), 3.73(m), 3.84(m), 3.25(dd), 3.41(t), 3.46(m), 3.49(t), 3.90(dd), 4.65(d), 5.23(d) | 0.327 | 0.327 |
| Phenylalanine | 7.32(d), 7.37(t), 7.42(dd) | -0.818 | -0.627 |
| Citrate | 2.53(d), 2.64(d) | -0.933 | -0.920 |
| Histidine | 7.06(s), 7.78(s) | -0.358 | |
| Tyrosine | 6.90(d), 7.19(d) | -0.707 | -0.505 |
| Formate | 8.45(s) | -0.431 | -0.345 |
| L2: VLDL, CH3-(CH2)n- | 0.88(m) | 0.373 | |
P：冠心病痰浊证组；B：冠心病血瘀证组；C：对照组。
冠心病痰浊证组与对照组的OPLS-DA得分图(4A)示OPLS-DA模型的R2X为85.3%，Q2为81.5%。使用200次重复排列置换检验，得到R2为0.247，Q2为-0.331，表明模型不存在过拟合。冠心病痰浊证组与对照组的相关系数负载图(4B)显示：冠心病痰浊证组与对照组存在显著性差异的代谢物有缬氨酸、乳酸、丙氨酸、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-glucosaminidase，NAG)、谷氨酸、谷氨酰胺、丙酮酸、肌酸、胆碱、甘氨酸、葡萄糖、苯丙氨酸、柠檬酸、组氨酸、酪氨酸、甲酸盐共16种，除葡萄糖和胆碱2种水平升高外，其他14种水平均下降(表1)。
图3.
冠心病血瘀证组和对照组的OPLS-DA得分图(A)和相关系数负载图(B)
Figure 3 OPLS-DA score plots (A) and correlation coefficient load diagram (B) of the group of coronary heart disease blood-stasis syndrome and the group of control
C: Control; B: Coronary heart disease with blood-stasis syndrome.
图4.
冠心病痰浊证和对照组的OPLS-DA得分图(A)和相关系数负载图(B)
Figure 4 OPLS-DA score plots (A) and correlation coefficient load diagram (B) of the group of coronary heart disease phlegm syndrome and the group of control
C: Control; P: Coronary heart disease with phlegm syndrome.
2.3. 血府逐瘀汤对冠心病血瘀证患者血浆代谢物质的调节
2.3.1. 治疗前后PCA模式识别
血府逐瘀汤治疗冠心病血瘀证前后PCA三维散点得分图(图5)分离趋势明显，表明患者血浆中代谢物质治疗前后差异明显，PCA模型获得2个主成分，模型可解释的变量R2X为63.5%，模型的可预测度Q2为53.6%。
图5.
血府逐瘀汤治疗冠心病血瘀证前后的PCA三维散点得分图
Figure 5 Three-dimensional scatter score map of PCA before and after Xuefu Zhuyu Decoction treatment for coronary heart disease blood-stasis syndrome
2.3.2. 血府逐瘀汤临床疗效的血液流变学评价
采用血府逐瘀汤治疗后，患者的全血黏度(高剪切和低剪切)、血浆黏度、红细胞聚集指数均明显低于治疗前(均P<0.05，表2)。
表2.
血府逐瘀汤对冠心病血瘀证患者临床疗效的血液流变学评价
Table 2 Hemorheological evaluation of clinical effect of Xuefu Zhuyu Decoction on coronary heart disease blood-stasis syndrome
| Group | Whole blood viscosity/(m·Pa-1·S-1) | Plasma viscosity/(m·Pa-1·S-1) | Erythrocyte aggregation index | |
|---|---|---|---|---|
| High shear | Low shear | |||
| Before treatment | 4.11±0.38 | 7.78±0.39 | 2.34±0.78 | 4.63±0.70 |
| After treatment | 3.34±0.45* | 6.38±0.20* | 1.51±0.24* | 4.17±0.67* |
*P<0.05。
2.3.3. 治疗前后OPLS-DA模式
血府逐瘀汤治疗冠心病血瘀证前后的OPLS-DA得分图(图6A)显示：两组分离趋势明显，且OPLS-DA模型的R2Y为68.7%，Q2为65.2%。使用200次重复排列置换检验，得到R2值与Y轴交点为0.392，Q2与Y轴交点为-0.0584，说明模型不存在过拟合情况。血府逐瘀汤治疗冠心病血瘀证前后的相关系数负载图(图6B)显示：治疗后胆碱、磷脂/甘油磷脂类、肌酸、脂质、柠檬酸水平升高，乳酸水平下降(表3)。
图6.
血府逐瘀汤治疗冠心病血瘀证前后的OPLS-DA得分图(A)和相关系数负载图(B)
Figure 6 OPLS-DA score plots (A) and correlation coefficient load diagram (B) before and after Xuefu Zhuyu Decoction treatment of coronary heart disease blood-stasis syndrome
表3.
血府逐瘀汤治疗前后差异代谢物及其相关系数
Table 3 Differential metabolites and correlation coefficients before and after Xuefu Zhuyu Decoction treatment
| Metabolic substance | Chemical shift | r |
|---|---|---|
| Lactate | 1.33(d), 4,12(q) | -0.429 |
| Citrate | 2.52(d), 2.64(d) | 0.664 |
| Lipids(=CH-CH2-CH=) | 2.74(s) | 0.391 |
| Creatine | 3.03(s) | 0.467 |
| Choline | 3.18(s) | 0.461 |
| PC/GPC | 3.20(s) | 0.348 |
3. 讨 论
痰浊证和血瘀证作为中医中冠心病最常见的两个证型，是冠心病发生和发展病理过程的两个不同阶段。已有大量研究[9-14]从血脂、血液流变学、炎症因子、血管内皮的结构和功能、平滑肌细胞的凋亡、基因的表达等多个微观角度来探讨二者的演变及联系，认为冠心病的中医病理基础多为由痰至瘀，痰瘀互结，瘀阻心脉。
本研究使用1H-NMR技术结合多元统计分析发现：与健康对照比较，冠心病血瘀证和痰浊证患者血浆中乳酸、丙酮酸、柠檬酸水平明显下降。乳酸、丙酮酸、柠檬酸主要涉及三羧酸循环。三羧酸循环是有氧代谢供能的主要途径，该途径的第一步就是由乙酰辅酶A与草酰乙酸形成柠檬酸。在本研究中，冠心病患者血浆中柠檬酸水平均明显下降，说明冠心病患者存在较严重的三羧酸能量代谢障碍，与Sabatine等[15]研究的结果相同。丙酮酸作为乳酸被摄取后糖酵解的代谢物，是糖类代谢和脂类代谢进入三羧酸循环的中间产物，可以调节三羧酸循环。本研究中冠心病血瘀证和痰浊证患者血浆中乳酸、丙酮酸水平均明显下降，说明冠心病患者有严重能量代谢异常。丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、酪氨酸均属于氨基酸代谢，这些代谢物质在冠心病血瘀证和/或痰浊证患者血浆中水平均明显下降。研究[16]证实：酪氨酸激酶及其相关受体的上调与冠心病内皮通透性及粥样斑块的形成密切相关，酪氨酸残基在酪氨酸激酶的作用下磷酸化。
本研究发现3-HB、VLDL、PC、GPC等代谢小分子可作为冠心病血瘀证的标志性代谢物，其主要涉及脂质代谢。脂质代谢紊乱是引起动脉粥样硬化发生和进展的重要因素。3-HB是在肝脏中合成的一种酮体，它提供乙酰辅酶并和乙酰辅酶A合成胆固醇、脂肪酸和复合脂质，是脂质合成的重要原料。本研究发现冠心病血瘀证患者血浆中3-HB水平均明显上升，说明脂质合成原料增加。VLDL是运输内源性胆固醇的主要形式，一般条件下并没有致动脉粥样硬化的作用，但当其水平在体内显著升高时，血浆中的三酰甘油和胆固醇水平也会随之增高，载脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)也会相对增加，随着VLDL水平在体内的升高，其颗粒会逐渐细小，密度逐渐增加，此时具有很强的致动脉粥样硬化的作用。因此，VLDL也被认为是能够导致动脉粥样硬化的因子。冠心病血瘀证患者血浆中的PC和GPC水平明显下降，而PC和GPC是磷脂的重要组成部分，主要用来构成细胞膜双层结构，保证细胞器功能和代谢的稳定。在低密度脂蛋白受体基因敲除(low density lipoprotein receptor gene knockout，LDLR-/-)动脉粥样硬化小鼠的血浆中，PC和GPC水平明显下降，说明在动脉粥样硬化过程中存在较严重的磷脂代谢紊乱[17]。研究[18]报道人体血浆中PC和GPC水平降低是冠心病发生的危险因素。本研究发现3-HB、VLDL、PC和GPC在冠心病血瘀证患者血浆中变化明显，证明冠心病血瘀证患者血浆中存在较严重的脂质代谢紊乱，这些小分子物质可以作为冠心病血瘀证的潜在生物标志物。
NAG、肌酸、胆碱、组氨酸、缬氨酸可作为冠心病痰浊证的标志性代谢产物。这些小分子代谢产物主要与炎症反应、能量代谢、氨基酸代谢有关。人体内存在α-胰蛋白酶、转铁蛋白、珠蛋白、免疫球蛋白和纤维蛋白原等多种NAG，这些NAG多与炎症性疾病的发生相关[19]。有研究[20]报道NAG可作为大动脉炎血清潜在的生物标志物，并且与糖尿病颈动脉粥样硬化密切相关[20]。在本研究中，冠心病痰浊证患者血浆中NAG水平明显下降，提示在冠心病痰浊证患者冠状动脉粥样硬化的发生和发展过程中，冠状动脉的炎症反应可能与NAG相关。胆碱是甘油磷脂代谢通路的中间产物，人体内的胆碱可氧化形成甜菜碱，肠道微生物对甜菜碱和胆碱的分解代谢生成氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide，TMAO)，而甜菜碱/胆碱比值与心血管疾病呈负相关，胆碱与三酰甘油之间呈显著正相关[21]，甜菜碱和TMAO均与AS的发生密切相关[22-23]。在本研究中，冠心病痰浊证患者血浆中胆碱水平明显升高，可能引起TMAO水平升高、甜菜碱/胆碱比值下降，最终导致动脉粥样硬化，因此胆碱可作为冠心病痰浊证的代谢小分子标志物。肌酸在人体中主要存在于肌肉组织中，由甘氨酸、丝氨酸、蛋氨酸在肝中合成，主要与细胞的能量转移有关，冠心病痰浊证患者血浆中肌酸水平下降明显，提示患者存在能量代谢异常。研究[24]证实组氨酸具有心肌保护作用，组氨酸可通过降低游离自由基的毒性作用，阻止活性氧的生成，保存高能磷酸来减轻心肌缺血再灌注损伤，维持心肌细胞内pH值的稳定，从而起到保护心肌正常功能的作用。冠心病痰浊证患者血浆组氨酸水平明显下降，可能导致上述心肌保护作用减弱。
本研究发现：血府逐瘀汤可调节冠心病血瘀证患者血浆中乳酸、柠檬酸、脂质、肌酸、胆碱、PC/GPC的水平，其中乳酸、柠檬酸、PC/GPC均为冠心病血瘀证的特征性小分子代谢产物。“以方测证”进一步证实了冠心病血瘀证的代谢轮廓及证型稳定性。在本研究中，使用血府逐瘀汤后，冠心病血瘀证患者血浆柠檬酸、肌酸水平较用药前明显升高，乳酸水平明显降低，说明血府逐瘀汤能够改善冠心病心脉痹阻缺氧导致的能量代谢异常。冠心病血瘀证患者存在较严重的磷脂代谢紊乱，在使用血府逐瘀汤后患者血浆中PC/GPC水平显著上调，说明血府逐瘀汤可纠正机体磷脂代谢的紊乱状态。血府逐瘀汤主要通过调节脂质代谢通路、能量代谢通路治疗冠心病血瘀证。
本研究使用1H-NMR技术结合多元统计分析建立了冠心病血瘀证和痰浊证的指纹代谢图谱，找到证型相关代谢产物及相关代谢通路，说明代谢组学技术可以有效地运用到中医证型相关研究中；进一步使用血府逐瘀汤治疗冠心病血瘀证患者，“以方测证”证实了血瘀证证型的稳定性，初步阐释了血府逐瘀汤治疗冠心病的的代谢机制。
从2012年第1期开始，本刊对大家较熟悉的以下常用词汇，允许直接使用缩写，即首次出现时可不标注中文。
| 5-FU | 5-氟尿嘧啶 | FDA | 美国食品药品管理局 | NS | 生理氯化钠溶液 |
| 5-HT | 5-羟色胺 | FITC | 异硫氰酸荧光素 | PaCO2 | 动脉血二氧化碳分压 |
| ABC法 | 抗生物素蛋白-生物素酶复合物法 | GFP | 绿色荧光蛋白 | PaO2 | 动脉血氧分压 |
| ACh | 乙酰胆碱 | GSH | 谷胱甘肽 | PBS | 磷酸盐缓冲液 |
| AIDS | 获得性免疫缺陷综合征 | HAV | 甲型肝炎病毒 | PCR | 聚合酶链反应 |
| ALT | 丙氨酸转氨酶 | Hb | 血红蛋白 | PI3K | 磷脂酰肌醇3激酶 |
| AngII | 血管紧张素II | HBV | 乙型肝炎病毒 | PLT | 血小板 |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | HCG | 人绒毛膜促性腺激素 | PT | 凝血酶原时间 |
| AST | 天冬氨酸转氨酶 | HCV | 丙型肝炎病毒 | PVDF | 聚偏二氟乙烯膜 |
| ATP | 三磷酸腺苷 | HDL-C | 高密度脂蛋白胆固醇 | PET/CT | 正电子发射计算机体层显像仪 |
| bFGF | 碱性成纤维细胞转化生长因子 | HE | 苏木精-伊红染色 | RBC | 红细胞 |
| BMI | 体重指数 | HGF | 肝细胞生长因子 | RNA | 核糖核酸 |
| BP | 血压 | HIV | 人类免疫缺陷病毒 | ROS | 活性氧 |
| BSA | 牛血清白蛋白 | HR | 心率 | real-time PCR | 实时聚合酶链反应 |
| BUN | 尿素氮 | HRP | 辣根过氧化物酶 | real-time RT-PCR | 实时反转录聚合酶链反应 |
| CCr | 内生肌酐清除率 | HSP | 热休克蛋白 | RT-PCR | 反转录聚合酶链反应 |
| CCK-8 | 细胞计数试剂盒-8 | HPF | 高倍视野 | SABC法 | 链霉抗生物素蛋白-生物素酶复合物法 |
| COX-2 | 环氧化酶-2 | IC50 | 半数抑制浓度 | SDS-PAGE | 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 |
| Cr | 肌酐 | ICU | 重症监护病房 | SCr | 血肌酐 |
| CRP | C反应蛋白 | IFN | 干扰素 | SO2 | 血氧饱和度 |
| CT | 计算机体层摄影 | IL | 白细胞介素 | SOD | 超氧化物歧化酶 |
| CV | 变异系数 | iNOS | 诱导型一氧化氮合酶 | SP法 | 标记的链霉抗生物素蛋白-生物素法 |
| DAB | 二氨基联苯胺 | IPG | 固相pH梯度 | SPF | 无特定病原体 |
| ddH2O | 双蒸水 | JNK | 氨基末端激酶 | STAT3 | 信号转导和转录激活因子3 |
| DMEM | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | LDL-C | 低密度脂蛋白胆固醇 | Tbil | 总胆红素 |
| DMSO | 二甲基亚砜 | LPS | 内毒素/脂多糖 | TBST | Tris-盐酸洗膜缓冲液 |
| DNA | 脱氧核糖核酸 | MAP | 平均动脉压 | TC | 总胆固醇 |
| ECG | 心电图 | MAPK | 丝裂原活化蛋白激酶 | TG | 三酰甘油 |
| ECL | 增强化学发光法 | MDA | 丙二醛 | TGF | 转化生长因子 |
| ECM | 细胞外基质 | MMP | 基质金属蛋白酶 | Th | 辅助性T细胞 |
| EDTA | 乙二胺四乙酸 | MRI | 磁共振成像 | TLRs | Toll样受体 |
| EEG | 脑电图 | mTOR | 雷帕霉素靶蛋白 | TNF | 肿瘤坏死因子 |
| EGF | 表皮生长因子 | MTT | 四甲基偶氮唑盐微量酶反应 | TUNEL | 原位末端标记法 |
| ELISA | 酶联免疫吸附测定 | NADPH | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | VEGF | 血管内皮生长因子 |
| eNOS | 内皮型一氧化氮合酶 | NF-κB | 核因子-κB | VLDL-C | 极低密度脂蛋白胆固醇 |
| ERK | 细胞外调节蛋白激酶 | NK细胞 | 自然杀伤细胞 | vWF | 血管性血友病因子 |
| ESR | 红细胞沉降率 | NO | 一氧化氮 | WBC | 白细胞 |
| FBS | 胎牛血清 | NOS | 一氧化氮合酶 | WHO | 世界卫生组织 |
基金资助
国家自然科学基金(81800043)。
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81800043).
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202106591.pdf
参考文献
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Associated Data
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Supplementary Materials
从2012年第1期开始，本刊对大家较熟悉的以下常用词汇，允许直接使用缩写，即首次出现时可不标注中文。
| 5-FU | 5-氟尿嘧啶 | FDA | 美国食品药品管理局 | NS | 生理氯化钠溶液 |
| 5-HT | 5-羟色胺 | FITC | 异硫氰酸荧光素 | PaCO2 | 动脉血二氧化碳分压 |
| ABC法 | 抗生物素蛋白-生物素酶复合物法 | GFP | 绿色荧光蛋白 | PaO2 | 动脉血氧分压 |
| ACh | 乙酰胆碱 | GSH | 谷胱甘肽 | PBS | 磷酸盐缓冲液 |
| AIDS | 获得性免疫缺陷综合征 | HAV | 甲型肝炎病毒 | PCR | 聚合酶链反应 |
| ALT | 丙氨酸转氨酶 | Hb | 血红蛋白 | PI3K | 磷脂酰肌醇3激酶 |
| AngII | 血管紧张素II | HBV | 乙型肝炎病毒 | PLT | 血小板 |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | HCG | 人绒毛膜促性腺激素 | PT | 凝血酶原时间 |
| AST | 天冬氨酸转氨酶 | HCV | 丙型肝炎病毒 | PVDF | 聚偏二氟乙烯膜 |
| ATP | 三磷酸腺苷 | HDL-C | 高密度脂蛋白胆固醇 | PET/CT | 正电子发射计算机体层显像仪 |
| bFGF | 碱性成纤维细胞转化生长因子 | HE | 苏木精-伊红染色 | RBC | 红细胞 |
| BMI | 体重指数 | HGF | 肝细胞生长因子 | RNA | 核糖核酸 |
| BP | 血压 | HIV | 人类免疫缺陷病毒 | ROS | 活性氧 |
| BSA | 牛血清白蛋白 | HR | 心率 | real-time PCR | 实时聚合酶链反应 |
| BUN | 尿素氮 | HRP | 辣根过氧化物酶 | real-time RT-PCR | 实时反转录聚合酶链反应 |
| CCr | 内生肌酐清除率 | HSP | 热休克蛋白 | RT-PCR | 反转录聚合酶链反应 |
| CCK-8 | 细胞计数试剂盒-8 | HPF | 高倍视野 | SABC法 | 链霉抗生物素蛋白-生物素酶复合物法 |
| COX-2 | 环氧化酶-2 | IC50 | 半数抑制浓度 | SDS-PAGE | 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 |
| Cr | 肌酐 | ICU | 重症监护病房 | SCr | 血肌酐 |
| CRP | C反应蛋白 | IFN | 干扰素 | SO2 | 血氧饱和度 |
| CT | 计算机体层摄影 | IL | 白细胞介素 | SOD | 超氧化物歧化酶 |
| CV | 变异系数 | iNOS | 诱导型一氧化氮合酶 | SP法 | 标记的链霉抗生物素蛋白-生物素法 |
| DAB | 二氨基联苯胺 | IPG | 固相pH梯度 | SPF | 无特定病原体 |
| ddH2O | 双蒸水 | JNK | 氨基末端激酶 | STAT3 | 信号转导和转录激活因子3 |
| DMEM | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | LDL-C | 低密度脂蛋白胆固醇 | Tbil | 总胆红素 |
| DMSO | 二甲基亚砜 | LPS | 内毒素/脂多糖 | TBST | Tris-盐酸洗膜缓冲液 |
| DNA | 脱氧核糖核酸 | MAP | 平均动脉压 | TC | 总胆固醇 |
| ECG | 心电图 | MAPK | 丝裂原活化蛋白激酶 | TG | 三酰甘油 |
| ECL | 增强化学发光法 | MDA | 丙二醛 | TGF | 转化生长因子 |
| ECM | 细胞外基质 | MMP | 基质金属蛋白酶 | Th | 辅助性T细胞 |
| EDTA | 乙二胺四乙酸 | MRI | 磁共振成像 | TLRs | Toll样受体 |
| EEG | 脑电图 | mTOR | 雷帕霉素靶蛋白 | TNF | 肿瘤坏死因子 |
| EGF | 表皮生长因子 | MTT | 四甲基偶氮唑盐微量酶反应 | TUNEL | 原位末端标记法 |
| ELISA | 酶联免疫吸附测定 | NADPH | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | VEGF | 血管内皮生长因子 |
| eNOS | 内皮型一氧化氮合酶 | NF-κB | 核因子-κB | VLDL-C | 极低密度脂蛋白胆固醇 |
| ERK | 细胞外调节蛋白激酶 | NK细胞 | 自然杀伤细胞 | vWF | 血管性血友病因子 |
| ESR | 红细胞沉降率 | NO | 一氧化氮 | WBC | 白细胞 |
| FBS | 胎牛血清 | NOS | 一氧化氮合酶 | WHO | 世界卫生组织 |