Abstract
目的
通过检测弹力蛋白原(tropoelastin)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点表达、tropoelastin mRNA和弹性蛋白与弹力纤维水平，探讨tropoelastin基因SNPs与主动脉夹层(aortic dissection，AD)的关系。
方法
留取96例AD患者(AD组)和95例对照组患者的外周血和主动脉组织标本，提取外周血DNA，应用MassARRAY技术进行tropoelastin基因SNPs检测，并构建单体型；采用real-time PCR和蛋白质印迹法分别检测主动脉中膜层tropoelastin mRNA和弹性蛋白的表达；采用EVG(Elastin Van Gieson)染色观察主动脉管形态和壁弹力纤维的分布。比较tropoelastin基因各SNPs位点基因型和单体型在两组间频率的分布，以及tropoelastin mRNA、弹性蛋白和弹力纤维在两组中表达的差异。
结果
两组共检测tropoelastin基因SNPs位点7个，5个位点呈多态性，其中rs2071307(G/A)、rs34945509(C/T)和rs17855988(G/C)位点频率分布在两组之间差异均有统计学意义(均P<0.05)。3个SNP位点[rs2071307(G/A)、rs34945509(C/T)和rs17855988(G/C)]的单体型频率分布，在两组之间差异均有统计学意义(均P<0.01)。Real-time PCR和蛋白质印迹法结果显示AD组主动脉中膜层tropoelastin mRNA和弹性蛋白的表达量均显著低于对照组(均P<0.05)。EVG染色可见AD组主动脉中膜层撕裂，弹力纤维破碎、断裂，且排列不规则；而对照组主动脉中膜层结构完整、层次分明，弹力纤维排列紧密、有序。
结论
Tropoelastin基因rs2071307(G/A)、rs34945509(C/T)、rs17855988(G/C)位点的多态性改变可能最终会影响弹力纤维的合成，并有可能在AD的发生中起重要作用。
Keywords: 弹力蛋白原基因, 主动脉夹层, 单核苷酸多态性, 单体型, 弹性蛋白
Abstract
Objective
To evaluate the relation between single nucleotide polymorphisms (SNPs) of tropoelastin gene and aortic dissection (AD) via identifying SNPs in the tropoelastin gene, and to detect the level of tropoelastin mRNA, elastin and elastic fibers.
Methods
The specimens of the AD group (n=96) and the control group (n=95), including their blood and aortic wall tissues, were collected. DNA was extracted from the blood samples in the 2 groups, and the SNPs in the tropoelastin gene were examined by the MassARRAY genotyping technique, and their haplotypes were constructed by PHASE software. The expression of tropoelastin mRNA and elastin in the aortic tunica media was respectively detected by real-time PCR or Western blotting. Elastin Van Gieson (EVG) staining was used to observe the shape of aortic tunica media and clarify the distribution of elastic fibers. The frequency of genotypes and haplotypes of SNP loci in the tropoelastin gene was analyzed and compared between the 2 groups, and the expression of tropoelastin mRNA, elastin and elastic fibers were also compared.
Results
Seven SNP loci of the tropoelastin gene were detected in these samples. Among them, 5 SNP loci were polymorphic. The frequency of 3 SNP loci[rs2071307 (G/A), rs34945509 (C/T) and rs17855988 (G/C)] was significantly different between the AD group and the control group (all P<0.05). There were significantly different in the haplotypes frequency of rs2071307 (G/A), rs34945509 (C/T) and rs17855988 (G/C) between the 2 groups (all P<0.01). Real-time PCR and Western blotting showed that the relative expression of tropoelastin mRNA and elastin in the aortic tunica media in the AD group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). EVG staining showed that the aortic tunica media was torn, the morphology and structure of elastic fibers were broken, cracked, and disordered in the AD group, while the aortic tunica media was in complete structure and well arrangement.The elastic fibers were presented closely and orderly in the control group.
Conclusion
The polymorphisms of rs2071307 (G/A), rs34945509 (C/T), and rs17855988(G/C) in the tropoelastin gene may eventually affect the synthesis of elastic fibers and they may play an important role in the occurrence of AD.
Keywords: tropoelastin gene, aortic dissection, single nucleotide polymorphisms, haplotype, elastin
主动脉夹层(aortic dissection，AD)是一种致死率极高的心血管突发疾病，发病率逐年上升[1]。主动脉属弹性大动脉，其中膜层是维持主动脉弹性和承载动脉壁搏动性应力的关键结构，主要结构成分是弹力纤维和胶原纤维组成的细胞外基质[2-3]。弹性蛋白原(tropoelastin)是弹力纤维的主要结构成分，其初合成时为水溶性弹性蛋白原单体[4]。关于tropoelastin基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与AD的关系国内外未见报道，本研究旨在探讨两者之间的关系。
1. 材料与方法
1.1. 材料
1.1.1. 主要试剂
DNA 抽提试剂盒(血液)购于北京康为世纪公司生物科技公司；SpectroCHIP II-G384等购于美国Agena Bioscience公司；PrimeScript反转录试剂盒购于日本TAKARA公司；SYBR Premix Ex Taq II试剂盒购于美国Applied Biosystem公司；考马斯亮蓝法(Bradford)蛋白质定量试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG、鼠抗人β-actin单克隆抗体、兔抗人弹性蛋白多克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司；ECL-PLUS试剂盒购于美国Amersham公司；EVG(Elastin Van Gieson)染液购于珠海贝索生物技术有限公司。
1.1.2. 引物
采用在线软件Assay Design Suite v 2.0(Agena)设计7个待测SNPs位点分型的单碱基延伸引物和PCR扩增引物(包括正向和反向)。采用Primer-BLAST网页资料设计tropoelastin基因和内参GAPDH特异性引物各1对。引物均由上海吉凯生物技术公司合成。因论文篇幅太长，未附上引物的碱基。
1.1.3. 标本来源及分组
实验组(AD组)主动脉组织标本来自诊断明确并在术中证实的AD患者[5]。排除标准：合并Marfan综合征、Loeys-Dietz综合征、Ehlers-Danlos综合征等结缔组织疾病，妊娠、外伤或医源性因素引起的AD患者；大动脉炎、主动脉瓣二瓣畸形及有明显动脉粥样硬化的AD患者；以及合并家族性动脉瘤等家族遗传病史的AD患者。AD组96例，其中男69例，女27例，年龄36.0~60.0(51.5±6.9)岁，对照组标本取自同期本院冠状动脉旁路术中的升主动脉打孔标本，部分主动脉标本于脑死亡患者脏器捐献时采集，并排除肉眼可见合并明显的主动脉疾病。对照组95例，其中男65例，女30例，年龄35.0~60.0(48.3±7.0)岁。两组年龄及性别差异无统计学意义，具有可比性(t=0.628，χ2=0.042，均P>0.05)。实验标本采集前均签署知情同意书，研究方案获海南省人民医院(以下简称本院)伦理委员会批准。
1.2. 方法
1.2.1. 样本采集
AD组主动脉组织标本于2016年6月至2017年12月间在本院或阜外医院术中采集，靠近夹层破口处取材，切取后立即冲洗，保留内、中、外膜三层结构，修剪成形(表面积约为1 cm×1 cm)。拟提取RNA的标本先用RNAfixer溶液浸泡，置液氮中过夜后转至-80 ℃冰箱保存；拟EVG染色的组织标本先用10%中性甲醛固定。
对照组处理方法同AD组，其中有25例标本来自脑死亡患者。同时，每例均留取外周血4 mL(EDTA抗凝)。
1.2.2. 标签SNPs的确定
应用国际人类基因组单体型图计划(International HapMap Project，HapMap)和dbSNP数据库中公布的tropoelastin基因SNPs数据，结合1000 Genomes Project数据库确定单体型标签SNPs(haplotype-tagging SNP，htSNP)。
通过对各htSNP分析以及后续研究的需要，选择rs41526244(G/A)、rs2071307(G/A)、rs34945509(C/T)、rs17855988(G/C)、rs41511151(G/A)、rs2239691(C/T)、rs34208922(-/A)共7个SNP位点(表1)进行检测。其中，rs41526244(G/A)、rs2071307(G/A)、rs34945509(C/T)、rs17855988(G/C)、rs41511151(G/A)位于外显子，rs2239691(C/T)位于内含子，rs34208922(-/A)位于3'-非翻译区(untranslated regions，3'-UTR)。
表1.
7个SNPs位点相关信息
Table 1 Information about 7 SNPs loci
| SNP位点 | 位置 | 低频等位基因 | 低频等位基因频率 | 区域 |
|---|---|---|---|---|
| rs41526244(G/A) | Chr＊7:74051926 | A | 0.003 | Exon12 Val298Ile |
| rs2071307(G/A) | Chr7:74056384 | A | 0.326 | Exon 16 Gly422Ser |
| rs34945509(C/T) | Chr7:74057670 | T | 0.004 | Exon 20 Lys492Arg |
| rs17855988(G/C) | Chr7:74060492 | C | 0.071 | Exon 26 Gly581Arg |
| rs41511151(G/A) | Chr7:74068657 | A | 0.003 | Exon 34 Gly711Asp |
| rs2239691(C/T) | Chr7:74054839 | T | 0.298 | Intron 19 |
| rs34208922(-/A) | Chr7:74069201 | A | 0.302 | 3'-UTR |
Chr*表示染色体。
1.2.3. 应用MassARRAY技术对tropoelastin基因各SNPs进行基因分型
1.2.3.1. 外周血DNA的抽提、纯化与质控
根据DNA抽提试剂盒(血液)操作流程，提取外周血DNA。取2 μL抽提纯化后的DNA经Nanodrop 2000仪检测，质检合格的DNA样本方可进行后续研究。
1.2.3.2. PCR扩增反应
将引物干粉按顺序排列，添加1×Tris-EDTA缓冲液，稀释PCR引物，配制至终浓度为0.5 μmol/L的PCR引物混合液。
采用多重PCR技术进行PCR扩增，在384孔板中配置PCR反应体系，每孔加入1 μL DNA模板，每个反应体系总体积为5 μL。反应池中PCR引物混合物包含上述7个SNPs位点的正向和反向PCR扩增引物。
将384孔板置于PCR仪中，启动PCR反应，反应条件：95 ℃ 2 min，44个循环(95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s)，72 ℃ 5 min，最后于4 ℃保存。
1.2.3.3. PCR产物碱性磷酸酶处理
PCR反应结束，为降解体系中未消耗的游离三磷酸碱基脱氧核苷酸(deoxyribonucleoside triphos-phated，dNTPs)，将PCR产物用产物碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)处理。配制SAP反应液。取出PCR反应后的384孔板，每一个孔加入 2 µL SAP反应液。将384孔板置于PCR仪中，反应条件：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。
1.2.3.4. 多重SNPs位点单碱基延伸反应
添加1×Tris-EDTA缓冲液，稀释延伸引物的体积浓度至500 μmol/L。根据平板每孔中延伸引物的分子量，加入不同体积的500 μmol/L延伸引物。在384孔板中配制2 µL iPLEX延伸反应液。反应孔包含多个SNPs位点的延伸引物，在延伸反应中，每个延伸引物仅延伸1个碱基。根据SNPs位点的序列差异，延伸其对应的碱基。将384孔板置于PCR仪中，进行单碱基延伸反应，反应条件：94 ℃ 30 s，40个循环[94 ℃ 5 s，5个循环(52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s)]，最后，72 ℃ 3 min。
1.2.3.5. 树脂脱盐纯化
将洁净树脂铺平在384孔/6 mg的平板上，风干。在样本板的每个有延伸产物的孔里加入16 μL ddH2O。将干燥后的6 mg洁净树脂加入延伸产物反应板中，封膜，放在旋转器上颠倒摇匀15 min。将样本板和树脂板一起以3 200 g速度离心5 min，使树脂沉入孔底。
1.2.3.6. 芯片点样、质谱检测及分析
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将经树脂纯化后的延伸产物点样到覆有基质的384孔SpectroCHIP芯片阵列中。将点样后的SpectroCHIP芯片使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技术[6]进行分析。用MassARRAY Typer 4.0软件解读质谱检测的分子量峰，并转化为SNPs位点对应的分子量质谱峰图。比较并分析tropoelastin基因上述7个SNPs位点基因型在两组间的分布。
1.2.4. Real-time PCR检测主动脉中膜层tropoelastin mRNA的表达
按试剂盒操作流程提取冻存主动脉标本的中膜层RNA，加焦磷酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水充分溶解，于-80 ℃保存。取RNA 1 μL，加入99 μL DEPC水稀释，记录Nanodrop 2000仪检测RNA样品在波长260和280 nm时的光密度值(optical density，OD)以定量分析RNA，合格的RNA进入下一步实验。
按TAKARA反转录试剂盒操作说明，在冰上配置mRNA反转录反应体系，置于PCR仪，37 ℃ 15 min，之后85 ℃ 5 s，最后4 ℃保存。合成的cDNA置于 -20 ℃以下保存。
以上所得cDNA，以GAPDH为内参，采用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒配置PCR反应体系，在ABI 7300 real-time PCR仪上进行扩增反应，对tropoelastin mRNA表达量进行相对定量分析。扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s；60 ℃退火31 s；72 ℃延伸31 s，共40个循环，最后72 ℃ 10 min。收集扩增各循环荧光信号，绘制扩增和溶解曲线，检测样本的Ct值，采用2-ΔΔCt法进行数据处理和分析。
1.2.5. 蛋白质印迹法检测主动脉中膜层弹性蛋白的表达
取冻存主动脉中膜层组织经冰上研磨、匀浆、裂解，离心(12 000 r/min，15 min)后收集含蛋白上清液。Bradford法测定总蛋白质浓度。蛋白质样品与5×上样缓冲液1꞉4配比后与蛋白质标志物在100 ℃水浴5 min后上样。经SDS-PAGE电泳分离，电转至PVDF膜，常温封闭、漂洗。分别加入兔抗人弹性蛋白多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，次日洗膜后加入二抗(HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG)，ECL显色，于暗室曝光显示条带。各条带显影图像使用Gel-Pro analyzer 4.0软件进行灰度定量分析，以目的蛋白质(elastin)/内参β-actin灰度积分比值代表弹性蛋白的相对表达量。
1.2.6. EVG染色观察主动脉中膜层弹力纤维的形态
主动脉组织标本用10%中性甲醛固定，沿管壁横断面取材。石蜡包埋切片，脱蜡至水；滴加0.5%高锰酸钾溶液氧化，水洗；滴加2%草酸漂白，水洗；95%乙醇稍洗，浸Weigert氏雷锁辛品液，置室温1~2 h；95%乙醇分化至背景清晰，水洗；Van Gieson染液对比染色，95%乙醇快速分化，水洗；无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。染色结果判断：弹力纤维呈蓝黑色、细胞核呈蓝色、胶原纤维呈红色。在每张玻片显示的中膜层选择5个视野，采用Image-Pro Plus 6.0软件对每个视野进行累积光密度(integrated optical density，IOD)分析，通过IOD值可大致判定每个视野中蓝黑色区域及深浅程度的相对累积值。比较两组主动脉中膜层弹力纤维形态和表达。
1.3. 统计学处理
采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。AD组与对照组基因型和单体型的频率分布采用χ 2检验。应用二元logistic回归分析tropoelastin基因SNPs基因型和单体型与AD发生的关系。符合正态分布计量资料采用均数±标准差( ±s)表示，两组间差异比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结 果
2.1. Tropoelastin基因各SNPs的基因分型结果
AD组共96例，其中4例提取DNA质检不合格；对照组共95例，其中5例提取DNA不合格，两组其余标本均提取到足够的DNA。
2.1.1. SNPs位点基因分型
对合格样本进行SNPs位点基因分型，SNPs位点为高频等位基因样本的质谱峰图(图1)。
图1.
MassARRAY技术检测SNPs位点的代表性质谱峰图
Figure 1 Typical mass spectrum of SNPs loci by MassARRAY
2.1.2. 基因分型结果
AD组92例和对照组90例样本的7个SNPs位点均成功检测，检测结果显示：rs41526244(G/A)、rs41511151(G/A)位点基因型表现为单态性；另外5个位点呈多态性，其中rs2071307(G/A)、rs34945509(C/T)、rs17855988(G/C)位于外显子。
AD组rs2071307(G/A)位点GG、GA和AA基因型的频率分别为44.6%、27.2%和28.3%，A等位基因的频率为41.8%；对照组rs2071307(G/A)位点GG、GA和AA基因型的频率分别为65.6%、26.7%和7.8%，A等位的频率为21.1%(表2)。AD组rs2071307(G/A)位点GA+AA基因型频率显著高于对照组(χ2=8.10，P<0.01)。通过二元logistic回归分析发现rs2071307(G/A)位点基因型GA+AA个体AD的患病风险显著增加[GA：OR=1.56，95% CI：1.24~2.05，P<0.01；AA：OR=1.94，95% CI：1.36~2.87，P<0.01；参考等位基因(reference，Ref)为GG]，呈等位基因A剂量依存性。
表2.
两组tropoelastin基因rs2071307(G/A)、rs34945509(C/T)、rs17855988(G/C)位点基因型频率分布的比较
Table 2 Comparison of SNPs loci [rs2071307 (G/A), rs34945509 (C/T) and rs17855988 (G/C)] of tropouelastin gene frequency in the 2 groups
| SNP位点 | 基因型 | AD组/[例(%)] | 对照组/[例(%)] | χ2 | P |
|---|---|---|---|---|---|
| rs2071307(G/A) | GG | 41(44.6) | 59(65.6) | 14.180 | 0.001 |
| GA | 25(27.2) | 24(26.7) | |||
| AA | 26(28.3) | 7(7.8) | |||
| G等位频率 | 107(58.2) | 142(78.9) | 18.104 | 0.000 | |
| A等位频率 | 77(41.8) | 38(21.1) | |||
| rs34945509(C/T) | CC | 63(68.5) | 77(85.6) | 7.665 | 0.022 |
| CT | 20(21.7) | 8(8.9) | |||
| TT | 9(9.8) | 5(5.6) | |||
| C等位频率 | 146(79.3) | 162(90.0) | 7.931 | 0.005 | |
| T等位频率 | 38(20.7) | 18(10.0) | |||
| rs17855988(G/C) | GG | 68(73.9) | 78(86.7) | 4.742 | 0.093 |
| GC | 19(20.7) | 10(11.1) | |||
| CC | 5(5.4) | 2(2.2) | |||
| G等位频率 | 155(84.2) | 166(92.2) | 6.405 | 0.011 | |
| C等位频率 | 29(15.8) | 13(7.8) |
AD组rs34945509(C/T)位点CC、CT和TT基因型的频率分别为68.5%、21.7%和9.8%，T等位基因的频率为20.7%；对照组rs34945509(C/T)位点CC、CT和TT基因型的频率分别为85.6%、8.9%和5.6%，T等位基因的频率为10.0%(表2)。AD组rs34945509(C/T)位点CT+TT基因型频率显著高于对照组(χ2=7.47，P<0.01)。二元logistic回归分析显示rs34945509(C/T)位点TT基因型个体AD的患病可能性显著增加(TT，OR=1.84，95% CI：1.29~3.73，P<0.01；CT，OR=0.94，95% CI：0.69~1.33，P>0.05；Ref为CC)。
AD组rs17855988(G/C)位点GG、GC和CC基因型的频率分别为73.9%、20.7%和5.4%，C等位基因的频率为15.8%；对照组rs17855988(G/C)位点GG、GC和CC基因型的频率分别为86.7%、11.1%和2.2%，C等位基因的频率为7.8%(表2)。虽然AD组rs17855988(G/C)位点GC+CC基因型频率显著高于对照组(χ2=4.66，P<0.05)，但二元logistic回归分析显示：rs17855988(G/C)位点GC+CC基因型与个体AD患病风险并无显著相关(GC，OR=1.07，95% CI：0.81~1.42，P>0.05；CC，OR=0.94，95% CI：0.71~1.29，P>0.05；Ref为GG)。
rs2239691(C/T)位点低频等位基因T的频率在AD组和对照组分别为31.5%和30.6%，rs34208922(-/A)位点低频率等位基因A的频率在两组分别为25.0%和27.2%。两组比较，该2个SNP位点等位基因频率在两组间分布差异均无统计学意义(χ2 值分别为0.040、0.233，均P>0.05)。
通过PHASE 2.1软件对tropoelastin基因rs2071307(G/A)、rs34945509(C/T)和rs17855988(G/C)3个SNP位点进行单体型构建，本组标本共表现出G-C-G，G-T-G，G-T-C，A-C-G，A-C-C，A-T-C，A-T-G共7种单体型。Tropoelastin基因单体型频率分布在两组间差异有统计学意义(表3)。其中，AD组与对照组单体型A-T-C分别占12.5%和2.8%，分布频率差异有统计学意义(χ2=12.112，P<0.01)，回归分析提示单体型A-T-C与AD发生呈正相关(OR=2.01，95% CI：1.16~3.98，P<0.01；Ref为G-C-G)。
表3.
AD组和对照组tropoelastin基因单体型频率分布的比较
Table 3 Frequency of haplotypes of tropoelastin gene in the AD group and the control group
| 单体型(rs2071307-rs34945509-rs17855988) |
AD组/ [例(%)] |
对照组/[例(%)] | χ2 | P |
|---|---|---|---|---|
| G-C-G | 101(54.9) | 132(73.3) | 23.562 | 0.001 |
| G-T-G | 3(1.6) | 5(2.8) | ||
| G-T-C | 3(1.6) | 5(2.8) | ||
| A-C-G | 42(22.8) | 26(14.4) | ||
| A-C-C | 3(1.6) | 4(2.2) | ||
| A-T-G | 9(4.9) | 3(1.7) | ||
| A-T-C | 23(12.5) | 5(2.8) |
2.2. 主动脉中膜层tropoelastin mRNA的表达
AD组和对照组各随机抽取15例标本，Nanodrop 2000仪检测两组各样本所提取RNA的浓度及纯度，结果显示：两组待检样本所提取的RNA的浓度、纯度、总量以及完整性都达到real-time PCR检测的要求。
引物溶解曲线呈单峰分布(图2)，显示扩增产物中无非特异性产物形成，扩增的结果较为准确。AD组主动脉中膜层组织tropoelastin mRNA的相对表达量为(4.03±0.25)×10-4，显著低于对照组的(5.85±0.28)×10-4，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。
图2.
Real-time PCR反应的扩增曲线与溶解曲线
Figure 2 Amplification curve and dissolution curve of real-time PCR
A: Amplification curve; B: Dissolution curve.
图3.
AD组和对照组主动脉中膜层tropoelastin mRNA相对表达的比较
Figure 3 Comparison of relative expression of tropoelastin mRNA in the aortic tunica media in the AD group and the control group
2.3. 主动脉中膜层弹性蛋白的表达
两组各抽取15例主动脉组织标本，提取总蛋白。蛋白质印迹法结果显示：AD组主动脉中膜层弹性蛋白的相对表达量(0.33±0.06)明显低于对照组(1.12±0.18)，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。
图4.
AD组和对照组主动脉中膜层弹性蛋白相对表达的比较
Figure 4 Comparison of relative expression of elastin in the aortic tunica media in the AD group and the control group A: Relative expression of elastin by Western blotting. The values below the lane respresents the ratio of elastin/β-actin in the 4 samples in the AD group and the control group. B: Histogram of relative expression of elastin.
2.4. EVG染色观察弹力纤维的形态
AD组见主动脉中膜层撕裂，中膜层主动脉平滑肌细胞(aorticr smooth muscle cell，ASMC)明显减少，部分区域成片消失，弹力纤维破碎、断裂、排列不规则，弹力层断裂、毁损，中膜外层及外膜层胶原纤维增生；对照组见中膜层结构完整、层次分明，ASMC排列整齐，弹力纤维排列紧密有序(图5)。AD组IOD值(85 762.8±123.6)显著低于对照组(164 482.8±183.6)，差异有统计学意义(P<0.01)。
图5.
AD组和对照组主动脉管壁EVG染色
Figure 5 EVG staining for aortic wall in the AD group and the control group
A: Control group (×20); B: AD group (×20); C: Control group (×40); D: AD group (×40).
3. 讨 论
AD是一类由多种病因所导致的复杂主动脉疾病，中膜层退行性变、结缔组织病、先天性畸形、妊娠、外伤及医源性因素等均可能造成主动脉管壁结构和功能的改变而诱发AD[7-8]。遗传性疾病，如Marfan综合征患者有原纤维蛋白1(fibrillin 1，FBN1)基因突变导致糖蛋白fibrillin-1缺陷，Ehlers-Danlos综合征患者则有编码Ⅲ型胶原的COL3A1基因突变，都导致了主动脉壁机械强度的减弱，发生AD。但是，大部分散发的AD患者并没有上述明确综合征，是否存在主动脉壁结构和性质的改变以及何种因素导致该改变，有待深入研究。本研究比较tropoelastin基因7个SNPs位点基因型频率在AD组与对照组间的差异，以及tropoelastin mRNA、弹性蛋白和弹力纤维表达在两组间的差异，探讨tropoelastin基因SNPs在AD的病因和发病机制中的作用。
SNPs是人类基因组中最常见的遗传变异形式[9]。本研究检测AD组和对照组标本tropoelastin基因的7个SNPs位点，结果显示：除rs41526244(G/A)和rs41511151(G/A)位点基因型表现为单态性之外，另外5个SNPs位点呈多态性，其中rs2071307(G/A)位于Exon-16，可伴有弹性蛋白第422位的氨基酸改变(甘氨酸Gly→丝氨酸Ser)；rs34945509(C/T)位于Exon-20，可伴有弹性蛋白第492位的氨基酸改变(赖氨酸Lys→精氨酸Arg)；rs17855988(G/C)位于Exon-26，可伴有弹性蛋白第581位的氨基酸改变(甘氨酸Gly→精氨酸Arg)，而rs2239691(C/T)位于Intron-19，rs34208922(-/A)位于3'-UTR，该两处位点的碱基变异不会直接改变其氨基酸表达，但有可能通过影响基因表达的调控而发挥其功能。
两组标本各SNPs位点基因型分析显示：rs2071307(G/A)位点基因型GA+AA个体AD的患病风险显著增加，呈等位基因A剂量依存性，rs34945509(C/T)位点TT基因型个体AD的患病显著增加，而rs17855988(G/C)位点多态性与个体AD的患病风险无相关性。
单体型是决定基因的功能单位和人群遗传变异的内在特征[10]。对tropoelastin基因外显子区域rs2071307(G/A)、rs34945509(C/T)、rs17855988(G/C)3个SNP位点行单体型构建，以研究不同单体型在两组间频率的分布，结果显示tropoelastin基因单体型频率分布在两组间有显著性差别；回归分析提示单体型A-T-C与AD的发生呈正相关。
检测tropoelastin mRNA的表达，并比较其在两组间的差异，并与SNPs位点基因型信息进行关联性研究，有助于进一步评价tropoelastin基因SNP位点多态性与AD发生的关系。实验结果显示AD组主动脉中膜层tropoelastin mRNA的表达显著低于对照组，提示AD组和对照组间tropoelastin基因SNPs位点的碱基差异可能影响tropoelastin mRNA表达，进而影响弹性蛋白和弹力纤维的合成，最终导致AD。在分析各SNPs位点与tropoelastin mRNA表达的关联性时，因为采集标本数偏少，rs34945509(C/T)、rs17855988(G/C)2个位点的部分基因型和单体型只有几例，故期待更大的标本量以继续这项工作。
弹性蛋白原是弹力纤维无定型核心的主要结构成分，主要由中膜层血管平滑肌细胞合成与分泌[11]。弹性蛋白表达下降可导致多种弹力纤维相关疾病，如慢性阻塞性肺疾病、遗传性皮肤松弛症、家族性颅内动脉瘤和蛛网膜下腔出血、盆腔器官脱垂等[12-13]。作者通过蛋白质印迹法检测主动脉中膜层弹性蛋白的表达，结果显示AD组弹性蛋白的表达量明显低于对照组，提示弹性蛋白表达的降低有可能通过改变主动脉管壁的力学特性，破坏管壁的机械强度，从而导致AD[14]。
弹力纤维是维持主动脉管壁结构和功能最主要的结构成分[15-16]，占其干重30%以上。主动脉管壁组织病理显示AD患者主动脉管壁中弹力纤维广泛断裂、毁损，胶原纤维也大量断裂及无序增生，纤维结构紊乱，同时伴ASMC大量凋亡，血管壁结构病理性重构[14]。任何导致主动脉中膜层弹力纤维损害的因素，都有可能破坏主动脉管壁力学特性和机械强度，承受血流张力和剪切力的能力下降，从而导致AD。通过EVG染色观察主动脉管壁的纤维结构，显示AD组主动脉中膜层撕裂，弹力纤维破碎、断裂、排列不规则，弹力层断裂，弹力层间相互连接减少；中膜外层及外膜层胶原纤维增生。这些病理改变可破坏主动脉管壁纤维成分和结构的完整性，从而影响管壁机械强度。
根据上述实验结果可以推知：Tropoelastin基因SNPs位点的多态性改变可能导致其mRNA表达改变，影响主动脉中膜层弹性蛋白的表达，进而干扰弹力纤维的合成，导致主动脉中膜层薄弱，从而破坏主动脉管壁机械强度，使承受血流张力和剪切力的能力下降，故有可能在AD发生中起重要作用。
基金资助
海南省自然科学基金(813205)；海南省社会发展科技专项(2015SF04)。
This work was supported by the Natural Science Foundation of Hainan Province (813205) and the Special Fund of Science and Technology for Social Development in Hainan (2015SF04), China.
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202105458.pdf
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