Abstract
目的
表皮葡萄球菌是院内感染常见的革兰氏阳性球菌之一，它亦黏附于医疗器械表面导致生物膜相关感染。本研究拟探讨两种人工合成的抗菌肽GH12和SAAP-148对表皮葡萄球菌浮游菌生长及其生物膜的影响。
方法
通过微量肉汤稀释法检测抗菌肽GH12和SAAP-148的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度；利用生物膜成膜能力阳性标准菌株在微孔板中构建生物膜，分别检测这两种抗菌肽对表皮葡萄球菌生物膜的抑制和分散作用；在盖玻片上构建表皮葡萄球菌生物膜，通过荧光染料SYTO9染色和激光共聚焦显微镜观察，检测两种抗菌肽对表皮葡萄球菌生物膜三维结构的破坏作用；通过流式细胞仪检测抗菌肽对表皮葡萄球菌细胞膜的破坏作用；采用实时反转录聚合酶链反应分析表皮葡萄球菌黏附相关基因icaA和icaD的表达情况。
结果
GH12和SAAP-148对表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为8和16 μg/mL，最低杀菌浓度均为64 μg/mL；GH12和SAAP-148的质量浓度分别为8 μg/mL(t=7.193，P<0.05)和16 μg/mL(t=7.808，P<0.05)时均可显著抑制表皮葡萄球菌RP62A生物膜的形成，且均呈现出一定的剂量依赖性；GH12和SAAP-148的质量浓度分别为16 μg/mL(t=5.369，P<0.05)和32 μg/mL(t=4.474，P<0.05)时可显著分散RP62A已形成的生物膜，亦呈现剂量依赖性；通过激光共聚焦显微镜观察，GH12和SAAP-148可显著破坏生物膜的三维结构，使生物膜的总量显著减少；流式细胞仪检测发现最低抑菌浓度的GH12和SAAP-148还能显著破坏表皮葡萄球菌的细胞膜；1×最低抑菌浓度的抗菌肽能够显著抑制表皮葡萄球菌黏附相关基因icaA和icaD的表达。
结论
抗菌肽GH12和SAAP-148通过破坏细胞膜对表皮葡萄球菌浮游菌生长具有显著的抑制作用，并能通过抑制黏附相关基因抑制和分散其生物膜。
Keywords: 抗菌肽, 表皮葡萄球菌, 生物膜, GH12, SAAP-148, 细胞膜
Abstract
Objective
Staphylococcus epidermidis is one of the most common Gram-positive cocci in nosocomial infection, which could adhere to the surface of medical apparatus and causes biofilm-related infections. In the present study, we aim to explore the antimicrobial effects of GH12 and SAAP-148 against Staphylococcus epidermidis.
Methods
Micro-dilution methods were used to detect the minimal inhibitory/bactericidal concentration of peptides on Staphylococcus epidermidis. Biofilm formation positive type strain was used to determine the antibiofilm effects of the peptides. Biofilms were built on the cover slides and fluorescent dye SYTO9 and laser confocal microscope were used to observe the effects of peptides on the three-dimensional structure of Staphylococcus epidermidis biofilms. The cell membrane permeability of Staphylococcus epidermidis was detected by flow cytometry. Expressions of icaA and icaDgenes were analyzed by real-time reverse transcription PCR.
Results
The minimal inhibitory concentrations of GH12 and SAAP-148 against Staphylococcus epidermidis were 8 and 16 μg/mL, respectively, and the minimal bactericidal concentration was 64 μg/mL. GH12 and SAAP-148 significantly inhibited the biofilm formation of Staphylococcus epidermidis at the concentration of 8 μg/mL (t=7.193, P<0.05) and 16 μg/mL (t=7.808, P<0.05), respectively. Similarly, the GH12 and SAAP-148 significantly eradicated the pre-formed biofilms at the concentration of 16 μg/mL (t=5.369, P<0.05) and 32 μg/mL (t=4.474, P<0.05) in a dose-response manner, respectively. Meanwhile, the two peptides broke the structure of biofims and reduce the total biomass. GH12 and SAAP-148 at the concentration of minimal inhibitory concentration significantly disrupted the cell membrane of Staphylococcus epidermidis. The expressions of icaA and icaDgenes were significantly inhibited by antimicrobial peptides at the 1×minimal inhibitory concentration.
Conclusion
GH12 and SAAP-148 show significantly antimicrobial and anti-biofilm effects against Staphylococcus epidermidis by disruption of cell membrane and inhibition of icaAand icaDgene expression.
Keywords: antimicrobial peptide, Staphylococcus epidermidis, biofilm, GH12, SAAP-148, cell membrane
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是一种常见的凝固酶阴性革兰氏阳性球菌，通常是一种无害的共生细菌，在人类皮肤及黏膜表面大量存在[1]。表皮葡萄球菌也可黏附于医疗器械或植入物表面，在现代医学治疗领域，随着各种植入医疗器械的频繁使用，表皮葡萄球菌已成为重要的条件致病菌。表皮葡萄球菌易形成生物膜，增加细菌对抗生素的耐药性，并导致持续性感染，迁延不愈，是院内血流感染的常见病因[2]。表皮葡萄球菌生物膜主要由菌体和其分泌的胞外基质构成，其胞外基质主要包括胞外多糖、胞外DNA和胞外蛋白质。表皮葡萄球菌生物膜的形成周期主要包括初始黏附期、生物膜形成初期、生物膜成熟期和生物膜分散期。在生理状态下，生物膜的形成和分散主要由群体密度感应系统和第二信使环鸟苷二磷酸进行调控[3]。细菌一旦形成生物膜，其耐药性将极大增加，常规抗生素常难以彻底根除体内的生物膜[4]。因此，寻找具有良好抗生物膜作用的新型抗菌药物已成为当下研究的热点。
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)包括天然AMPs和合成AMPs，具有抑制微生物生长和生物膜形成的作用，且能将已经形成的生物膜清除。近年来，人工合成的AMPs对微生物的抑菌作用受到广泛关注[5]。GH12和SAAP-148为两种人工合成的AMPs，二者对表皮葡萄球菌及其生物膜的影响未明，故本研究探讨二者对表皮葡萄球菌浮游菌生长及其生物膜的作用。
1. 材料与方法
1.1. 菌株来源及培养条件
表皮葡萄球菌生物膜成膜能力阳性标准菌株RP62A和成膜能力阴性标准菌株ATCC12228由中南大学湘雅三医院检验科提供。菌种置牛奶培养基中于-80 ℃冰箱保存，使用前接种于血琼脂平板，传代2次以使其性状稳定。
1.2. 主要仪器和试剂
ELX800酶标仪购自美国Bio-Tek公司；麦氏比浊仪购自法国梅里埃公司；96孔板、6孔板和离心管均购自美国Corning/Costar公司；激光共聚焦显微镜购自日本日立公司；流式细胞仪购自美国BD公司；胰酪胨大豆肉汤培养基(Trypticase Soy Broth，TSB)和水解酪蛋白胨(Mueller-Hinton，MH)肉汤培养基均购自上海索莱宝生物科技有限公司；PCR扩增系统购自德国Eppendorf公司；GH12(序列：Gly-Leu-Leu-Trp-His-Leu-Leu-His-His-Leu-Leu-His-NH2)和SAAP-148(序列：Leu-Lys-Arg-Val-Trp-Lys-Arg-Val-Phe-Lys-Leu-Leu-Lys-Arg-Tyr-Trp-Arg-Gln-Leu-Lys-Lys-Pro-Val-Arg-NH2)购自上海昕浩生物科技有限公司；结晶紫染液购自上海碧云天生物技术有限公司；SYTO9荧光染料购自美国赛默飞世尔科技公司；RNA提取试剂盒(E.Z.N.A.®Total DNA/RNA/Protein Kit II)购自美国Omiga公司；反转录试剂盒(TransScript All in-One First Strand cDNA Synthesis SuperMix)和实时聚合酶链反应试剂盒(SuperMix UDG)购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司。
1.3. 方法
1.3.1. 药敏试验
药敏试验参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100-S28文件制订的方法进行，即挑取血平板上单个菌落用麦氏比浊仪调至0.5麦氏浊度(McFarland，McF浊度)后，用MH肉汤稀释20倍备用。AMPs(GH12和SAAP-148)用MH肉汤做倍比稀释后，于96孔板中各加入50 μL/孔，各孔再分别加入50 μL备用的细菌悬浊液。于湿盒中在37 ℃下静置孵育16~20 h后判断结果。最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)即为肉眼可见的抑制细菌增殖的最低AMPs浓度。从MIC开始至最高设置浓度，分别吸取10 μL各孔上清至血平板上，过夜培养后判断AMPs的最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)，即杀灭99.99%细菌所需的最低AMPs浓度[6]。
1.3.2. 生物膜抑制试验
挑取血平板上新鲜培养的RP62A单个菌落于TSB肉汤中，于37 ℃以200 r/min过夜摇菌培养后，用新鲜的TSB肉汤稀释至约2×106菌落形成单位(colony forming unit，CFU)/mL备用。用TSB肉汤将AMPs做倍比稀释后，于96孔板中各加入50 μL含药培养基，再分别加入50 μL备用菌悬液，使菌终浓度约为1×106 CFU/mL。将此96孔板置湿盒中于37 ℃下静置孵育24 h后，用无菌生理盐水轻洗3次去除未与孔壁结合的浮游菌，再分别加入100 μL质量分数0.25%为结晶紫溶液。静置染色15 min后，弃去结晶紫，用生理盐水轻洗3次去除未与生物膜结合的结晶紫染液。置室温下晾干后，每孔再分别加入100 μL无水乙醇，静置30 min以溶解与生物膜结合的结晶紫，于酶标仪检测570 nm处的吸光度值，即为生物膜的相对总量[7]。
1.3.3. 生物膜清除试验
将表皮葡萄球菌RP62A过夜摇菌，用新鲜的TSB肉汤稀释至约1×106 CFU/mL，于96孔板中各加入100 μL菌悬液，置于湿盒中在37 ℃下静置孵育24 h构建生物膜，用无菌生理盐水轻洗3次去除未与孔壁结合的浮游菌。用TSB肉汤将AMPs倍比稀释，分别向各孔加入100 μL含药培养基，置湿盒中于37 ℃下继续静置孵育24 h。用无菌生理盐水轻洗3次去除未与孔壁结合的浮游菌后，加入结晶紫染液进行染色，其具体操作步骤同1.3.2[8]。
1.3.4. 激光共聚焦显微镜下观察生物膜
将表皮葡萄球菌RP62A过夜摇菌后用TSB肉汤调节至约1×106 CFU/mL，于6孔板中各孔加入2 mL此菌悬液，再向各孔中分别加入无菌盖玻片。置湿盒中于37 ℃静置孵育24 h后，用无菌生理盐水轻洗去除浮游菌，各孔再分别加入2 mL含有AMPs的TSB肉汤使GH12和SAAP-148的终浓度分别为16和32 μg/mL。于37 ℃继续静置孵育24 h后，去除浮游菌，各孔再分别加入1 mL含有0.1% SYTO9的染液，于黑暗处在室温下静置孵育15 min后，用生理盐水去除未与细菌结合的染料，并用激光共聚焦显微镜观察生物膜的结构[9]。
1.3.5. 流式细胞仪检测AMPs对细胞膜的影响
将表皮葡萄球菌RP62A摇菌至对数生长期，以3 000 g离心15 min后取沉淀物，再用1×PBS漂洗3次后取沉淀物。用PBS配置不同浓度的AMPs，并将细菌悬浊液调节至0.5 McF，于37 ℃静置孵育1 h。加入对细胞膜完整性敏感的荧光染料SYTOX(终浓度为1 μmol/L)避光孵育15 min，用流式细胞仪对荧光强度进行检测[10]。
1.3.6. 实时反转录聚合酶链反应分析表皮葡萄球菌黏附相关基因icaA和icaD的RNA表达情况
1.3.6.1. RNA的提取及反转录
将表皮葡萄球菌分别用MH肉汤、含1×MIC的GH12(8 μg/mL)和SAAP-148(16 μg/mL)的MH肉汤以200 r/min于37 ℃培养16 h后，采用RNA提取试剂盒提取RNA。检测RNA的纯度和浓度，采用反转录试剂盒进行反转录，所有操作均按照试剂盒说明书进行。
1.3.6.2. 实时荧光PCR
反应体系为20 μL：模板2 μL，上、下游引物各0.4 μL，SuperMix UDG 10 μL和无酶双蒸水7.2 μL。扩增条件为：50 ℃ 2 min；94 ℃ 10 min；94 ℃ 50 s，60 ℃ 30 s，40个循环。相对表达量用2-ΔΔCt表示(Ct为循环阈值，ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔΔCt=实验组目的基因ΔCt值-对照组目的基因ΔCt值)。并使用熔解曲线判断引物的特异性。所用引物(表1)均由上海生工生物工程有限公司设计与合成。实验重复3次，取均值。
表1.
表皮葡萄球菌黏附相关基因引物
Table 1 Prime of Staphylococcus epidermidis adhesion related genes
| 引物 | 序列(5'—3') |
|---|---|
| icaA-forward | AACAAGTTGAAGGCATCTCC |
| icaA-reverse | GATGCTTGTTTGATTCCCT |
| icaD-forward | ATCGTTGTGATGATTGTTTA |
| icaD-reverse | GATATGTCACGACCTTTCTT |
| 16S rRNA-forward | TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA |
| 16S rRNA-reverse | GGTTTCGCTGCCCTTTGTATTGT |
1.4. 统计学处理
采用GraphPad 8.0统计学软件进行分析，计量资料用均数±标准差( ±s)表示，多组比较采用方差分析，两组比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结 果
2.1. AMPs对表皮葡萄球菌浮游菌的抗菌活性
GH12对表皮葡萄球菌RP62A和ATCC12228的MIC为8 μg/mL，MBC为64 μg/mL；SAAP-148对表皮葡萄球菌RP62A和ATCC12228的MIC和MBC分别为16 μg/mL和64 μg/mL。
2.2. AMPs抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成
当GH12的质量浓度为8 μg/mL时可显著抑制表皮葡萄球菌RP62A生物膜的形成(t=7.193，P<0.05)，且随着GH12质量浓度增高，其抑制能力显著增强。同时，抗菌肽SAAP-148在质量浓度为16 μg/mL时亦可显著抑制RP62A生物膜的形成(t=7.808，P<0.05)，也存在剂量依赖性，即随着SAAP-148的质量浓度增高，其抑制能力显著增强(图1)。
图1.
抗菌肽对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用
Figure 1 Biofilm inhibitory effects of antimicrobial peptides against Staphylococcus epidermidis
A: GH12; B: SAAP-148. *P<0.05 vs Control.
2.3. AMPs能有效清除表皮葡萄球菌已形成的生物膜
GH12在16 μg/mL时可显著分散RP62A已形成24 h的生物膜(t=5.369，P<0.05)，而SAAP-148在 32 μg/mL时亦可显著分散其生物膜(t=4.474，P<0.05)，且随着AMPs浓度的增加，其分散作用显著增强(图2)。同时，通过SYTO9荧光染色和激光共聚焦显微镜观察，我们发现与未经AMPs处理的对照组相比较，16 μg/mL的GH12和32 μg/mL的SAAP-148可显著分散RP62A已形成的生物膜，显著破坏生物膜的三维结构，且显著减少生物膜总量(图3)。
图2.
抗菌肽清除表皮葡萄球菌已形成的生物膜
Figure 2 Biofilm eradication effects of antimicrobial peptides against Staphylococcus epidermidis
A: GH12; B: SAAP-148. *P<0.05 vs Control.
图3.
在激光共聚焦显微镜下抗菌肽对表皮葡萄球菌生物膜的清除作用(×400)
Figure 3 Biofilm eradication by antimicrobial peptides under confocal laser scanning microscope (×400)
2.4. AMPs显著破坏表皮葡萄球菌细胞膜
流式细胞仪检测结果显示：AMPs可显著增加细菌细胞膜的通透性，使荧光染料的峰值显著右移(图4)。
图4.
流式细胞仪检测抗菌肽对葡萄球菌细胞膜的破坏作用
Figure 4 Flow cytometry showing disruption of Staphylococcus epidermidis cell membrane by antimicrobial peptides
Effects of SAAP-148 (A) and GH12 (B) on cell membrane disruption against RP62A at 1×minimal inhibitory concentration.
2.5. AMPs能显著抑制表皮葡萄球菌黏附相关基因的表达
实时反转录聚合酶链反应结果显示：8 μg/mL的GH12和16 μg/mL的SAAP-148能够抑制表皮葡萄球菌黏附相关基因icaA和icaD的表达，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，图5)。
图5.
抗菌肽对表皮葡萄球菌黏附基因表达的抑制作用
Figure 5 Inhibitive effects of antimicrobial peptides on adherent related gene experession of Staphylococcus epidermidis
*P<0.05 vs Control.
3. 讨 论
表皮葡萄球菌通过特异的黏附分子附着于宿主的组织表面，能够与人建立终生的共栖关系，这种共栖关系在生命早期就已开始。随着人工关节、骨折固定装置、中心静脉导管、脑脊液分流、心内装置、人工心脏瓣膜和血管移植物等植入医疗器械的大量应用，表皮葡萄球菌附着并累积在设备表面，细菌不断繁殖，同时产生一系列具有保护作用的表面聚合物和胞外酶。这些分子形成细胞外基质，将生物膜内的细菌结合在一起，形成生物膜。葡萄球菌的生物膜基质可能主要由b-1-6连接的n-乙酰氨基葡萄糖聚合物、细胞间黏附素依赖性生物膜或蛋白质的细胞间黏附素独立性生物膜组成[10]。另外，表皮葡萄球菌还可分泌酚溶性调制素(phenol-soluble modulin，PSM)家族的强溶细胞物质，溶解白细胞和红细胞，最终导致更具侵袭性的表皮葡萄球菌病[11]。生活在生物膜中的细菌对抗生素的敏感性比浮游生物或单个培养菌落同类细菌低得多，而生物膜中的细菌菌的代谢产物能刺激产生新的耐药性突变。存活的耐药菌在某些条件下，可以随生物膜脱落游离出来，在机体其他部位附着、定植并形成新的感染灶，致使感染反复迁延，增加了治愈的难度[12]。
AMPs是人类固有免疫的重要组成部分。迄今为止，许多天然或合成的AMPs对细菌的作用已被揭示，如LL-37、KSL、L-K6、mPE、magainin 2、MUC7 20-mer、LFb 17-30和Bac8c等[13]。然而，天然的AMPs显示出几个缺点：体积大、难以纯化、细胞毒性高及药代动力学差等。因此，一些人工合成的AMPs应运而生，扩展了AMPs的范畴[14]。GH12是一种新合成的AMP，能有效地抑制龋齿变形链球菌生物膜的形成，并能穿透生物膜基质杀死生物膜内的细菌[13]。GH12能够抑制链球菌的各种毒力因子，导致产酸性降低、酸性受损、细胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPS)合成降低、生物膜形成能力缺陷、酶和转录水平的应激反应和环境适应减弱[14]。SAAP-148被认为是一种非常具有应用前景的人工合成的AMP，对浮游及生物膜内的耐药细菌有极强的抑制作用。在体外人烧伤创面模型和小鼠皮肤模型中，SAAP-148能够有效地根除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)。但是在切除创口的大鼠模型中，SAAP-148对MRSA无效[15]。
在本研究中，GH12和SAAP-148对表皮葡萄球菌标准菌株RP62A和ATCC12228浮游菌都呈现出显著的抗菌活性，与SAAP-148相比，GH12有更低的MIC，抗菌效果更好。GH12和SAAP-148抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，且存在剂量依赖性，即随着药物浓度增高，其抑制能力显著增强。浮游菌的生长以及生物膜形成在体内是一个相辅相成、共同促进的有机进程。在本研究中，GH12和SAAP-148均在MIC时体现出生物膜形成的减少，这可能与AMPs在抑制细菌生长的同时，也抑制生物膜的形成有关，其对哪个方面的抑制作用更强，我们将在今后的工作中进一步研究。另外，GH12和SAAP-148能够显著分散RP62A已形成24 h的生物膜，且随着AMPs浓度的增加，其分散作用显著增强。通过SYTO9荧光染色和激光共聚焦显微镜观察，GH12和SAAP-148可显著分散RP62A已形成的生物膜，显著破坏生物膜的三维结构，且显著减少生物膜总量。
AMPs抑制表皮葡萄球菌的生物膜形成的机制尚不明确。本研究通过流式细胞仪检测，发现AMPs可显著增加细菌细胞膜的通透性，破坏葡萄球菌的细胞膜。此外，由于黏附相关基因的表达水平与生物膜的形成能力密切相关，故黏附相关基因表达水平越高，细菌形成生物膜的能力越强。本研究通过分析表皮葡萄球菌黏附相关基因的RNA表达情况，发现AMPs能够显著抑制表皮葡萄球菌黏附相关基因icaA和icaD的表达。因此，我们推测，AMPs可能是通过抑制表皮葡萄球菌黏附相关基因的表达，影响表皮葡萄球菌的黏附功能，进而阻碍生物膜的形成。以上两点可能是AMPs抑制表皮葡萄球菌的生物膜形成的重要机制。
近年来，抗生素耐药问题日益严重，解决抗生素耐药问题对临床用药至关重要。寻找抗生素的替代物或者与抗生素联用的药物是目前研究的热点。AMPs能够绕过微生物的抗性诱导机制，减少耐药性的产生，有效抑制细菌。另外，AMPs与抗生素联用或与靶向序列融合能减少抗生素的耐药性，提高抗菌效果[16]。本研究发现GH12和SAAP-148这两种人工合成的AMPs能够显著抑制表皮葡萄球菌浮游菌的生长，同时抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，显著分散已形成的生物膜，使其生物膜的三维结构显著破坏，同时破坏葡萄球菌的细胞膜，是两种非常有应用前景的AMPs。
基金资助
长沙市科技计划项目(kq1907012)。
This work was supported by the Science and Technology Project of Changsha, China (kq1907012).
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202105481.pdf
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