化学治疗预处理小鼠骨髓移植早期免疫细胞的增殖动力学

Abstract

Objective

To establish mouse bone marrow transplantation by pretreatment with chemotherapy, and to explore the dynamic changes of immune cells in the early stage of allogeneic transplantation in the spleen of mice.

Methods

Mice were divided into 4 groups (80 mg/kg group, 100 mg/kg group, 120 mg/kg group, and 150 mg/kg group) according to the difference in dose of busulfan. The mice were treated with busulfan and cyclophosphamide combined chemotherapy, and the appropriate dosage was determined by evaluating the myeloablative effect and drug toxicity. According to the type of the genetic transplantation, the mice were also divided into 4 groups: An allogeneic transplantation group, a homogenic transplantation group, a chemotherapy alone group, and a normal control group. The mice were pretreated with busulfan and cyclophosphamide before bone marrow transplantation. In the allogeneic transplantation group, the suspension of splenocytes was prepared at the first day, the 3rd day, the 5th day, and the 8th day after transplantation for flow cytometry detection, and the dynamic changes of splenic immune cells were analyzed. The homogeneic transplantation group served as the concurrent control, the normal control group served as the control of basic value of spleen immune cells, and the chemotherapy alone group was used to evaluate the myeloablative effect.

Results

1) The optimal dose of busulfan was 100 mg/kg. The combination of busulfan and cyclophosphamide can restore the hematopoiesis of transplanted mice, and the toxicity associated with pretreatment is small. 2) In the allogeneic transplantation group: The hematopoietic reconstitution and high donor chimerism rate were achieved after transplantation. In the early phase of bone marrow transplantation, the T lymphocytes were the main cell group, while the recovery of B lymphocytes was relatively delayed. The dendritic cells and natural killer cells from donors were the earliest cells to recover and achieve high chimerism rate compared with T cells and B cells. Most T cells were in the initial T cell state within 5 days after allogeneic transplantation. However, in the 5th day after transplantation, these cells were mainly in the effective memory phenotype. The reconstruction of donor-derived naive T cells was slow, but the reconstruction of donor-derived effective memory T cells and regulatory T cells was relatively fast. 3) In the homogeneic transplantation group: The mice could recover hematopoiesis and the recovery of B lymphocytes was delayed. 4) In the chemotherapy alone group: All mice died in 12-15 days after chemotherapy, and the peripheral blood routine showed pancytopenia before death.

Conclusion

Pretreatment with chemotherapy can successfully establish the mouse model of bone marrow transplantation. There are difference in the proportion of T cells, B cells, natural killer cells, dendritic cells, effector memory T cells, initial T cells, and regulatory T cells after transplantation, and the relationship between donor and recipient is also changed.

造血干细胞移植是恶性血液疾病、重症骨髓衰竭性疾病及先天性遗传代谢病等最有效的根治方法^[1]，其主要是通过经典的放射治疗和化学治疗(以下简称化疗)方式预先清除患者体内的肿瘤细胞，腾出骨髓龛位，为干细胞的植入创造条件，预处理后通过输注新的骨髓或者外周干细胞，使患者重建新的造血和免疫系统，从而治愈患者疾病或者阻抑疾病的进展。1980年代初，单倍体相合造血干细胞移植治疗恶性血液病的探索，为造血干细胞移植事业开启了新的征程，在北京大学血液病研究所的“北京模式”的推动下，使造血干细胞移植真正进入了“人人都有供者”的时代^[2]。在治疗疾病的过程中，移植相关的感染、排斥及复发仍然困扰着部分患者^[3-5]。

美国约翰·霍普金斯大学医学院的Kanakry教授等^[6-7]在移植后早期采用大剂量环磷酰胺选择性去除同种反应性T细胞诱导免疫耐受的方法(简称后置环磷酰胺移植模式)进行单倍体相合造血干细胞移植在治疗恶性血液病方面取得了不错的疗效，与“北京模式”相比，医疗费用和慢性排斥率均较低。早在1963年，Berenbaum等^[8]就发现接受异基因皮肤移植的小鼠在移植后的第1~3天使用环磷酰胺可以明显延长皮肤的存活时间。Mayumi等^[9]在日本九州大学建立了一种诱导免疫耐受的方案，该方案认为在静脉输注异基因脾细胞后的第2~3天使用环磷酰胺可以成功诱导免疫耐受。以上均说明，在移植的早期(1周内)对移植过程进行合适的干预(给予大剂量的环磷酰胺)可以诱导免疫耐受，减少并发症的发生。

目前，在异基因造血干细胞移植的早期供受双方免疫细胞是如何进行增殖变化，以及这种变化又对移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)和免疫重建有何影响，报道甚少。因此，本研究基于化疗药物预处理的小鼠骨髓移植模型，通过对次级淋巴组织(脾)免疫细胞进行分析，观察移植早期的免疫细胞动态变化，为造血干细胞移植诱导免疫耐受及治疗移植相关并发症提供研究基础。

1. 材料与方法

1.1. 试剂和仪器

RPMI 1640培养基和磷酸缓冲液(PBS)购自美国Hyclone公司；红细胞裂解液和流式细胞分析抗体(CD3/CD8/CD19/CD49b/CD11c/CD11b/H2KB/CD4/CD44/CD62/CD25/CD127/H2KD)购自美国BD Bio-sciences公司；吸入用七氟烷购自深圳市瑞沃德生物科技有限公司；恩氟沙星购自美国MP Biomedicals公司；40 μm尼龙细胞筛网购自美国BD Falcon公司；白消安注射液由浙江大冢制药有限公司生产、分装；环磷酰胺注射液购自江苏盛迪医药有限公司；流式细胞仪购自美国BD Facs Calibur公司；血常规检测所使用的血球计数仪购自美国Thermo Fisher公司。

1.2. 实验动物的饲养

实验小鼠选用BALB/C和C57BL/6两种品系，无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级别，雄性，日龄为45~50 d，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。委托中南大学实验动物学部SPF级动物房进行饲养，由人工照明系统模拟昼夜环境。小鼠饮用水和饲料经高温、高压或反射性同位素⁶⁰Co辐照灭菌、消毒，移植受鼠在化疗开始时便开始饮用添加恩氟沙星(0.1 mL/L)的灭菌水，持续至实验结束。

1.3. 预处理方案的计划与实施

在本实验中，作者尝试改进骨髓移植小鼠模型的预处理方式，采用临床常用的白消安和环磷酰胺联合化疗方案进行预处理，化疗周期为6 d(白消安给药4 d，环磷酰胺给药2 d)。环磷酰胺总剂量200 mg/kg被认为是免疫抑制最为合适的剂量^[10]，在本实验中继续沿用。为了探索白消安的合适清髓剂量，实验按白消安给药剂量的不同，选用59只8~10周龄C57BL/6品系小鼠，按白消安剂量80，100，120和150 mg/kg梯度分为4组进行实验，每组14~15只。化疗前记录小鼠体重，将白消安总剂量平分为4 d用量，将环磷酰胺总剂量平分为2 d用量，每日均按化疗前体重换算具体给药剂量，给药方式为腹腔给药，给药容量按0.2 mL/10 g计算，最大不超过0.6 mL。根据小鼠体重变化和病死率判断预处理毒性和强度，确定最合适剂量。

确定最合适预处理剂量后，按基因移植类型将小鼠分为4组：1)异基因移植组。25只C57BL/6品系小鼠作为移植受鼠进行预处理，并在预处理后接受骨髓和脾细胞，20只BALB/C品系小鼠作为移植供鼠提供骨髓和脾细胞。2)同基因移植组。20只C57BL/6品系小鼠作为移植受鼠进行预处理，并在预处理后接受骨髓和脾细胞，20只C57BL/6品系小鼠作为移植供鼠提供骨髓和脾细胞。3)单纯化疗组。10只C57BL/6小鼠进行单纯化疗，化疗后不进行移植。4)正常对照组。3只正常C57BL/6品系小鼠不进行任何预处理和移植。

1.4. 骨髓移植

1.4.1. 制备骨髓和脾悬浮细胞

将同基因和异基因移植组中作为移植供鼠的C57BL/6或BALB/C品系小鼠快速断颈处死，经75%乙醇浸泡消毒，固定在手术操作台上。使用眼科剪剪开小鼠腹部和下肢皮肤，取出脾并分离得到双侧股骨和胫骨。使用研磨棒研磨脾，用RPMI 1640培养基重悬稀释。双侧股骨和胫骨用装有RPMI 1640培养基的注射器从两干骺端小心进行冲洗，冲出骨髓，冲净后骨髓腔应呈白色。研磨得到的脾细胞悬液和骨髓均经过40 μm细胞筛网过滤，采用红细胞裂解液去除红细胞。

1.4.2. 输注骨髓和脾细胞

将异基因移植组25只C57BL/6受鼠和同异基因移植组中20只C57BL/6受鼠分笼编号后，逐个用七氟烷进行吸入麻醉，捏紧并牵扯颈部皮肤，暴露眼球，持1 mL注射器，沿内眦小心扎入，触及骨面后缓慢推注细胞悬液。异基因移植组每只受鼠输注骨髓细胞1×10⁷个，脾细胞3×10⁷个(骨髓和脾细胞取自BALB/C品系小鼠)，同基因移植组每只受鼠输注同样的细胞量(骨髓和脾细胞取自C57BL/6品系小鼠)，总容量均为300 μL^[10]。单纯化疗组输注同等容量的生理盐水。

1.4.3. 小鼠移植效果的评估方法

同基因和异基因移植组在移植后第30天，采集受鼠EDTA抗凝外周血进行血常规检测，异基因移植组同时进行流式嵌合率分析以评估预处理强度及移植后血象恢复情况，判断植入是否成功。单纯化疗组进行状态观察，濒死前采集EDTA抗凝外周血进行血常规检测。

1.5. 流式细胞仪检测细胞表面抗原

同基因和异基因移植组受鼠分批、分次在骨髓移植后第1天、第3天、第5天、第8天解剖取脾，正常小鼠组取脾进行基础对照。脾经研磨过滤后制备单细胞悬液，使用红细胞裂解液去除红细胞，用PBS稀释重悬，使每100 μL体积含10⁶~10⁷个细胞，将100 μL细胞悬液加入流式管中，并添加对应抗体避光，4 ℃孵育30 min，2 mL PBS重悬、清洗、离心(1 000 r/min，5 min)2次后，加入200 μL PBS上机进行流式细胞仪分析。在流式散点图中根据细胞大小和细胞内颗粒数去除红细胞碎片后，设定总细胞群为P1区。检测的免疫细胞包括T辅助细胞、细胞毒T细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、粒细胞、初始T细胞、效应性记忆T细胞和调节T细胞。涉及的白细胞表面抗原为CD3，CD8，CD19，CD49b，CD11c，CD11b，CD4，CD44，CD62，CD25，CD127，H2KB和H2KD。采用BV510，BV421，APC-CY7，APC，PerCP-CY5.5，PE-CY7，FITC和PE共8色荧光通道进行检测，使用Flowjo软件进行数据分析。

1.6. 统计学处理

生存曲线采用乘积极限法，数据统计及图表全部使用GraphPad Prism(版本为7.0a for mac)软件进行绘制。

2. 结 果

2.1. 白消安化疗剂量的确定

白消安80 mg/kg组小鼠在化疗后20 d内病死率为18%，其余小鼠均存活且恢复了造血。白消安 100 mg/kg组小鼠化疗后20 d内病死率为90%，多数小鼠在化疗后12~16 d死亡，最早的死亡时间为化疗后第10 天，死亡前血象均未恢复。白消安120 mg/kg组小鼠化疗后20 d内病死率为100%，但有42%的小鼠在化疗未结束时就发生死亡，其余小鼠均在化疗后12 d内全部死亡。白消安150 mg/kg组的15只小鼠均在化疗过程中发生死亡，病死率为100%，死亡小鼠肠管广泛坏死伴黑色腹腔分泌物，考虑为化疗药物局部浓度过大引起的肠道坏死(图1)。进一步对比白消安100 mg/kg组和120 mg/kg小鼠的体重变化，白消安120 mg/kg组小鼠在化疗期间体重平均减轻20%，体重下降较白消安100 mg/kg组更明显(图2)。因此，认为白消安100 mg/kg为最合适的白消安化疗剂量，该剂量能基本达到清髓和免疫抑制目的，且化疗相关毒性较小。故决定使用白消安100 mg/kg(平分4 d给药)和环磷酰胺200 mg/kg(平分2 d给药)联合化疗方案对实验小鼠进行移植前预处理。

图1.

4个梯度剂量白消安联合120 mg/kg环磷酰胺化疗后各组小鼠的生存曲线

Figure 1 Survival curve of mice in each group after 4 gradient doses of busulfan combined with 120 mg/kg cyclophosphamide chemotherapy

图2.

白消安100和120 mg组小鼠体重变化趋势

Figure 2 Trend of weight changes of mice in the 100 mg/kg busulfan group and the 120 mg/kg busulfan group

2.2. 骨髓移植效果的评估

同基因和异基因移植组小鼠在骨髓移植后均能获得造血重建，异基因移植组小鼠嵌合率均超过90%，单纯化疗组在化疗后的12~15 d全部死亡，死亡前外周血常规均提示为全血细胞减少。

2.3. 正常小鼠脾细胞免疫细胞群所占比例

正常小鼠脾脏免疫细胞主要以B淋巴细胞和T淋巴细胞为主，T辅助细胞的所占比例约为细胞毒T细胞的2.5倍。中性粒细胞所占比例约为16%，初始T细胞所占比例约为10%，树突状细胞所占比例约为5.5%，效应性记忆T细胞、调节T细胞和自然杀伤细胞所占比例均小于5%。正常小鼠脾免疫细胞群占P1区的比例见表1。

表1.

正常小鼠脾细胞各免疫细胞群占P1区(总细胞群)的比例

Table 1 Proportion of spleen immune cells of normal mice in P1 area (total cell group)

正常小鼠脾免疫细胞群	占P1区比例/%	正常小鼠脾免疫细胞群	占P1区比例/%
T辅助细胞	18.67±3.52	T淋巴细胞	33.78±2.31
细胞毒T细胞	7.47±0.65	B淋巴细胞	37.93±1.40
效应性记忆T细胞	3.37±1.19	自然杀伤细胞	3.53±1.41
初始T细胞	10.30±2.01	树突状细胞	5.47±0.03
调节T细胞	1.40±0.28	中性粒细胞	16.15±2.76

2.4. 小鼠脾各免疫细胞在异基因移植组中的变化

在移植后早期，无论是同基因移植组还是异基因移植组，B淋巴细胞总体呈下降趋势，异基因移植组移植第1天的B淋巴细胞比例从28.7%下降至移植后第8天的1.54%(图3)。虽然B淋巴细胞占P1区比值在移植后第8天降至很低水平，但其中75%为供者成分(图4)。而脾T淋巴细胞为主要的免疫细胞成分，在移植后的第1天和第3天所占比例均接近70%(图5)。

图3.

同基因和异基因移植组B淋巴细胞占脾P1区比例的变化趋势

Figure 3 Trend of changes of the percentage of B lymphocytes cells in P1 area in the allogeneic transplantation group and the syngeneic transplantation group

图4.

树突状细胞、自然杀伤细胞和B淋巴细胞在异基因移植组中供受成分的比例变化

Figure 4 Changes of the proportion of donor and recipient components of the dendritic cells, natural killer cells and B lymphocytes cells in the allogeneic transplantation group

A: Dendritic cells; B: Natural killer cells; C: B lymphocytes cells.

图5.

异基因移植组T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞占脾P1区比例的变化趋势

Figure 5 Trend of changes of the percentage of T lymphocyte, B lymphocyte, neutrophil, dendritic cells and natural killer cells in P1 area in the allogeneic transplantation group

A: T lymphocyte cells, B lymphocyte cells, and neutrophil cells; B: Dendritic cells and natural killer cells.

异基因移植组自然杀伤细胞和树突状细胞在脾细胞中所占比例很少。自然杀伤细胞在异基因移植后，其比例呈持续上升趋势，在移植后第8天内，自然杀伤细胞增长了10倍，树突状细胞在异基因移植第3天也开始逐渐恢复，第5天增速加快。自然杀伤细胞和树突状细胞在移植后供者成分均逐渐增多。到移植后第8天，两细胞群体供者成分接近100%(图4A，4B)。

对CD4阳性的初始T细胞、效应性记忆T细胞以及调节性T细胞进行分析，发现在异基因移植组初始T细胞在移植后第5天所占比例开始快速下降，移植后第8天仅占CD4阳性细胞群的10%左右(图6)，此时供者嵌合率不高，大部分仍为受者成分(图7)。而效应性的记忆T细胞却呈现完全相反的趋势，从移植后第5天开始快速上升，到移植后第8天时嵌合接近100%(图6)。调节性T细胞占CD4阳性细胞比例在经历短暂下降后，从移植后第5天开始恢复，第8天占CD4阳性细胞的13%左右(图6)，且几乎完全是供者嵌合(图7)。

图6.

异基因移植组中CD4阳性效应性记忆T细胞、CD4阳性初始T细胞、CD4阳性调节性T细胞占CD4阳性T细胞比例的变化趋势

Figure 6 Change trend of the percentage of CD4 positive effective memory T cells, CD4 positive naïve T cells and CD4 positive regulatory T cells in CD4 positive T cells in the allogeneic transplantation group

图7.

异基因移植组第8天CD4阳性调节性T细胞、CD4阳性初始T细胞和CD4阳性效应性记忆T细胞供受成分比例对比

Figure 7 Proportion of donor and recipient components of CD4 positive regulatory T cells, CD4 positive naïve T cells and CD4 positive effective T cells on the 8th day in the allogeneic transplantation group

3. 讨 论

近30年，为了探索造血干细胞移植相关并发症的发病机制，有研究者^[11-13]已成功建立了多种模式的骨髓移植动物模型，但是绝大部分模型都采用全身放疗方案作为移植前预处理。与之相反，临床已基本抛弃了单纯使用全身放疗进行清髓，更多地使用“单纯化疗”或“化疗+全身放疗”这两种方式进行预处理。鉴于已建立的动物模型并不能很好地模拟临床实践，因而在本研究中，作者采用了临床常用的白消安和环磷酰胺进行移植前预处理，模型鼠均能造血重建并达到高供者嵌合。

作者着重观察了骨髓移植早期各相关免疫细胞的动态变化。国外研究者^[13-14]通过体外荧光示踪已经证实了移植小鼠在输注骨髓和脾细胞之后，淋巴细胞会首先被脾和淋巴结捕获，在各级淋巴结和脾进行活化和扩增，第7天后这些扩增活化的淋巴细胞会由淋巴组织迁移至GVHD的靶器官。本研究采用移植后第1天、第3天、第5天和第8天5个时间点，用同基因移植小鼠进行基础对照，异基因移植小鼠作为实验组，分别取脾细胞进行免疫细胞的流式细胞学分析。

已知GVHD是造血干细胞移植最常见的并发症之一，在GVHD的发病机制中，供体来源的活化T细胞是该病的标志^[15-16]。本实验证实了在异基因移植早期，T淋巴细胞是脾细胞中最主要的细胞群体，占总细胞群体的70%左右，并一直持续到粒系恢复。在GVHD的发病过程中，活化的供者T细胞迁移到靶器官，并通过直接细胞接触或细胞因子介导的毒性诱导损伤^[17]。本研究表明：GVHD早期阶段(5 d内)，大多数T细胞为初始表型。第5天后T细胞开始迁移到组织，表达效应性记忆表型，显示在宿主与供体树突状细胞相互作用时，首先激活初始T细胞，然后转化为能够迁移到靶组织引起损伤并表达效应性记忆表型的同种异体反应性T细胞。异基因移植组在移植后第1天初始T细胞便开始增殖，直到移植后第5天才逐渐下降，其增殖时间较同基因移植组更持久。本研究还发现在异基因移植早期，淋巴细胞在次级淋巴组织的增殖从宿主接受异基因抗原的第1天便已开始，而且增殖一直持续至移植后第5天。

CD4阳性的调节性T细胞作为可以抑制GVHD 发生的一群T细胞^[18]，在异基因移植后的5 d内，其所占比例呈下降趋势，但到移植后第8天，调节性T细胞却占到了CD4阳性细胞的20%，这种变化可能与两方面原因有关：其一为移植后第8天，初始T细胞比例降至极低水平：调节性T细胞占比自然上升；其二为调节性T细胞的确在移植后第8天开始了增殖或恢复。第二方面的原因可能更具有说服力，伴随着初始T细胞比例的下降，效应性的记忆T细胞比例逐渐上升，初始T细胞在移植早期是一个逐渐转变为效应性T细胞的过程，与调节T细胞的上升变化关系不大。

B细胞在整个移植过程中充当了何种角色，目前尚不清楚，但在异基因移植组中，已有几个独立的证据清楚地证实B细胞参与了慢性GVHD的发病过程^[19-21]。对于B细胞的免疫重建，国内外的相关研究^[22-23]均认为这是一群重建相对延迟的细胞群体。本研究显示：不论是同基因移植还是异基因移植，B淋巴细胞所占比例总体呈下降趋势，在异基因移植组中虽然供受关系正逐渐发生转变，但B细胞占总细胞群体的比例仍越来越低。这些结果均提示B淋巴细胞的恢复是延迟的。至少在本研究的观察期内，B细胞并没有造血恢复，且所占比例逐渐减低。

在GVHD早期阶段，供者来源的树突状细胞和自然杀伤细胞是扩增最早和恢复最快的一群细胞^[24]，异基因移植组第3天开始，供者来源的树突状细胞和自然杀伤细胞就开始扩增，而同基因移植组并没有表现出这样的变化趋势，到移植后第8天，树突状细胞和自然杀伤细胞的供者嵌合率已经达到很高的水平。这些结果表明树突状细胞作为一种强效的抗原提呈细胞，可能在激活供体同种异体反应性T细胞方面具有突出的作用，并在GVHD发展中发挥了关键的作用^[24-25]。

此外，本研究进一步发现：初始T细胞在移植后第8天占CD4阳性T细胞的比例很低，且这部分细胞绝大多数仍为受者成分，也就是说供者来源的初始T细胞，在移植早期并没有得到增殖，或者说这群细胞在接触异基因抗原刺激后，细胞表面发生了表型变化，转变为了效应性记忆表型的T细胞。不管如何，在移植后第8天，初始T细胞比例较低，但此时调节性T细胞却逐渐恢复。研究^[26-27]认为：初始CD4阳性T细胞可以诱导致死性的GVHD，未经激活的效应性记忆T细胞却不能诱导严重的GVHD，同时T细胞可以抑制GVHD的发生。本实验中实验小鼠在输注了3×10⁷个脾细胞后并没能诱发严重的GVHD，在免疫细胞层面对此进行解释，作者认为在该移植模式下，供者来源的初始T细胞增殖缓慢或较早地转变为效应性的记忆T细胞，同时供者来源的调节性T细胞的早期恢复等因素都减少了GVHD的发生。

总之，本研究结果表明基于白消安和环磷酰胺联合化疗预处理的小鼠，在输注骨髓细胞后可以恢复造血，达到较高程度供者嵌合，能成功建立骨髓移植或GVHD小鼠模型。同基因和异基因移植组在移植后早期，免疫细胞的动态变化有显著差异。基于对小鼠免疫细胞的相关流式细胞学数据进行分析，获得如下结论：1)异基因骨髓移植早期，T淋巴细胞为主要的细胞群体，而B淋巴细胞恢复相对延迟；2)异基因骨髓移植早期，与T淋巴和B淋巴细胞相比，供者来源的树突状细胞和自然杀伤细胞为最早开始恢复并达较高嵌合率的细胞群体；3)在异基因移植5 d内，大多数T细胞无明显表型，为初始T细胞状态，而在移植后5 d以后(T细胞开始迁移到组织)，这些细胞主要是效应性记忆表型；4)该移植模式下，供者来源的初始T细胞重建缓慢，但供者来源的效应性记忆T细胞和调节T细胞重建相对较快。

基金资助

中南大学湘雅医院临床科研基金(2014L02)。

This work was supported by the Clinical Research Fund of Xiangya Hospital of Central South University (2014L02), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202105449.pdf