Abstract
目的
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)已成为调控基因表达和影响多种生物学过程的关键表观遗传调控因子。在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的发生发展中，lncRNA发挥着重要作用，有关lncRNA在RA患者外周血细胞中的研究已有报道。然而，目前尚无lncRNA在RA患者中对于自噬调控的研究。本研究通过筛选RA滑膜成纤维样细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLSs)自噬前后差异表达的lncRNAs，寻找调节RA-FLSs自噬的关键lncRNAs，旨在为RA的诊断和治疗提供新方向。
方法
获取6例RA患者膝关节或髋关节术后的滑膜组织，原代培养(组织块法)RA-FLSs至第5代，用mTOR抑制剂PP242处理后，通过蛋白质印迹法检测细胞自噬水平标记蛋白LC3-II表达水平的变化。其中3例采用TRIzol提取PP242处理前后RA-FLSs总RNA，应用Agilent Human ceRNA Microarray 2019(4×180 K，Design ID:086188)芯片检测，发现表达量显著改变的lncRNAs(差异倍数≥2.0，P<0.05)。利用生物信息学技术，对获得的差异表达的lncRNAs进行基因本体(gene ontology，GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，以发现差异表达的lncRNAs可能参与的生物学通路，探索差异表达的lncRNAs在RA发病机制中的作用。在前期芯片筛选出的lncRNAs差异表达的基础上，结合GO富集分析和KEGG分析，筛选出ENST00000584721.1、ENST00000615939.1，对全部6例RA-FLSs进行real-time RT-PCR验证。
结果
从患者膝关节或髋关节滑膜组织中成功分离、培养出RA-FLSs。6例RA-FLSs经过PP242处理后，自噬水平标记蛋白LC3-II表达水平升高(P<0.05)，PP242诱导RA-FLSs发生自噬。芯片筛选共有591个差异表达的lncRNAs，其中表达上调的有428个，表达下调的有163个。GO分析显示这些差异表达的lncRNAs与Th17功能、T细胞相关细胞因子生成及TGF-β受体信号通路的负性调节，以及I型TGF-β受体结合和IL-6受体复合物形成等相关。KEGG分析显示自噬通路、TGF-β、TNF-α、IL-17信号通路以及Th17、Th1、Th2、破骨细胞分化通路是富集差异lncRNAs最多的几条信号通路。Real-time RT-PCR验证在RA-FLSs自噬后ENST00000584721.1表达上调(P<0.05)，ENST00000615939.1表达下调(P<0.05)，与芯片结果一致，证实芯片筛选差异基因可靠。GO分析显示ENST00000584721.1、ENST00000615939.1分别与核糖体转运和自噬体组装相关。KEGG分析显示ENST00000584721.1与丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶信号通路相关，ENST00000615939.1与FoxO信号通路相关。
结论
通过基因芯片分析发现了RA-FLSs中差异表达的lncRNAs。在RA中，这些差异表达的lncRNAs参与RA-FLSs自噬的发生过程。生物信息学分析显示其作用机制可能包括调节多种细胞因子(IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-17等)分泌和免疫细胞(Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞、破骨细胞等)分化，调控自噬通路、丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶、FoxO等多种信号通路等。其中在RA-FLSs自噬后ENST00000584721.1表达上调，ENST00000615939.1表达下调，这为后续进一步深入研究lncRNA在RA-FLSs自噬中的作用机制提供了良好的实验基础。
Keywords: 类风湿关节炎, 滑膜成纤维样细胞, 长链非编码RNA, 自噬, 芯片
Abstract
Objective
Long non-coding RNA (lncRNA) has become a key epigenetic regulator that regulates gene expression and affects a variety of biological processes. LncRNA plays an important role in the occurrence and development of rheumatoid arthritis (RA). The study on lncRNA in peripheral blood cells of RA patients has been reported. However, there is no study on autophagy regulation by lncRNA in RA patients. This study aims to provide a new direction for the diagnosis and treatment of RA via screening the changes of lncRNAs in RA fibroblast-like synoviocytes (RA-FLSs) before and after autophagy and finding the key lncRNAs targeting RA-FLSs autophagy.
Methods
Synovial tissues of 6 RA patients after knee and hip joint surgery were obtained, and RA-FLSs were cultured to the 5th generation for further experiments (tissue culture method). After treatment with mTOR inhibitor PP242, the expression of LC3-II was detected by Western blotting. Total RNAs of 3 cases of RA-FLSs before and after treatment with mTOR inhibitor PP242 were extracted by TRIzol and screened by Agilent Human ceRNA Microarray 2019 (4×180 K, design ID: 086188) chip. The lncRNAs with significantly changed expression levels were selected (difference multiple≥2.0, P<0.05). Bioinformatics technology was used to analyze the gene ontology (GO) function and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway of the differentially expressed lncRNAs, and to explore the possible role of differentially expressed lncRNAs in the pathogenesis of RA. Subsequently, ENST00000584721.1 and ENST00000615939.1 were identified in all the 6 samples of RA-FLSs using real-time RT-PCR, which were selected by previous chip screen combined with GO enrichment analysis and KEGG analysis.
Results
RA-FLSs were successfully isolated and cultured from the synovial tissues of the patient's knee or hip joint. After 6 RA-FLSs were treated with PP242, the expression level of autophagy marker protein LC3-II was increased (P<0.05). PP242 induced autophagy in RA-FLSs. LncRNA sequencing analysis showed that a total of 591 lncRNAs were significantly changed, of which 428 were up-regulated and 163 were down-regulated.Go analysis showed that these differentially expressed lncRNAs were associated with negative regulation of Th17 function, T cell related cytokines production, and TGF-β receptor signaling pathway, as well as IL-6 receptor complex formation and type I TGF-β receptor binding. KEGG analysis showed that autophagy pathway, TGF-β, TNF-α, IL-17 signaling pathway, and Th17, Th1, Th2, osteoclast differentiation pathway were the most abundant signal pathways of differentially expressed lncRNAs during autophagy. The expression of ENST00000584721.1 was up-regulated (P<0.05) and the expression ofENST00000615939.1 was down-regulated (P<0.05) in RA-FLSs undergoing autophagy, by using real-time RT-PCR validation which was in consistent with the microarray results. The reliability of microarray screening differential genes was confirmed. GO analysis showed that ENST00000584721.1 and ENST00000615939.1 were related to ribosome transport and autophagy assembly, respectively. KEGG analysis showed that ENST00000584721.1 was related to mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, and ENST00000615939.1 was related to FoxO signaling pathway.
Conclusion
Differentially expressed lncRNAs in RA-FLSs have been identified with microarray analysis. In RA, differential expression of lncRNAs is involved in the autophagy of RA-FLSs. The underlying mechanisms based on bioinformatics analysis include regulating the secretion of cytokines, such as IL-6, TGF-β, TNF-α and IL-17, participating in the immune cell differentiation, such as Th17, Th1, Th2 cells and osteoclasts, as well as regulating the autophagy pathway, MAPK, FoxO, and other signaling pathways. It has been verified that the expression of ENST0000584721.1 is up-regulated and ENST0000615939.1 is down-regulated after autophagy of RA FLSs, which provides a good experimental basis for further study on the mechanism of lncRNA in RA-FLSs autophagy.
Keywords: rheumatoid arthritis, fibroblast-like synoviocytes, long non-coding RNA, autophagy, microarray
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的全身性免疫系统疾病，其特征是进行性的关节软骨和骨受损，最终导致关节畸形、活动受限。RA全球发病率为0.5%~1.0%，女性多于男性[1]。滑膜炎、血管翳形成及软骨和骨损伤为其主要病理改变。RA滑膜成纤维样细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synovioeytes，RA-FLSs)是增生性滑膜和血管翳的主要细胞类型之一，不同于其他疾病，活化的RA-FLSs可诱导新生血管生成，并被促血管生成因子激活，导致软骨被侵袭和破坏以及骨被侵蚀[2]。研究[3]发现在RA患者中FLSs自噬活性是增强的，但目前关于RA-FLSs自噬的调节因素研究相对较少。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类非编码RNA，其长度>200个核苷酸[4]。LncRNA参与自噬调控，通过影响自噬相关基因的表达和自噬相关细胞信号通路发挥调控作用。这些参与自噬调控的lncRNAs在糖尿病心肌病、感染及各种肿瘤的发生发展中发挥重要作用[5-9]。有关lncRNA在RA患者外周血细胞中的研究已有报道，目前尚无lncRNA在RA患者中对于自噬调控的研究。本研究选取6例RA患者的滑膜组织，原代培养RA-FLSs至第5代，用mTOR抑制剂PP242处理后，通过蛋白质印迹法检测细胞自噬水平标记蛋白LC3-II表达水平的变化。其中3例用于lncRNA芯片高通量筛选处理前后差异表达的lncRNAs，并进行基因本体(gene ontology，GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，然后用real-time RT-PCR法对芯片结果进行验证，旨在为进一步探索RA发病机制和治疗靶标提供实验依据。
1. 材料与方法
1.1. 材料
1.1.1. 细胞标本
取6例行膝关节或髋关节置换术后的RA患者滑膜，培养原代FLSs，RA患者均符合2009年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟制定的RA分类诊断标准。本研究经四川省人民医院医学伦理委员会批准[审批号：伦审(研)2021年第18号]。
1.1.2. 主要试剂和仪器
DMEM/F12培养基和0.25%胰蛋白酶为美国Gibco公司产品；PP242为美国Apexbio公司产品；RIPA裂解液(RIPA lysis buffer)、多色预染蛋白 Marker为上海雅酶生物科技有限公司产品；蛋白酶抑制剂(PMSF)为上海碧云天生物技术有限公司产品；LC3B(E7X4S)XP Rabbit mAb 为美国Cell Signaling Technology公司产品；TRIzol为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；HS-GAPDH为加拿大BBI公司产品；lnRcute lncRNA cDNA第1链合成试剂盒和lnRcute lncRNA real-time RT-PCR检测试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品。引物由上海擎科公司协助合成，芯片处理及数据分析由上海欧易生物公司完成。Agilent扫描仪G2505C为美国Agilent Technologies公司产品。
1.2. 方法
1.2.1. RA-FLSs原代培养(组织块法)
用无菌镊子将滑膜组织置于无菌培养皿中，以无菌PBS洗涤3次；用剪刀剔除组织块上脂肪、纤维、骨赘等；将滑膜组织块转移至DMEM/F12培养基中，充分剪碎，成乳糜状，移至无菌离心管中，在4 ℃下，以500 g离心10 min，小心弃上清；加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬滑膜组织，转移至100 mm的培养皿中；置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。适时用0.25%胰蛋白酶消化传代，培养至第5代后用于下一步实验。
1.2.2. RA-FLSs自噬诱导
将RA-FLSs以3×105个/孔接种于平底6孔板，加入完全DMEM/F12培养液(含10%胎牛血清)2.5 mL，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h。分别加入 10 μmol/L PP242培养4 h，用PBS洗涤后收获细胞用于后续实验。
1.2.3. 蛋白质印迹法检测LC3II的表达水平
在每孔细胞中加入200 μL含100 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和 1 mol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)的细胞裂解缓冲液RIPA，吹打细胞进行重悬，超声裂解20~30次，冰上裂解30 min，100 ℃金属浴 5 min，然后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳、转膜，用5%脱脂奶粉封闭，孵育一抗[LC3B(E7X4S)XP Rabbit mAb]，孵育二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG)，显影成像。
1.2.4. 细胞总RNA的提取
按照试剂盒说明书的标准操作流程进行细胞总RNA的提取。采用TRIzol提取PP242处理前后RA-FLSs的总RNA，样品总RNA进行定量和质量分析，合格的RNA用于后续测序实验。
1.2.5. LncRNA表达谱分析
提取PP242处理前后的3例RA患者的FLSs总RNA，利用Agilent Human ceRNA Microarray 2019(4×180 K，Design ID: 086188)芯片检测6个样本，由上海欧易生物公司负责芯片处理。首先，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片杂交，洗脱后利用Agilent 扫描仪 G2505C扫描得到原始图像。通过原始数据扫描图展示每个样本的扫描效果，如扫描是否均匀、有无大块划痕等情况。根据芯片的探针分别重复计算质控点和非质控点的变异系数(coefficient of variation，CV)值，取对应的中位值表示芯片的CV，用于判断不同样本的检测结果的检测体系是否稳定，一般CV值要求低于15%。本次检测结果中平均CV值为5.143 0，最大CV值为7.090 9，芯片实验成功。采用Feature Extraction软件(version10.7.1.1，美国Agilent Technologies公司)处理原始数据，此后再将数据进行分位数(quantile)标准化。在用于比较的每组样本中至少有一组75%的样本标记为Detected的探针留下用于后续分析。结合t检验的P值和处理前后倍数变化值筛选差异基因，即基因上调或者下调的倍数变化值≥2.0且P<0.05。对lncRNA芯片筛选出的差异基因进行GO分析和KEGG分析。
1.2.6. 验证
在前期芯片筛选出lncRNA差异表达的基础上，结合GO分析和KEGG分析，从培养的6例RA患者的FLSs中筛选出ENST00000584721.1、ENST00000615939.1，并进行real-time RT-PCR验证。
根据TRIzol说明书提取PP242处理前后RA-FLSs总RNA，用分光光度计测定RNA的纯度和浓度。采用反转录试剂盒，反转录获得cDNA。反应条件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。然后按照lnRcute lncRNA real-time RT-PCR检测试剂盒说明书进行反应。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 32 s，共40个循环，1个样品重复3次。选用GAPDH作为内参，基因的相对量用2-ΔΔCt进行分析。引物序列见表1。
表1.
Real-time RT-PCR引物序列
Table 1 Primer sequence of real-time RT-PCR
| Genes | Primer sequences (5'-3') | |
|---|---|---|
| ENST00000584721.1 | Forward | CAGGGCCTCAGAAAGCAAGG |
| Reverse | AGTGCAGTGCAGTGAGTGAA | |
| ENST00000615939.1 | Forward | AACCCTCCTAGTGTGGTGGT |
| Reverse | TGCTTGTTTCGAGACAGGGT | |
| GAPDH | Forward | TGGTATCGTGGAAGGACTCA |
| Reverse | GTAGAGGCAGGGATGATGTTC |
1.3. 统计学处理
采用SPSS 19.0统计软件分析数据。所有实验至少重复3次，real-time RT-PCR验证PP242处理前后RA-FLSs差异lncRNAs采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结 果
2.1. PP242诱导RA-FLSs发生自噬
蛋白质印迹法结果显示：6例RA-FLSs经过PP242处理后，自噬水平标记蛋白LC3-II表达水平均升高(P<0.05，图1)。
图1.
PP242处理前后RA-FLSs中LC3-II蛋白表达水平
Figure 1 Expression level of LC3-II protein in RA-FLSs before and after PP242 treatment
1. 3, 5, 7, 9, and 11 were FLSs of patients with RA1, RA2, RA3, RA4, RA5 and RA6 respectively, and were not treated with PP242. 2,4, 6, 8, 10, and 12 were FLSs of patients with RA1, RA2, RA3, RA4, RA5, and RA6, respectively, and were treated with PP242. *P<0.05.
2.2. LncRNA芯片筛选与RA-FLSs自噬相关的候选lncRNA
芯片分析结果显示：在3例患者中，共有591个lncRNAs改变发生了统计学差异，其中428个lncRNAs表达上调，163个lncRNAs表达下调(图2)。
图2.
芯片分析RA-FLSs自噬发生前后差异表达的lncRNAs
Figure 2 Differential expression of lncRNAs in RA-FLSs before and after autophagy by cluster analysis of chip
Red indicates up-regulated lncRNA and blue indicates down-regulated lncRNA.
2.3. LncRNA功能预测
2.3.1. GO分析差异表达的lncRNAs
GO分析显示：Th17功能、T细胞相关细胞因子生成和TGF-β受体信号通路的负性调节，以及IL-6受体复合物形成和I型TGF-β受体结合等是差异表达lncRNAs的重要功能集合。对应GO富集最多lncRNAs的前10条条目见图3。
图3.
差异表达lncRNAs的GO分析前10条条目
Figure 3 Top 10 items of GO analysis for differentially expressed lncRNAs
2.3.2. KEGG分析差异表达的lncRNAs
KEGG分析结果显示：自噬通路、TGF-β、TNF-α、IL-17信号通路以及Th17、Th1、Th2、破骨细胞分化通路是差异表达lncRNAs最多的信号通路。对应KEGG富集最多lncRNAs的前10条条目见图4。
图4.
差异表达lncRNAs的KEGG分析前10条条目
Figure 4 Top 10 items of KEGG analysis for differentially expressed lncRNAs
2.4. 验证差异lncRNAs的表达
结果显示：在PP242处理前后即自噬发生前后，RA-FLSs中ENST00000584721.1的表达量分别为1.185±0.493，3.917±1.021(t=7.798，P=0.000 6；图5A)；ENST00000615939.1的表达量分别为3.418±0.720，1.014±0.240(t=9.773，P=0.000 2；图5B)。结果与芯片结果一致。
图5.
验证芯片候选差异lncRNAs表达情况
Figure 5 Expression of lncRNAs in microarray candidates verified by real-time RT-PCR
A: Change of ENST00000584721.1 expression in RA-FLSs before and after PP242 treatment; B: Change of ENST00000615939.1 expression in RA-FLSs before and after PP242 treatment. *P<0.05.
3. 讨 论
RA是一种常见的全身性自身免疫介导的疾病，可以导致患者残疾、生活无法自理，给患者和家庭造成沉重的负担[10]。IL-6、TNF-α、IL-1β等细胞因子的释放以及免疫细胞信号通路(如NF-κB通路)的调节,被认为与RA的发病机制有关[11]。
FLSs功能改变和侵袭性表型在RA发病中起至关重要的作用[12]。RA-FLSs具有类肿瘤细胞样作用，植入的RA-FLSs能够通过严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠的血液长距离迁移，损伤远离植入部位的关节[13]。研究[14]表明自噬中相关蛋白可能生成能被RA免疫系统识别的瓜氨酸肽。因此，对RA-FLSs自噬的研究有望为RA的防治提供新的靶点。但目前关于RA-FLSs自噬异常的调节机制并不明确。
LncRNA已成为调控基因表达和影响多种生物学过程的关键表观遗传调控因子。在RA的发生发展中，lncRNA发挥重要作用。研究[15-16]表明RA患者滑膜和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)存在包括HOTAIR和H19在内的差异lncRNAs表达。在TNF-α刺激后，外泌体中HOTAIR的高表达可以使巨噬细胞进入靶细胞，HOTAIR在破骨细胞和滑膜细胞中的低水平表达可以诱导MMP2和MMP13的过度表达，从而导致关节受损[15]。此外，在RA和骨关节炎患者的滑膜组织中，H19的表达显著高于健康人或关节外伤患者。H19可能通过正反馈环在调节炎症和促进关节损伤方面发挥作用[16]。Zou等[17]发现lncRNA LERFS在RA中低表达，其通过与异质核糖核蛋白Q(HNRNPQ)的相互作用，负调控FLSs的迁移、侵袭和增殖。RA-FLSs中LERFS的减少可能导致RA滑膜增生，加剧关节受损。
本研究采用经典的mTOR抑制剂PP242成功构建了RA-FLSs的自噬模型。采用基于Agilent平台设计的芯片分析发现：3例RA-FLSs自噬前后均发生了差异表达的lncRNAs有591个，提示有多种lncRNAs参与了RA-FLSs自噬的调控。
对差异表达的lncRNAs进行GO及KEGG分析，在GO分析前10位的基因集中，在生物学过程(biological process，BP)这一类别中，负调控Th17功能以及负调控T细胞相关细胞因子名列其中；而在RA的发病机制中，Th17和T细胞相关细胞因子起重要作用。其中IL-17和TNF-α能刺激IL-6和IL-8等炎性因子的表达，在RA炎症的扩大和持续化中起重要作用[18-23]。在细胞组分(cellular component，CC)这一类别中，lncRNA参与了IL-6受体复合物的形成，而IL-6在RA的发病中也起重要的促炎作用[24]，目前IL-6受体拮抗药已作为治疗RA的重要药物。在分子功能(molecular function，MF)这一类别中，TGF-β受体信号通路及I型TGF-β受体结合也是重要的功能集合。研究[25]表明：TGF-β能够促进滑膜增生，趋化炎症细胞，在血管翳形成和血管新生中发挥重要作用。由此可见，这些差异表达的lncRNAs可能通过多种途径参与RA-FLSs自噬的调控，未来可以通过功能试验进行验证。
KEGG分析的重点是从信号通路角度提供功能预测。在本研究中，自噬通路是差异lncRNAs最多的信号通路之一，这些能直接作用于自噬通路的lncRNAs未来有望成为干预RA-FLSs自噬水平的重要靶标。此外，笔者注意到，与RA发病密切相关的TGF-β、TNF-α、IL-17信号通路以及Th17、Th1、Th2、破骨细胞分化通路均位于前10位，这些细胞因子分泌失衡和免疫细胞的分化异常均直接参与RA的发病。而RA-FLSs自噬前后差异表达的lncRNAs与这些通路相关，提示lncRNAs可能通过调控这些经典炎症因子或免疫细胞功能来参与自噬的发生，这为进一步深入研究RA-FLSs自噬的调控机制提供了研究基础。
本研究根据差异表达lncRNA的荧光强度及GO和KEGG分析，在扩大样本后先行选择了ENST00000584721.1和ENST00000615939.1进行real-time RT-PCR验证。Real-time RT-PCR的结果与芯片结果一致，即RA-FLSs发生自噬后ENST00000584721.1上调，ENST00000615939.1下调，证实了芯片分析的可靠。ENST00000584721.1和ENST00000615939.1的GO分析均属于生物学过程，分别与核糖体转运和自噬体组装相关。KEGG分析显示ENST00000584721.1与丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶信号通路相关，该通路与RA滑膜血管新生相关，可促进血管翳形成，加速RA滑膜及骨质受损。ENST00000615939.1与FoxO信号通路相关，该通路在调节氧化应激、细胞增殖分化以及DNA修复等方面具有重要作用，作为PI3K/AKT下游的三大效应中枢分子之一，FoxO在RA中的作用越来越受到关注。
综上，基因芯片分析发现了RA-FLSs中差异表达的lncRNAs。在RA中，这些差异表达的lncRNAs参与了RA-FLSs自噬的发生过程。生物信息学分析显示其作用机制可能包括调节多种细胞因子(如IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-17等)分泌和免疫细胞(如Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞、破骨细胞等)分化，调控自噬通路、丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶、FoxO等多种信号通路等。其中在RA-FLSs自噬后ENST00000584721.1表达上调，ENST00000615939.1表达下调，这为后续进一步深入研究lncRNA在RA-FLSs自噬中的作用机制提供了良好的实验基础。
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