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. 2021 Oct 28;46(10):1102–1108. [Article in Chinese] doi: 10.11817/j.issn.1672-7347.2021.200843

白藜芦醇通过抑制细胞凋亡和自噬减轻川崎病诱发的心肌损伤

Resveratrol alleviates Kawasaki disease-induced myocardial injury via inhibition of apoptosis and autophagy

XIONG Fengmei 1,2, LIU Ruiping 2, GUO Huanli 1, WU Dongmei 1, SUN Na 3,✉
Editor: 傅 希文
PMCID: PMC10930240  PMID: 34911840

Abstract

Objective

To explore the effect of resveratrol (Res) on Kawasaki disease (KD)-induced myocardial injury and to evaluate its effect on apoptosis and autophagy.

Methods

Forty-eight juvenile male Sprague Dawley rats were randomly divided into a control group, a Res group, a lactobacillus casei cell wall extract (LCWE)-induced Kawasaki disease group (KD group), and a LCWE-induced Kawasaki disease + Res treatment group (Res+KD group). The control group was intraperitoneally injected with saline. The Res group was intraperitoneally injected with resveratrol (100 mg/kg). The KD group was intraperitoneally injected with 0.5 mL LCWE (1 mg/mL). The Res+KD group was intraperitoneally injected with 0.5 mL LCWE (1 mg/mL) and resveratrol (100 mg/kg). After 4 weeks, the left ventricular ejection fraction (LVEF) and short axis shortening rate (LVFS) were detected by echocardiography. The apoptotic rate was detected by terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) staining. The levels of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2-associated X protein (Bax), microtubule-associated protein 1 light chain 3β (LC3B), Beclin-1, autophagy related 5 (Atg5) and sequestosome-1 (p62) were detected by Western blotting. The formation of autophagosome was observed under transmission electron microscope.

Results

There was no significant difference in the above-mentioned indexes between the control group and the Res group (all P>0.05). Compared with the control group, the values of LVEF and LVFS were significantly decreased in the KD group (both P<0.01); the ratio of Bax/Bcl-2 and TUNEL-positive cells were increased (both P<0.01); the LC3BII/LC3BI ratio, the levels of Beclin 1, Atg5 and p62, and the number of autophagosomes were also significantly increased in KD group (all P<0.01). Compared with the KD group, the values of LVEF and LVFS were significantly increased, the ratio of Bax/Bcl-2 and TUNEL-positive cells were decreased, the LC3BII/LC3BI ratio, the levels of Beclin 1, Atg5 and p62 were all decreased (all P<0.01), and the number of autophagosomes was suppressed.

Conclusion

Res can attenuate the KD-induced myocardial injury via inhibiting the apoptosis and autophagy.

Keywords: Kawasaki disease, resveratrol, autophagy, apoptosis

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一种病因不明的急性自限性、发热性疾病，主要发生在5岁以下婴幼儿，表现为全身非特异性中、小动脉血管炎症反应[1-3]。最初发现KD时，并没有注意到KD引起冠状动脉并发症的危害，而KD现在是发达国家儿童获得性心脏病最常见的病因[4-5]。在缺乏病理学检查的情况下，诊断的主要依据在于准确判别KD临床症状的表现，并排除其他已知病因的临床相似疾病。及早开始静脉注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)治疗已将冠状动脉瘤的发生率从25%降低到约5%[6]。而长期预后效果取决于冠状动脉受累程度。部分患者还有形成冠状动脉血栓或冠状动脉狭窄引起的心肌缺血的风险[7]。目前KD诱发心肌损伤的机制并未完全阐明，亟待进一步探讨KD诱发心肌损伤的机制，为临床治疗KD的同时改善心肌损伤提供理论依据。

白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种天然的二苯乙烯类化合物，在葡萄、花生和桑葚等植物中含量丰富，由于其具有明显的抑制炎症、抗衰老、抗癌、抗动脉粥样硬化以及防治心血管疾病等作用，因而受到广泛的关注[8-11]。然而，Res在KD诱发心肌损伤中的作用报道较少，其作用机制也未完全阐明。因此，本研究拟采用雄性幼年Sprague Dawley(SD)大鼠腹腔注射干酪乳酸杆菌胞壁成分(lactobacillus casei cell wall extract，LCWE)制备KD模型，观察Res对KD诱发心肌损伤是否具有保护作用，这可进一步完善KD诱发心肌损伤的机制，并可为临床寻找潜在的治疗药物提供新的实验依据。

1. 材料与方法

1.1. 材料

健康雄性幼年SD大鼠(4周龄)48只，体重80~100 g，购买于西安交通大学医学院实验动物中心。B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、微管相关蛋白轻链3β(microtubuleassociated protein 1 light chain 3β，LC3B)、自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin 1)、自噬相关蛋白5(Atg5)和选择性自噬接头蛋白(p62)抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase，GAPDH)抗体购于北京中衫金桥生物技术有限公司；RIPA裂解液购于上海碧云天生物技术有限公司；蛋白酶抑制剂和二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒购于美国ThermoFisher Scientific公司；Res购于美国Sigma公司；原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)试剂盒购于瑞士Roche公司；干酪乳酸杆菌购于工业微生物菌种保藏中心；乳酸杆菌肉汤培养基和鼠李糖定量试剂盒购于上海广锐生物科技有限公司。

1.2. 幼年大鼠KD模型的制备

根据以往的模型制备方法[12]，将干酪乳酸杆菌菌种接种在肉汤培养基中，37 ℃厌氧环境培养2 d； 5 000 g离心培养基20 min，弃上清，沉淀中加入40 g/L十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)过夜以充分裂解。5 000 g离心裂解液30 min，PBS洗涤后，加入RNA酶(250 μg/mL)混匀，37 ℃孵育4 h，离心弃上清，重复3次。加入DNA酶(250 μg/mL)，37 ℃孵育4 h，离心弃上清，重复3次。最后在沉淀中加入胰蛋白酶(250 μg/mL)，37 ℃孵育4 h，离心(5 000 g，15 min)弃上清，重复3次。用PBS将沉淀重悬，采用超声破碎仪于冰上破碎2 h，4 ℃ 12 000 g离心1 h，取上清即为LCWE。用比色法将LCWE终浓度定为 1 mg/mL。

1.3. 实验分组

48只幼年SD大鼠随机分为对照组、Res对照组(Res组)、KD模型组(KD组)和Res处理KD组(Res+KD组)；其中，对照组腹腔注射生理盐水，Res组腹腔注射Res(100 mg/kg)，KD组腹腔注射0.5 mL LCWE(1 mg/mL)，Res+KD组腹腔注射0.5 mL LCWE(1 mg/mL)和Res(100 mg/kg)，根据文献[13]确定Res剂量。每天观察幼年大鼠的活动情况，包括体重、饮水、饮食等。第28天时结束实验并取材，用于相关指标的检测。

1.4. 小动物超声检测各组心功能

2%异氟烷麻醉幼年大鼠，并将大鼠仰卧位固定在VisualSonics Vevo2100小动物超声仪加热板上，将恒温加热板温度设定为37 ℃。将胸前区被毛脱去。用探头置于大鼠左胸前，在乳头肌水平位置用M型取样线监测心率，测量收缩期左室内径、舒张期左室内径等指标，并经计算得到左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)。

1.5. TUNEL染色

将石蜡切片经二甲苯和梯度酒精脱蜡复水处理后，PBS洗涤3次，每次5 min；室温下用蛋白酶K处理20 min，PBS洗涤3次，每次5 min；按照试剂盒说明书配置TUNEL反应液，并在避光条件下将反应液加到切片上，37 ℃水浴1 h，PBS洗涤3次，每次5 min；4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenylindole，DAPI)反应液避光37 ℃水浴15 min复染核，PBS洗涤3次，每次5 min，50%甘油封片保存。采用激光共聚焦显微镜拍照，Image J软件分析，阳性细胞核呈绿色，凋亡指数=阳性细胞核数/总细胞核数×100%。

1.6. 蛋白质印迹法检测蛋白质表达

各组称取相同重量的心肌组织，加入预冷的PBS，用眼科剪将心肌组织剪碎，4 ℃ 3 000 g离心10 min，弃上清，沉淀中加入含1%蛋白酶抑制剂的裂解液(质量/体积比为1꞉4)，在冰上研磨心肌组织并裂解20 min，4 ℃ 12 000 g离心30 min，吸取上清，弃沉淀；用BCA蛋白定量法测定各组蛋白质浓度，采用常规电泳和湿转法将蛋白质分离并转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，并用5 %脱脂奶粉室温下封闭2 h，将条带放入相应的Bax(1꞉1 000)、Bcl-2(1꞉1 000)、Atg5(1꞉1 000)、Beclin 1(1꞉1 000)、p62(1꞉1 000)、LC3B(1꞉1 000)和GAPDH(1꞉5 000)抗体中，4 ℃摇床过夜；Tris-盐酸洗膜缓冲液 (Tris-buffered saline Tween 20，TBST)洗膜3次，10 min/次，山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(1꞉5 000)室温摇床孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，用ECL化学发光液避光检测，采用Image J软件计算灰度值。

1.7. 透射电镜观察自噬小体的变化

取材时将心肌组织切成约1 mm×1 mm×1 mm的小块，先用4%戊二醛固定4 h，再用1%四氧化锇固定2 h，梯度乙醇脱水，丙酮处理20 min，将组织块放入模具并填满包埋剂，将模具放入60 ℃烤箱加热聚合48 h；包埋块修成梯形后行美兰染色，并在光镜下定位。超薄切片机切片后，用饱和醋酸铀染色10 min，再用枸橼酸铅染色10 min。在透射电镜下观察自噬小体的变化。

1.8. 统计学处理

用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计和分析，所有计量资料均采用均数±标准差( x¯ ±s)表示。组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)，两组间比较采用Tukey法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. Res改善KD诱发的心脏功能障碍

超声结果表明：Res组心脏功能和对照组比较差异没有统计学意义(P>0.05)；与对照组相比，KD组幼年大鼠心脏功能明显降低，表现为LVEF和LVFS显著减小(均P<0.01)；与KD组比较，Res+KD组幼年大鼠心脏功能得到明显改善，LVEF和LVFS明显升高(均P<0.01，图1)。

图1.

图1

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Res改善KD诱发的心脏功能障碍

Figure 1 Res alleviated KD-induced cardiac dysfunction

A: M-mode echocardiography. A1: Control group; A2: Res group; A3: KD group; A4: Res+KD group. B: Results of LVEF. C: Results of LVFS. **P<0.01 vs the control group; ††P<0.01 vs the KD group.

2.2. Res减轻KD诱发的心肌细胞凋亡

蛋白质印迹法和TUNEL染色结果显示：与对照组比较，Res组幼年大鼠心肌细胞凋亡指数和凋亡相关蛋白表达无明显变化(均P>0.05)；与对照组比较，KD组幼年大鼠心肌细胞凋亡指数和Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少，Bax/Bcl-2比值明显增大(均P<0.01)；而与KD组比较，Res+KD组幼年大鼠心肌细胞凋亡指数和Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达增加，Bax/Bcl-2比值显著降低(均P<0.01，图2)。

图2.

图2

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Res改善KD诱发的心肌细胞凋亡

Figure 2 Res alleviated KD-induced myocardial apoptosis

A: TUNEL staining (Scale bar=10 μm); B: Representative immunoblots of Bcl-2, Bax and GAPDH; C:Results of Bax/Bcl-2; D:Results of apoptotic index. Merged: Composition pictures of TUNEL staining and DAPI staining. **P<0.01 vs the control group;††P<0.01 vs the KD group.

2.3. Res改善KD引起的心肌自噬相关蛋白的表达

蛋白质印迹法结果显示：与对照组比较，Res组幼年大鼠心肌组织中自噬相关蛋白Beclin 1、Atg5、p62、LC3的表达差异均无统计学意义(均P>0.05)；与对照组比较，KD组心肌中Beclin 1、Atg5、p62的表达和LC3II/LC3I的比值均明显增加(均P<0.01)；而与KD组比较，Res+KD组Beclin 1、Atg5、p62的表达和LC3II/LC3I的比值均显著降低(均P<0.01，图3）。

图3.

图3

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Res减轻KD引起的心肌自噬功能障碍

Figure 3 Res reduced KD-induced myocardial autophagy dysfunction

A: Representative immunoblots of Beclin 1, Atg5, p62, LC3I/LC3II and GAPDH; B:Results of Beclin 1; C:Results of Atg5; D: Results of p62; E: Results of LC3II/LC3I. **P<0.01 vs the control group; ††P<0.01 vs the KD group.

2.4. Res抑制KD引起的心肌自噬小体增多

透射电镜结果显示：对照组和Res组幼年大鼠心肌组织中线粒体结构正常，排列整齐；与对照组比较，KD组心肌组织中出现线粒体形态肿胀、空泡化、嵴结构改变，同时形成明显的自噬小体；而与KD组比较，Res+KD组心肌组织中线粒体结构明显改善，空泡化减轻，自噬小体显著减少(图4)。

图4.

图4

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Res抑制KD引起的心肌自噬小体增多

Figure 4 Res inhibited KD-induced myocardial autophagosome development

3. 讨 论

KD最早在日本被发现，现在已经在世界范围内相继报道[14]。尽管经过了40年的调查研究，KD的病因仍不完全清楚。在KD发作的急性期，极易累及冠状动脉并引起冠状动脉扩张和冠状动脉瘤，而这成为婴幼儿获得性心脏病发病率和病死率高的主要原因[7]。由于KD发病机制和病因不明，使得临床及早的诊断和治疗成为了难题。本研究采用LCWE注射幼年大鼠来模拟KD模型，探讨了Res改善KD诱发的心肌损伤的作用和机制，发现细胞凋亡和自噬功能缺陷是KD诱发心肌损伤的重要原因。这进一步完善了KD诱发心肌损伤的机制，并为临床寻找潜在的治疗药物提供了实验依据。

如果KD得不到及时治疗极易引起冠状动脉扩张和冠状动脉瘤，进而损伤心脏功能。本实验发现：在腹腔注射LCWE模拟KD模型的幼年SD大鼠中，LVEF和LVFS明显降低，这说明KD组幼年大鼠出现心功能损伤。同时，Res+KD组可显著提高LVEF和LVFS，这说明Res能够改善KD组幼年大鼠心功能损伤，证明Res对KD诱发的心功能障碍具有保护作用。

由于心肌细胞是终末分化细胞，基本丧失增殖能力，当出现心肌细胞死亡后，心肌细胞的绝对数量会减少，因此，细胞凋亡是心肌损伤甚至进展为心力衰竭的重要病理学机制[15-16]。为了探究细胞凋亡在KD诱发心肌损伤中的作用，本实验检测了心肌细胞凋亡相关蛋白的表达和细胞凋亡率。结果发现：KD组幼年大鼠心肌组织中Bax蛋白表达明显增加，而Bcl-2表达降低，同时，TUNEL染色阳性细胞明显增多。这些结果表明细胞凋亡在KD诱发的心肌损伤中发挥重要作用。更为重要的是，Res+KD组可明显减少Bax蛋白表达，增加Bcl-2表达，降低细胞凋亡率，这说明Res能改善KD引起的心肌细胞凋亡，这可能是Res减轻KD诱发心肌损伤的重要原因之一。

Res是从多种天然植物中提取的具有生物活性的二苯乙烯类化合物，通过抗炎症、抗氧化、抗增殖和调节血管功能对心肌缺血、动脉粥样硬化和心肌病等均具有保护作用。Res对心血管系统的广泛作用使其成为心脏保护的潜在选择。研究[17]表明Res容易进入血管内皮细胞和平滑肌细胞，能改善内皮细胞功能，可调节血管增殖和凋亡。Res作用于单核细胞和巨噬细胞，调节炎症反应[18]。同时，Res还能作用于心肌细胞，降低氧化应激[19]。自噬是一种细胞内高度保守的、将蛋白质和细胞器降解以重复利用的过程，是维持细胞稳态和功能的重要机制[20]。在正常情况下，自噬参与心功能和结构的维持，然而自噬缺陷时，会导致心功能障碍[21-22]。本实验结果发现：KD组幼年大鼠心肌组织中自噬蛋白Beclin 1、Atg5、p62的表达以及LC3BII/LC3BI的比值均明显增加，同时自噬小体数量增多，这说明KD可导致心肌自噬功能缺陷。而Res+KD组可明显降低Beclin 1、Atg5、p62的表达、LC3BII/LC3BI的比值以及自噬小体数量，这些结果表明Res能够改善KD诱发的心肌自噬功能缺陷。

综上所述，本实验结果证明了Res在KD诱发心肌损伤中可发挥保护作用，这种保护作用与Res减轻KD导致的心肌细胞凋亡和改善自噬功能缺陷有关。本实验为阐明Res改善KD诱发心肌损伤的机制提供了实验依据。

[J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2021, 46(10): 1102-1108. DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2021.200843

基金资助

西安市科技计划项目(201805098YX6SF32-6)；西安市儿童医院院级课题(2020C01)。

This work was supported by the Xi'an Science and Technology Planning Project (201805098YX6SF32-6) and the Hospital Level Project of Xi'an Children's Hospital (2020C01), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2021101102.pdf

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