低氧对Caco-2细胞P-gp表达及功能的影响

Abstract

Objective

Hypoxia can alter the oral bioavailability of drugs, including various substrates (drugs) of P-glycoprotein (P-gp), suggesting that hypoxia may affect the function of P-gp in intestinal epithelial cells. Currently, Caco-2 monolayer model is the classic model for studying the function of intestinal epithelial P-gp. This study combines the Caco-2 monolayer model with hypoxia to investigate the effects of hypoxia on the expression and function of P-gp in Caco-2 cells, which helps to elucidate the mechanism of changes in drug transport on intestinal epithelial cells in high-altitude hypoxia environment.

Methods

Normally cultured Caco-2 cells were cultured in 1% oxygen concentration for 24, 48, and 72 h, respectively. After the extraction of the membrane proteins, the levels of P-gp were measured by Western blotting. The hypoxia time, with the most significant change of P-gp expression, was selected as the subsequent study condition. After culturing Caco-2 cells in transwell cells for 21 days and establishing a Caco-2 monolayer model, they were divided into a normoxic control group and a hypoxic group. The normoxic control group was continuously cultured in normal condition for 72 h, while the hypoxic group was incubated for 72 h in 1% oxygen concentration. The integrity and polarability of Caco-2 cells monolayer were evaluated by transepithelial electrical resistance (TEER), apparent permeability (Papp) of lucifer yellow, the activity of alkaline phosphatase (AKP), and microvilli morphology and tight junction structure under transmission electron microscope. Then, the Papp of rhodamine 123 (Rh123), a kind of P-gp specific substrate, was detected and the efflux rate was calculated. The Caco-2 cell monolayer, culturing at plastic flasks, was incubated for 72 h in 1% oxygen concentration, the expression level of P-gp was detected.

Results

P-gp was decreased in Caco-2 cells with 1% oxygen concentration, especially the duration of 72 h (P<0.01). In hypoxic group, the TEER of monolayer was more than 400 Ω·cm², the Papp of lucifer yellow was less than 5×10^-7 cm/s, and the ratio of AKP activity between apical side and basal side was greater than 3. The establishment of Caco-2 monolayer model was successful, and hypoxia treatment did not affect the integrity and polarization state of the model. Compared with the normoxic control group, the efflux rate of Rh123 was significantly reduced in Caco-2 cell monolayer of the hypoxic group (P<0.01). Hypoxia reduced the expression of P-gp in Caco-2 cell monolayer (P<0.01).

Conclusion

Hypoxia inhibits P-gp function in Caco-2 cells, which may be related to the decreased P-gp level.

机体暴露于低氧环境后，药物的吸收、分布、代谢和排泄均会发生改变，其药代动力学特征，尤其是药物的口服生物利用度在低氧环境暴露后发生显著变化，从而影响药物使用的安全性和有效性^[1]。药物的生物利用度与药物的吸收及代谢密切相关。目前的研究^[2]主要从药物肝脏代谢的角度阐释低氧对机体药物处置过程的影响，仍需深入探究低氧环境对药物肠吸收的影响。

细胞膜表面的P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是一种能量依赖性药物转运蛋白，可将底物逆浓度梯度排出细胞^[3]。P-gp底物类别广泛，肠上皮细胞膜上的P-gp对口服药物的跨膜转运可产生重要影响，P-gp功能的改变将影响其底物(药物)的口服生物利用度^[4]，阐明低氧环境暴露对肠上皮P-gp功能及药物肠吸收的影响将为高原合理用药提供重要的理论依据。本课题组前期研究^[5-6]发现高原低氧会改变大量药物的口服生物利用度，其中也包括多种P-gp的底物(药物)。低氧可能影响肠上皮细胞P-gp的功能^[7]。但是，低氧对P-gp功能的影响尚存在一定的争议^[8-9]，仍有待进一步研究。相对于在整体动物模型的药物代谢动力学研究，离体模型更有利于准确评价低氧对肠上皮P-gp功能及药物肠吸收的影响。

Caco-2细胞单层膜模型在形态、功能方面与小肠上皮相似，包括能够形成小肠上皮刷状缘结构，表达药物代谢酶及包括P-gp在内的多种药物转运蛋白，是体外研究及预测药物肠吸收的经典模型^[10]。通过研究P-gp特异性底物罗丹明123(rhodamine 123，Rh123)的双向跨膜转运，能够评价不同因素对P-gp外排功能的影响^[11]。但低氧对Caco-2细胞P-gp功能的影响尚不明确，利用Caco-2细胞单层膜模型评价低氧对P-gp功能及药物肠吸收影响的体系尚不成熟。

本研究根据低氧对Caco-2细胞P-gp表达的影响，明确了低氧处理条件；系统评价了Caco-2细胞单层膜模型的完整性、通透性及极化性；最终在建立的Caco-2细胞单层膜模型上，通过考察P-gp特异性底物Rh123的外排率(efflux rate，ER)评价低氧对P-gp功能的影响，为基于P-gp转运功能及药物肠吸收的高原合理用药研究提供了理论基础及新的手段。

1. 材料与方法

1.1. 细胞、试剂及仪器

Caco-2细胞由美国休斯敦大学药学院胡明教授提供。DMEM高糖培养基、胰酶为上海源培生物科技股份有限公司产品，青霉素、链霉素、非必需氨基酸溶液为美国Gibco公司产品，BCA蛋白定量试剂盒为北京索莱宝科技有限公司产品，血清为德国PAN Biotech公司产品，HEPES、Rh123、荧光黄为美国Sigma公司产品，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，电镜固定液和HBSS为武汉赛维尔生物科技有限公司产品，膜蛋白提取试剂盒为美国Thermo Fisher公司产品，P-gp抗体、ATP1A1抗体、山羊抗兔二抗为美国Abcam公司产品，增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂为美国Millipore公司产品。

Transwell小室为美国Corning公司产品，低氧培养小室为美国Billups-Rothenberg公司产品，O₂浓度测定仪(EST-10-02)为美国Estesnros公司产品，二氧化碳培养箱为德国Memmert公司产品，全自动荧光酶标仪(Spectra Max i3)为美国Molecular Devices公司产品，跨膜细胞电阻仪(MERS00002)为美国Millipore公司产品，全能型化学发光系统(Chemi Doc)为美国BIO-RAD公司产品，透射电镜(HT7800)为日本HITACHI公司产品。

1.2. Caco-2细胞培养

Caco-2细胞用DMEM高糖培养液(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、1%非必需氨基酸、20 mmol/L HEPES)，置于37 ℃、5% CO₂条件下培养，每2~3 d更换1次培养液。待细胞融合达到80%~90%时，用HBSS冲洗2次，用含0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的0.25%胰酶溶液消化，按1꞉3传代。

1.3. Caco-2细胞低氧处理

Caco-2细胞以0.3×10⁵个/cm²接种于100 mm培养皿中，待细胞融合至70%时，吸弃原培养基，加入在1% O₂浓度下平衡24 h的低氧培养液后，立即将Caco-2细胞放入低氧培养小室。向小室内充入混合气(O₂浓度1%，CO₂浓度5%，N₂浓度94%)，并使用O₂浓度测定仪测定小室内氧含量，O₂浓度稳定至1%后停止充气。低氧培养小室置于37 ℃培养箱，继续培养24、48、72 h。

1.4. 蛋白印迹法检测Caco-2细胞膜P-gp表达水平

分别收集正常培养及低氧处理24、48、72 h的Caco-2细胞，用冷HBSS清洗细胞3次，使用膜蛋白提取试剂盒，参照说明书进行操作，提取Caco-2细胞膜蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白质的浓度；向蛋白质样品中加入上样缓冲液进行变性，取15 μg蛋白质进行电泳，转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上；将膜放入含有5%脱脂奶粉的封闭液中在室温下封闭2 h，分别加入P-gp抗体(1꞉1 000)、ATP1A1抗体(1꞉15 000) 4 ℃过夜；洗膜后加入山羊抗兔二抗，在室温下孵育1.5 h；清洗后加入ECL试剂，在化学发光成像系统中采集图像，并用Image J软件进行灰度分析，选择P-gp表达量变化最明显的低氧处理时间作为后续P-gp外排功能研究中的低氧处理时长。

1.5. Caco-2细胞单层膜模型构建及低氧处理

将处于对数生长期的Caco-2细胞，以0.3×10⁶个/孔的密度接种于transwell小室的聚碳酸酯膜上，接种24 h后换液；接种后的1~13 d，隔天换液，14~21 d，每天换液。将在transwell小室中培养21 d的Caco-2细胞分为常氧对照组及低氧组。常氧对照组Caco-2细胞单层膜更换正常培养液，在正常条件下继续培养72 h；低氧组Caco-2细胞单层膜更换在浓度为1%的O₂下平衡24 h的低氧培养液，并按照1.3中的方法低氧培养72 h。

1.6. Caco-2细胞单层膜评价

致密、完整且分化完全的Caco-2单层细胞是利用双向转运实验评价P-gp功能的必要条件。因此，本研究通过检测跨膜电阻(transepithelial electrical resistance，TEER)、细胞旁通路标准物透过性、AKP活性及透射电镜下观察对Caco-2单层细胞膜进行评价。

1.6.1. TEER测定

Caco-2细胞单层膜经常氧或低氧处理结束后，用HBSS清洗transwell小室中的Caco-2细胞3次，使用细胞电阻仪测量并计算Caco-2细胞单层膜的TEER。

1.6.2. 荧光黄透过性检测

用HBSS配置荧光黄标准溶液(0.005、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000 mg/L)，在激发波长427 nm，发射波长536 nm条件下测定荧光强度，以浓度为纵坐标，荧光强度为横坐标绘制标准曲线。

Caco-2细胞单层膜经常氧或低氧处理后，吸弃待测transwell小室内的培养液，肠腔(apical，AP)侧、基底(basal，BL)侧分别加入0.5、1.5 mL HBSS(低氧处理的Caco-2细胞加入低氧平衡好的HBSS)，在37 ℃下孵育10 min后再次更换HBSS，洗3次；在AP侧加入0.5 mg/mL荧光黄0.4 mL，BL侧加入1.2 mL HBSS，放置在摇床(50 r/min，37 ℃)上培养120 min。吸取BL侧的转运液，在激发波长427 nm，发射波长536 nm条件下测定荧光强度，根据标准曲线计算荧光黄浓度，并根据以下公式计算表观渗透系数(apparent permeability coefficient，Papp)：

$$Papp=\frac{(dQ/dt)}{(A*C_{\mathrm{0}})}\text{。}$$ (1)

其中dQ为累积转运量(单位mg)，dt为累积转运时间(单位s)，A为膜面积(单位cm²)，C₀ 为AP侧药物的初始浓度(单位mg/mL)。

1.6.3. AKP活性测定

Caco-2细胞单层膜经常氧或低氧处理结束后，分别吸取transwell小室AP侧及BL侧培养基，于4 ℃下以3 000 r/min离心10 min。取上清，按照AKP活性检测试剂盒说明书进行操作，在520 nm下测定吸光度值，并计算AKP活性。

1.6.4. 透射电镜下观察

Caco-2细胞单层膜经常氧或低氧处理后，用电镜固定液于4 ℃下固定保存；切下transwell聚碳酸酯膜，经琼脂预包埋后，用1%锇酸避光于室温下固定2 h；乙醇梯度脱水后行渗透包埋(丙酮꞉812包埋剂为1꞉1)；包埋板放于60 ℃烤箱聚合48 h后，行60~ 80 nm超薄切片；用2%醋酸铀及2.6%枸橼酸铅分别染色8 min后干燥过夜；在透射电子显微镜下观察，并采集图像。

1.7. Rh123转运实验

用HBSS配置Rh123标准溶液(浓度为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L)，在激发波长466 nm，发射波长535 nm条件下测定荧光强度，以浓度为纵坐标，荧光强度为横坐标绘制标准曲线。

Caco-2细胞单层膜经常氧或低氧处理后，吸弃待测transwell小室内的培养液，AP侧、BL侧分别加入0.5、1.5 mL HBSS(低氧处理的Caco-2细胞加入低氧平衡好的HBSS)，在37 ℃下孵育10 min后再次更换HBSS，洗3次。正向(AP→BL)转运：在AP侧加入浓度为6.25 μmol/L的P-gp特异性底物Rh123溶液0.4 mL，BL侧加入1.2 mL HBSS；反向(BL→AP)转运：在BL侧加入浓度为6.25 μmol/L的Rh123溶液1.2 mL，AP侧加入0.4 mL HBSS。常氧对照组在正常环境下进行实验，低氧组细胞单层膜置于1% O₂浓度的低氧装置中进行实验。放置在摇床(50 r/min，37 ℃)上培养90 min，吸取BL侧或AP侧的转运液，在激发波长466 nm，发射波长535 nm条件下测定荧光强度，根据标准曲线计算Rh123浓度，根据公式(1)计算Papp，根据下式计算ER：

$$ER=\frac{Pap{p}_{\mathrm{B}\mathrm{L}\to \mathrm{A}\mathrm{P}}}{Pap{p}_{\mathrm{A}\mathrm{P}\to \mathrm{B}\mathrm{L}}}\text{。}$$ (2)

1.8. Caco-2细胞单层膜低氧处理及P-gp检测

因Caco-2细胞单层膜模型已在支持物上生长 21 d，形态和功能都与常规培养的Caco-2细胞有所区别，而前期低氧时间筛选时的细胞为正常培养的未分化Caco-2细胞，故将Caco-2细胞以0.3×10⁵个/cm²的密度接种于塑料培养瓶中，按照1.5中细胞单层膜的换液方法培养21 d后，将其分为常氧对照组和低氧组，常氧对照组在正常条件下继续培养72 h，低氧组在浓度为1%的O₂下继续培养72 h，按照1.4中的方法提取细胞膜蛋白质，检测P-gp的表达量。

1.9. 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，2组比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 低氧对Caco-2细胞P-gp表达水平的影响

蛋白质印迹法结果(图1)显示：与常氧对照组相比，O₂浓度为1%，低氧时长为24、48、72 h时，Caco-2细胞P-gp表达水平分别下降14.50%(P>0.05)、32.54%(P<0.05)、47.39%(P<0.01)，其中低氧培养72 h对Caco-2细胞P-gp表达的影响最为显著，故选择该条件作为单层膜低氧处理条件。

图1.

低氧对Caco-2细胞P-gp表达水平的影响

Figure 1 Effect of hypoxia on the expression level of P-gp in Caco-2 cells

Data are represented as the means±standard deviation, n=3. The expression level of P-gp was decreased in Caco-2 cells with 1% oxygen concentration. *P<0.05, **P<0.01 vs the normoxic control group. P-gp: P-glycoprotein; ATP1A1: Na⁺/K⁺ ATPase α1 subunit.

2.2. Caco-2细胞单层膜可用于转运实验

2.2.1. 细胞单层膜完整

常氧对照组、低氧组Caco-2细胞单层膜TEER均大于400 Ω·cm²(表1)，表明致密的细胞单层膜已形成，且低氧处理未破坏其完整性，可用于转运实验。

表1.

在通透性介质上培养的Caco-2细胞单层膜的评价

Table 1 Evaluation of Caco-2 cell monolayer grown on permeable supports

组别	TEER/(Ω·cm2)	荧光黄Papp/(×10-7cm·s-1)
参考值	>400	<5
常氧对照组	620±17	0.23±0.11
低氧组	613±32	0.67±0.10

数据表示为均数±标准差，n=3。TEER：跨膜电阻；Papp：表观渗透系数。

2.2.2. 细胞单层膜通透性符合要求

常氧对照组、低氧组Caco-2细胞单层膜荧光黄的Papp均小于5×10^-7 cm/s(表1)，进一步表明低氧处理未破坏Caco-2单层细胞膜的完整性，通透性符合要求，可用于转运实验。

2.2.3. 低氧处理未影响Caco-2细胞单层膜的极化状态

低氧组及常氧对照组Caco-2细胞单层膜AP侧、BL侧AKP活性见表2，AP侧与BL侧AKP活性比值均大于3，表明Caco-2细胞出现明显的极化现象，且低氧处理未影响Caco-2细胞的极化状态，可用于转运实验。

表2.

低氧组及常氧对照组Caco-2细胞单层膜AP侧、BL侧AKP的活性

Table 2 AKP activity in the AP side and basal side of Caco-2 cell monolayer in the hypoxic group and normoxic control group

组别	AKPAP/(金氏 单位·100 mL-1)	AKPBL/(金氏 单位·100 mL-1)	AKPAP/ AKPBL
常氧对照组	4.91±0.54	0.86±0.27	5.71
低氧组	4.22±0.65	0.52±0.15	8.11

数据表示为均数±标准差，n=3。AKP：碱性磷酸酶；AP：肠腔；BL：基底。

2.2.4. 低氧处理未破坏Caco-2细胞单层膜微绒毛结构及紧密连接

透射电镜下(图2)显示：常氧对照组Caco-2细胞表面微绒毛分布均匀，排列整齐，分化良好；细胞间紧密连接结构完整、致密。低氧组上述结构与常氧对照组无差别。进一步表明，本研究成功建立了Caco-2细胞单层膜模型，细胞分化良好，结构完整，且低氧条件未破坏Caco-2细胞单层膜微绒毛结构及紧密连接结构，可用于转运实验。

图2.

透射电镜下Caco-2细胞单层膜模型形态

Figure 2 Images of Caco-2 cell monolayer model under transmission electron microscope

A: Normoxic control group; B: Hypoxic group. The arrows indicate tight junctions between cells. Bar=2 μm.

2.3. 低氧处理对连续培养21 d的Caco-2细胞P-gp表达的影响

与常氧对照组相比，低氧组Caco-2细胞P-gp表达下降了35.11%(P<0.01，图3)。

图3.

低氧对在培养瓶中培养21 d的Caco-2细胞P-gp表达的影响

Figure 3 Effect of hypoxia on the expression level of P-gp in Caco-2 cells cultured 21 days in flask

Data are represented as the means±standard deviation, n=3. The expression level of P-gp was decreased in Caco-2 cells with 1% oxygen concentration. **P<0.01 vs the normoxic control group. P-gp: P-glycoprotein; ATP1A1: Na⁺/K⁺ ATPase α1 subunit.

2.4. 低氧处理抑制Caco-2细胞P-gp的外排功能

与常氧对照组相比，低氧处理的Caco-2细胞单层膜Rh123的Papp _AP→BL升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，Papp _BL→AP显著降低(P<0.01)，Rh123的ER显著降低(P<0.01，表3)。Caco-2细胞上P-gp的外排功能降低，这与低氧条件下Caco-2细胞P-gp表达下降的结果一致。提示低氧处理可能通过下调细胞质膜上的P-gp表达抑制Caco-2细胞P-gp外排功能。

表3.

低氧对Rh123在Caco-2细胞单层膜上转运的影响(n=3， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Table 3 Effect of hypoxia on the Rh123 transport of Caco-2 cell monolayer (n=3, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

组别	Papp AP→BL/(×10-6cm·s-1)	Papp BL→AP/(×10-6cm·s-1)	ER
常氧对照组	0.61±0.23	10.86±0.62	17.97±1.03
低氧组	1.04±0.41	6.77±0.67**	6.46±0.64**

与常氧对照组比较，**P<0.01。Rh123：罗丹明123；Papp：表观渗透系数；AP：肠腔；BL：基底；ER：外排率。

3. 讨 论

绝大部分口服药物由小肠吸收，该过程受肠上皮细胞膜上多种药物转运蛋白的调控。作为肠上皮细胞膜上最重要的药物转运蛋白之一，P-gp在肠道上皮细胞腔侧面膜表达丰富，能够将进入细胞的底物(药物)逆浓度梯度泵回肠腔侧，减少药物的肠吸收。P-gp功能的增强或抑制将影响其底物(药物)的生物利用度，导致疗效降低或不良反应增加。当前关于肠上皮P-gp功能的研究，主要集中在药物-药物相互作用方面，而环境因素对P-gp功能影响的研究则较为少见。本课题组前期研究^{[6, 12]}发现，低氧暴露 72 h导致大鼠小肠P-gp表达下调，增加P-gp底物(药物)左氧氟沙星的肠吸收，提示低氧可能抑制P-gp的功能。但在整体动物模型上，无法直观地反映P-gp的功能，低氧对肠上皮细胞P-gp功能的影响尚不明确。研究低氧对肠上细胞P-gp功能的影响有助于阐明高原低氧改变肠上皮药物转运的机制。Caco-2单层细胞是当前研究肠上皮P-gp功能、预测药物肠吸收的经典模型。本研究结果表明，低氧抑制Caco-2细胞P-gp的转运功能，并且可能与P-gp表达下调有关。

虽然本课题组前期动物研究^{[6, 12]}发现低氧暴露72 h抑制大鼠小肠P-gp的表达，但也有一些研究^[8]表明低氧对P-gp表达具有诱导作用。因此，在研究低氧对Caco-2细胞P-gp功能的影响作用之前，本研究首先观察低氧处理72 h内Caco-2细胞膜上P-gp表达的变化。结果表明Caco-2细胞膜P-gp表达水平随着低氧处理时间的延长持续下调，在低氧处理72 h时，下调最为显著。因此，在P-gp功能研究中选取1%的O₂浓度培养72 h作为低氧处理条件。

应用Caco-2细胞单层膜进行双向转运实验的前提是单层膜的完整性及极化状态。研究^[13]表明低氧处理48 h会导致Caco-2细胞单层膜的完整性受到破坏，那么应用此模型研究低氧对P-gp功能影响时，首先要解决的关键问题是1% O₂浓度处理72 h是否影响Caco-2细胞单层膜的完整性和极化状态。TEER、荧光黄Papp、AKP活性及透射电镜下对微绒毛及紧密连接结构的观察结果均表明Caco-2细胞单层膜模型建立成功，且低氧处理未影响模型的完整性与极化状态，可用于P-gp功能的评价。在随后的双向转运实验中，研究了P-gp特异性底物Rh123的Papp以及ER，结果表明低氧增加Rh123的正向渗透系数，减少Rh123的反向渗透系数，降低Rh123的ER，说明低氧抑制Caco-2细胞P-gp的外排功能。这种外排功能的抑制是否与P-gp的下调有关呢？Caco-2细胞单层膜中的Caco-2细胞已发生分化，不能确定低氧对其P-gp的影响与常规方式培养的Caco-2细胞一致，因此，本研究尝试从transwell小室中聚碳酸酯膜上的Caco-2细胞单层膜中提取蛋白质。但因无法确保在不损伤细胞膜的情况下获得细胞，且聚碳酸酯膜的面积限制了细胞的数量，我们采用了早期的Caco-2细胞单层膜的建立方式之一，即通过在塑料培养瓶中连续培养21 d的方法获得Caco-2细胞单层膜^[14]，研究低氧条件对其P-gp表达的影响。结果表明1% O₂浓度培养72 h确实下调了Caco-2细胞单层膜P-gp表达水平。据此，笔者认为低氧对Caco-2细胞P-gp外排功能的抑制与其下调P-gp表达有关。这与前期动物研究^{[6, 12]}的结论一致，进一步阐明了药物转运蛋白在低氧改变口服药物肠吸收中的作用。因此在高原低氧环境下，P-gp底物(药物)的口服生物利用度可能会增加。在使用这类药物时，可能会因全身血液循环药物浓度的上升而增加不良反应的发生率，应当适当调整用法及用量，尤其是对于治疗窗窄的P-gp底物(药物)，更应注意其毒性反应的发生。

此外，本研究将Caco-2细胞单层膜模型与低氧处理相结合，并对其特性进行了系统评价。此模式不仅可用于低氧对药物转运蛋白功能影响的研究，还可直接用于药物肠吸收的评价、口服药物在高原低氧环境下肠吸收过程的预测、生物利用度可能受高原低氧影响药物的筛选和评价，具有较强的应用价值。

综上，本研究利用Caco-2细胞单层膜模型阐明了低氧对肠上皮细胞P-gp功能及表达的抑制作用，并扩展了Caco-2细胞单层膜模型的应用，为基于药物肠吸收过程的高原合理用药提供了新的研究手段。

基金资助

国家自然科学基金(82173738)；甘肃省青年科技基金(20JR10RA014)。

This work was supported by the National Natural Science Foundation (82173738) and the Science and Technology Foundation for Young Scholars of Gansu Province (20JR10RA014), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

赵安鹏 实验设计与实施，数据统计与分析，论文构想与撰写；牟宏芳 细胞实验操作与数据采集；姚菀腾、常熙雯 数据采集与分析；李文斌、王荣 实验设计，论文审阅与修订。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202304491.pdf