Abstract
目的
胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，低氧微环境在实体肿瘤中普遍存在。本研究旨在探讨在低氧环境中发生上调的相关基因及其对胶质瘤生长和预后的影响。
方法
在基因表达数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)中筛选胶质瘤与低氧相关的数据集，通过生物信息学分析低氧处理与非低氧处理之间的差异表达基因，并在低氧处理后的细胞中通过real-time PCR和蛋白质印迹法来验证并筛选出C10orf10(chromosome 10 open reading frame 10)基因。下载癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)以及中国脑胶质瘤图谱(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)数据库中胶质瘤样本数据集，分析在不同级别胶质瘤中C10orf10 mRNA的表达及其对胶质瘤预后的影响。收集2017年3月至2021年1月在中南大学湘雅医院行手术治疗的68例胶质瘤患者的瘤组织标本及随访数据，采用real-time PCR检测不同级别胶质瘤中C10orf10 mRNA的表达，再结合Kaplan-Meier法分析C10orf10与胶质瘤预后之间的关系。构建干扰C10orf10表达的胶质瘤细胞系，采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)及克隆形成实验评估C10orf10对胶质瘤细胞增殖的影响。
结果
与常氧条件下相比，在低氧环境下胶质瘤细胞系能够显著上调C10orf10 mRNA和蛋白质水平(均P<0.001)，且胶质瘤组织中C10orf10 mRNA表达水平随着WHO分级的增高而上调(P<0.001)。生存分析发现C10orf10 mRNA表达水平越高，患者的生存期则越短(P<0.05)。并且，在CGGA中，C10orf10 mRNA表达水平在复发胶质瘤中较原发胶质瘤中表达高(P<0.001)。干扰C10orf10的表达后，在常氧和低氧环境下均能够显著抑制胶质瘤细胞的生长(均P<0.05)。
结论
C10orf10的表达水平与胶质瘤的生长和预后相关，并有望成为胶质瘤的一个预后标志物及治疗靶点。
Keywords: 胶质瘤, 低氧, C10orf10基因, 预后
Abstract
Objective
Glioma is the most common malignant tumor in the central nervous system, and the hypoxic microenvironment is prevalent in solid tumors. This study aims to investigate the up-regulation of genes under the condition of hypoxia and their roles in glioma growth, as well as their impact on glioma prognosis.
Methods
The hypoxia-related dataset with glioma was screened in the Gene Expression Omnibus database (GEO), and the differentially expressed genes were analyzed between hypoxia and normoxia through bioinformatics, and chromosome 10 open reading frame 10 (C10orf10) was verified and screened in hypoxia-treated cells through real-time PCR and Western blotting. The Cancer Genome Atlas (TCGA) and the Chinese Glioma Genome Atlas (CGGA) datasets were downloaded to analyze the mRNA expression of C10orf10 in different grades of glioma and its impact on prognosis. The glioma specimens and follow-up data of 68 gliomas who underwent surgical treatment in Xiangya Hospital of Central South University from March 2017 to January 2021 were collected, and real-time PCR was used to detect the mRNA expression of C10orf10 in different grades of glioma, and the Kaplan-Meier method was used to analyze the relationship between the expression C10orf10 and prognosis. The glioma cells, which could interfere the expression of C10orf10, were constructed, and the effect of C10orf10 on the proliferation of glioma cells was evaluated by cell counting kit-8 (CCK-8) and colony formation assays.
Results
Compared with the condition of normoxia, the expression levels of C10orf10 mRNA and protein were significantly up-regulated in glioma cells under hypoxia (P<0.001), and the mRNA expression level of C10orf10 in glioma tissues was up-regulated with the increase of WHO grade in glioma (P<0.001). Based on Kaplan-Meier survival analysis, the higher the mRNA expression level of C10orf10 was, the shorter the survival time of the patient was (P<0.05). And the expression of C10orf10 mRNA was higher in recurrent gliomas than that in primary gliomas in the CGGA database (P<0.001). Knockdown of C10orf10 could significantly inhibit the growth of glioma cells both under hypoxia and normoxia (both P<0.001).
Conclusion
The expression level of C10orf10 can promote the proliferation and prognosis of glioma, which is expected to become a prognostic marker and therapeutic target for glioma.
Keywords: glioma, hypoxia, C10orf10 gene, prognosis
目前，胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性脑肿瘤，年发病率约为6.6/10万，约占所有原发性脑瘤的30%，约占所有中枢神经系统恶性肿瘤的80%；由于神经胶质瘤位于中枢神经系统，并且有局部侵袭性生长的特点，手术全切困难且易复发，使其具有较高的致残率和致死率，是导致大多数原发性脑瘤死亡的原因，整体5年存活率仅为35%[1-3]。根据WHO分级可以将胶质瘤分成I~IV级，其中I、II级为低级别胶质瘤，III、IV级为高级别胶质瘤[4]。目前，关于胶质瘤发生、发展的机制尚未明确，有必要进一步探索胶质瘤发生、发展过程中分子调控的相关机制及新的分子靶点，以期提高胶质瘤患者的治愈率，延长患者生存期。
在肿瘤微环境中，有一个显著的特征就是缺氧，它越来越被认为是调控肿瘤发生、发展的关键因素[5-6]。同样在胶质母细胞瘤的研究[7-8]中，肿块不同部位内的氧含量也不是均匀恒定的，变化范围为0.1%~10.0%，而中位数浓度约为1%。因此，胶质瘤中的肿瘤组织普遍处于低氧环境。
C10orf10(chromosome 10 open reading frame 10)基因最先的克隆来自于人类子宫，是乳腺癌中的一个重要的预后因子，在神经母细胞瘤的发生、发展中也发挥重要作用[9]。同时，它也是受缺氧诱导调控的重要基因之一[10]。然而，目前C10orf10在胶质瘤中的具体作用尚不完全清楚。
本研究拟先筛选基因表达数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)与胶质瘤低氧相关数据集，利用生物信息学方法分析低氧调控的相关基因，再利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和中国脑胶质瘤图谱(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)数据库中的数据进行相关性分析，然后使用临床标本及随访数据进行验证，最后采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)和克隆形成实验来探索其在胶质瘤中发生、发展的作用。
1. 材料与方法
1.1. 材料
1.1.1. 细胞系和胶质瘤组织
胶质瘤U87-MG和U373细胞系购自于美国模式培养物研究所(American Type Culture Collection，ATCC)。本研究中涉及的胶质瘤临床标本取自2017年3月至2021年1月在中南大学湘雅医院神经外科行手术的68例胶质瘤患者，所有样本均获得中南大学湘雅医院伦理委员会的批准(审批号：202112184)，且患者签署了相关知情同意书。68例胶质瘤患者中包括42例(61.8%)男患者和26例(38.2%)女患者，年龄为1.00~70.00(47.91±1.56)岁，包括WHO分级中的II级(n=20)、III级(n=16)和IV级(n=32)。
1.1.2. 主要试剂
DMEM培养基购于美国Gibco公司；TRIzol试剂和反转录试剂盒购于日本Takara公司；胎牛血清和 β-actin抗体(#A5441)购于美国Sigma公司；C10orf10抗体购于美国Proteintech公司(25833-1-AP)、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)抗体(#3434T)和二抗购于美国CST公司；靶向人C10orf10的慢病毒shRNA克隆和非特异性靶对照(GV248)购自美国GeneChem公司；CCK-8购于美国Bimake公司。
1.2. 方法
1.2.1. 细胞培养及C10orf10敲除细胞系的构建
U87-MG和U373细胞系培养于含有10%胎牛血清并添加三抗(青霉素、链霉素、庆大霉素)的DMEM培养基中，并将其放置于含5% CO2的37 ℃恒温培养箱中进行培养。根据Lipofectamine®的实验方法，在293T细胞中包装慢病毒颗粒，并将U87-MG细胞系提前接种在6孔板上，然后转染慢病毒颗粒并添加10 mg/mL聚凝胺，最后用2 μg/mL浓度的嘌呤霉素对稳定表达的细胞进行筛选。shC10orf10#1的序列：5'-TCTGACGTGTAACCGCATATA-3'，shC10orf10#2的序列：5'-TTTCACATGAGGAGATGTTAC-3'。
1.2.2. 生物信息学分析
在GEO中下载经过低氧处理后的胶质瘤细胞系转录本数据(GSE73556)，利用R语言进行差异基因分析，对比常氧条件下与低氧条件下差异表达的相关基因。再从TCGA和CGGA中下载胶质瘤表达谱及临床数据，用于分析C10orf10基因在不同级别胶质瘤中的表达差异，并采用Kaplan-Meier方法分析C10orf10的表达与患者总生存期(overall survival，OS)之间的关系。为进一步了解C10orf10的表达与胶质瘤进展之间的关系，选取CGGA中数据并分成原发性胶质瘤和复发性胶质瘤，并进行C10orf10的表达量分析，同时选取采用替莫唑胺(temozolomide，TMZ)治疗的胶质瘤患者的C10orf10表达量进行Kaplan-Meier方法分析。
1.2.3. RNA抽提和real-time PCR检测
使用TRIzol试剂从胶质瘤组织中提取总RNA。根据反转录试剂盒中操作说明，将总RNA反转录为cDNA。使用7500实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems®，新加坡)进行real-time PCR检测，以β- actin为内参，并计算相对基因表达水平。C10orf10正向序列：5'-GTGAGGTCTATATC-TCGACTGGC-3'，反向序列：5'-CCACTGAAACGTGCGGTGATGT-3'。HIF-1α正向序列：5'-TATGAGCCAGAAGAACT-TTTAGGC-3'，反向序列：5'-CACCTCTTTTGGCAA-GCATCCTG-3'。β-actin正向序列：5'-CACCATTGG-CAATGAGCGGTTC-3'，反向序列：5'-AGGTCTTT-GCGGATGTCCACGT-3'。
1.2.4. 蛋白质印迹法检测
收集对数生长期细胞，在细胞裂解缓冲液中裂解胶质瘤细胞。将30 μg总蛋白加样于10% SDS-PAGE凝胶中电泳，并转膜至PVDF膜上，室温封闭2 h，然后进行一抗4 ℃下孵育过夜[C10orf10(1꞉1 000)、HIF-1α(1꞉1 000)、β-actin(1꞉10 000)]。用PBST洗涤3次，每次10 min后在室温下孵育二抗1 h，再用PBST洗涤3次。用ChemiDox XRS+(Bio-Rad，美国)成像系统检测条带抗体信号。
1.2.5. 细胞CCK-8和克隆形成实验
根据构建稳定表达细胞系的情况，实验分为如下3组：阴性对照(shCtrl)组、C10orf10干扰#1(shC10orf10#1)组、C10orf10干扰#2(shC10orf10#2)组。
收集对数生长期细胞并计数，在96孔板中每孔接种500个细胞，并添加含10%的完全培养基200 μL，然后在37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中继续对细胞进行培养，分别在0、24、48、72和96 h 后加入10 μL CCK-8 溶液，再在培养箱中继续培养2 h，用分光光度计检测细胞在450 nm处的吸光度值。
将500个细胞接种到含10%的完全培基的6孔板中，然后将细胞放置在37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中连续培养14 d。最后用甲醇固定10 min，采用结晶紫染色15 min，并使用Image J计数克隆形成数。
为探索低氧环境下C10orf10对胶质瘤细胞生长的影响，收集对数生长期细胞并计数。在96孔板中每孔接种500个细胞，并添加含10%的完全培基 200 μL，然后在37 ℃，1% O2的恒温、低氧培养箱中对细胞进行培养，分别在0、24、48和72 h后加入10 μL CCK-8 溶液，再在培养箱中继续培养2 h。用分光光度计检测细胞在450 nm处的吸光度值。
1.3. 统计学处理
采用R语言和Graphpad Prism 8.0统计学软件对数据进行基因差异表达分析、生存曲线分析、基因表达量差异分析并作图。计量资料以均数±标准差( ±s)表示，基因表达采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结 果
2.1. 低氧处理后差异表达的基因
通过对GEO数据库中胶质瘤细胞系经过低氧处理后的数据集(GSE73556)中mRNA表达谱数据进行差异表达分析，发现低氧处理后有405个基因上调，160个基因下调，各选取上调或下调前50的基因作成热图(图1A)，选取上调中尚未在胶质瘤中展开研究的C10orf10进行研究。进一步选取U87-MG和U373细胞系进行低氧(1%O2)处理24 h，然后使用real-time PCR和蛋白质印迹法分别检测低氧处理后对胶质瘤细胞系中C10orf10 mRNA和蛋白水平变化的影响，发现低氧处理与正常氧处理相比，低氧处理C10orf10的表达在转录水平和蛋白水平上均高于正常氧处理 (均P<0.001；图1B~1E)。
图1.
低氧处理后差异表达基因及其验证
Figure 1 Differentially expressed genes and its verification after hypoxia treatment
A: Differential expressed genes induced by hypoxia treatment; B: Differential mRNA level of C10orf10 between hypoxia and normoxia treatment in U87-MG cell line by real-time PCR; C: Effect of hypoxia treatment on the C10orf10 protein level in U87-MG cell line by Western blotting; D: Differential mRNA level of C10orf10 between hypoxia and normoxia treatment in U373 cell line by real-time PCR; E: Effect of hypoxia treatment on the C10orf10 protein level in U373 cell line by Western blotting. *P<0.05, ***P<0.001 vs the hypoxia treatment. C10orf10: Chromosome 10 open reading frame 10.
2.2. C10orf10 在胶质瘤中的表达与WHO分级之间的关系
通过分析TCGA数据库中胶质瘤样本，对比WHO II级、III级、IV级C10orf10的mRNA表达水平，发现C10orf10 mRNA表达水平随WHO分级增高而上调(P<0.001，图2A)。同样在CGGA数据库的样本中，也证实C10orf10 mRNA转录水平随WHO分级增高而增高(P<0.001，图2B)。为进一步证实数据库中C10orf10的表达情况，本研究收集临床新鲜标本68例，进行real-time PCR分析，结果证实C10orf10 mRNA的表达水平随WHO分级增高而上调(P<0.05，图2C)。此外，分析CGGA数据发现C10orf10的表达与患者年龄、WHO分级、IDH1突变和1p/19q共缺失状态显著相关(分别P<0.05，P<0.001；表1)。
图2.
C10orf10 在胶质瘤中的表达与WHO分级之间的关系
Figure 2 Relationship between the expression of C10orf10 and WHO grade in glioma
Expression of C10orf10 increases with the increase of the grade of WHO in TCGA (A), CGGA (B), and clinical tissues (C). *P<0.05, ***P<0.001. C10orf10: Chromosome 10 open reading frame 10; TCGA: The Cancer Genome Atlas; CGGA: Chinese Glioma Genome Atlas.
表1.
CGGA数据库中胶质瘤组织中 C10orf10 表达与患者临床特征之间的关系
Table 1 Relationship between C10orf10 expression and clinical characteristics in patients with glioma based on CGGA
| Characteristic | Patients/ [No. (%)] | C10orf10 expression | P | Characteristic | Patients/ [No. (%)] | C10orf10 expression | P | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Low | High | Low | High | ||||||
| Gender | 0.1132 | IDH status | <0.0001 | ||||||
| Female | 182(44.1) | 99 | 83 | Mutant | 228(55.2) | 153 | 75 | ||
| Male | 231(55.9) | 107 | 124 | Wildtype | 185(44.8) | 53 | 132 | ||
| Age(year) | 0.0021 | 1p19q status | <0.0001 | ||||||
| <60 | 369(89.3) | 194 | 175 | Codel | 87(21.1) | 71 | 16 | ||
| ≥60 | 44(10.7) | 12 | 32 | Non-codel | 326(78.9) | 135 | 191 | ||
| Grade | <0.0001 | ||||||||
| WHO II | 96(23.2) | 64 | 32 | ||||||
| WHO III | 161(40.0) | 101 | 60 | ||||||
| WHO IV | 156(37.8) | 41 | 115 | ||||||
C10orf10: Chromosome 10 open reading frame 10; IDH: Isocitrate dehydrogenase; 1p19q: Chromosome 1 (Chr1p) and chromosome 19 (Chr19q); Codel: Codeletion.
2.3. C10orf10 表达与胶质瘤患者预后之间的关系
Kaplan-Meier方法分析结果显示：在TCGA数据库中，高表达C10orf10预示着患者预后较差；在II、III级的亚群中，其表达量越高预示着患者生存期越短(P<0.001，图3A~3D)。在CGGA数据库中，C10orf10的表达越高，则患者生存期更短，同样在III级亚群中其表达量也与预后显著相关(P<0.01，3E~3H)。在对68例临床标本及随访数据的分析中，发现C10orf10的表达量越高，患者的预后越差(P<0.05，图3I)。
图3.
C10orf10 表达量对胶质瘤患者生存期的影响
Figure 3 Effect of different C10orf10 expression levels on the survival of patients with glioma
High expression of C10orf10 predicts poor prognosis in TCGA (A-D), CGGA (E-H)，and clinical tissue (I). C10orf10: Chromosome 10 open reading frame 10; C10orf10 low: Low expression of C10orf10 in glioma patients; C10orf10 high: High expression of C10orf10 in glioma patients; TCGA: The Cancer Genome Atlas; CGGA: Chinese Glioma Genome Atlas.
2.4. C10orf10 的表达与胶质瘤进展及治疗之间的关系
为进一步了解C10orf10的表达与胶质瘤进展之间的关系，从而选取CGGA中原发性胶质瘤和复发性胶质瘤C10orf10的表达量进行分析，发现复发性胶质瘤中C10orf10的mRNA表达量显著高于原发性胶质瘤(P<0.001，图4A)。目前，TMZ是胶质瘤治疗中的一线化学治疗药物，为明确C10orf10的表达是否与化学治疗抵抗相关，于是选取CGGA数据库中使用TMZ治疗的患者进行分析。在使用TMZ治疗的患者中，C10orf10的表达越高，患者生存期越短(P<0.001，图4B)。
图4.
C10orf10 的表达与胶质瘤进展之间的关系
Figure 4 Relationship between the expression of C10orf10 and the progression of glioma
A: Expression of C10orf10 is significantly higher in recurrent glioma than that in primary glioma. B: The higher the expression of C10orf10 is, the shorter the survival of patients treated with TMZ is. ***P<0.001. C10orf10: Chromosome 10 open reading frame 10; TMZ: Temozolomide; CGGA: Chinese Glioma Genome Atlas.
2.5. C10orf10 的表达对胶质瘤细胞生长的影响
在胶质瘤U87-MG细胞系中，通过慢病毒技术构建2个不同序列的shRNA稳定细胞系(图5A、5B)。采用CCK-8(图5C)和克隆形成实验(图5D、5E)，发现与shCtrl组相比，shC10orf10#1组和shC10orf10#2组在细胞数和细胞活力上差异均有统计学意义(均P<0.01)，敲除C10orf10后能够显著抑制胶质瘤细胞增殖和克隆形成的能力。在低氧环境中，CCK-8实验显示：与shCtrl组相比，shC10orf10#1组和shC10orf10#2组在细胞活力上差异均有统计学意义(分别P<0.05，P<0.001)，在低氧环境下C10orf10的表达抑制胶质瘤细胞的生长(分别P<0.05，P<0.001；图6)。
图5.
C10orf10 的表达对胶质瘤细胞系生长的影响
Figure 5 Effects of expression of C10orf10 on the growth of glioma cell lines
A: Expression of C10orf10 by Western blotting; B: Expression of C10orf10 by real-time PCR; C: Cell viability in U87-MG cells after the knockdown of C10orf10 by CCK-8 assay; D: U87-MG cells after the knockdown of C10orf10 by colony formation assay; E: Colony formation in glioma cells inhibited by knockdown of C10orf10. **P<0.01, ***P<0.001 vs the shCtrl group. C10orf10: Chromosome 10 open reading frame 10; shCtrl group: Negative control group.
图6.
C10orf10 在低氧条件下对胶质瘤细胞生长的影响
Figure 6 Effects of C10orf10 expression on the growth of glioma cell under hypoxia treatment
The CCK-8 assay is performed to assess the cell viability in U87-MG cells after the knockdown of C10orf10 under hypoxia for 72 h. *P<0.05, ***P<0.001. C10orf10: Chromosome 10 open reading frame 10.
3. 讨 论
近年来，与胶质瘤发生、发展的相关分子的研究[11-13]不断获得进展，但胶质瘤患者的预后尚未得到显著改善，故进一步探索和研究胶质瘤的潜在治疗分子靶点和预后分子标志物显得十分重要。低氧微环境是实体肿瘤中普遍存在的现象，胶质瘤是中枢神经系统最常见的实体恶性肿瘤[8]。因此，探讨低氧微环境下胶质瘤发生、发展过程中的基因表达变化具有重要的意义。本研究利用GEO筛选出胶质瘤细胞在低氧条件下上调的C10orf10基因，并在胶质瘤细胞实验中得到验证，表明C10orf10的表达在胶质瘤中能够受低氧调控。同时在其他的研究[14]中发现C10orf10也是受低氧环境调控，故进一步证实C10orf10是受低氧通路调控的重要成员之一。
有研究[15]表明C10orf10是相关肿瘤的重要预后分子。本研究中体外细胞实验证实C10orf10能够促进胶质瘤细胞的生长，同时在低氧环境中也证实C10orf10的表达能够影响胶质瘤细胞的生长，表明C10orf10在低氧环境下受到调控，并且在低氧下也能影响细胞的生长，其可能与缺氧耐受相关。WHO分级是当前评判胶质瘤恶性程度的主要方法并已得到公认，其级别越高代表恶性程度越大[4]。C10orf10的表达量随着WHO分级增高而上调，表明C10orf10在胶质瘤中可发挥促癌基因作用。通过TCGA、CGGA以及临床标本和随访数据分析，发现C10orf10的表达量与胶质瘤患者的生存期相关。进一步分析发现，C10orf10在复发性胶质瘤中的表达量较原发性胶质瘤高，且在TMZ治疗患者中其表达量与生存期相关，从而说明C10orf10的表达与胶质瘤的进展和治疗抵抗相关。因此，C10orf10的表达与胶质瘤患者的预后相关。
目前，已知C10orf10发挥相关作用的机制主要通过调控细胞自噬来实现。如在神经母细胞瘤的研究[9, 15]中，发现C10orf10通过调控细胞的自噬，进而促进神经母细胞的发生、发展。在一些非肿瘤的研究[16-17]中，也发现其通过调控自噬来影响其生物学功能。自噬能够实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新，可维持细胞内稳态的生命活动[18]，但自噬在肿瘤的发生、发展中扮演促癌还是抑癌的作用尚不明确。一方面，自噬是正常细胞生命活动所必需的一个过程，自噬水平低下可导致细胞癌变；另一方面，在晚期肿瘤中，自噬又对肿瘤起促进作用[19]。同时，自噬也可以参与调控肿瘤对化学治疗或放射治疗等不同抗癌疗法的耐药[20]。本研究发现C10orf10在胶质瘤中可发挥促癌基因作用，但是其具体机制有待进一步研究，而自噬有可能是其主要的作用机制之一。
综上所述，C10orf10在胶质瘤中的表达与胶质瘤的恶性程度相关，其表达量与胶质瘤的预后有关，表明C10orf10是胶质瘤的一个潜在的分子标志物及分子治疗靶点。虽然本研究首次证实了C10orf10在胶质瘤中发挥促癌基因作用，但其具体分子作用机制仍需要进一步研究。
基金资助
国家自然科学基金(82160554)；湖南省自然科学基金(2020JJ8051)。
This work was supported by the National Natural Science Foundation (82160554) and the Natural Science Foundation of Hunan Province (2020JJ8051), China.
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
作者贡献
陈远兵、唐淼 实验操作，统计分析，论文撰写与修订；李晖 协助实验，统计分析；黄军 实验设计和指导，论文修改。所有作者阅读并同意最终的文本。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202304499.pdf
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