含CD200的改良型Matutes免疫标志积分系统在诊断慢性淋巴细胞白血病中的应用

Abstract

Objective

Immunophenotyping technique is a powerful tool for the diagnosis and differential diagnosis of chronic lymphocytic leukemia (CLL) and other B-cell chronic lymphoproliferative diseases (B-CLPD). CD200 is strongly expressed in CLL. This study aims to analyze the clinical value of modified Matutes score (MMS) containing CD200 in the diagnosis of CLL.

Methods

We retrospectively analyzed 103 B-CLPD patients diagnosed from January 2020 to July 2021, including 64 CLL patients, 11 follicular lymphoma (FL) patients, 14 mantle cell lymphoma (MCL) patients, 6 marginal zone lymphoma (MZL) patients, 1 hairy cell leukemia (HCL) patient, and 7 lymphoplasmic lymphoma/Waldenstrom macroglobulinemia (LPL/WM) patients. The expression of CD markers between the CLL group and the non-CLL group was compared, and the sensitivity, specificity, and clinical consistency of MMS and Royal Marsden Hospital (RMH) immunophenotyping score system were analyzed.

Results

There were significant differences in the expressions of CD5, CD23, FMC7, CD22, CD79b, CD200, and sIg between the CLL group and the non-CLL group (χ2 values were 37.42, 54.98, 30.71, 11.67, 55.26, 68.48, and 17.88, respectively, all P<0.01). When the RMH immunophenotyping score≥4, the sensitivity was 79.7%, and the specificity was 100%. When the MMS≥3, the sensitivity was 95.3%, and the specificity was 100%. The Kappa coefficient of RMH immunophenotyping system was 0.677, and the Kappa coefficient of MMS system was 0.860.

Conclusion

The MMS system containing CD200 has better sensitivity and same specificity compared with RMH immunophenotyping system, and MMS system may be more useful in the diagnosis of CLL.

慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是最常见的一种B细胞慢性淋巴增殖性疾病(B-cell chronic lymphoproliferative diseases，B-CLPD)。WHO将B-CLPD分为CLL、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)、边缘区淋巴瘤(marginal zone lymphoma，MZL)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)、淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症(lymphoplasmic lymphoma/Waldenstrom macroglobulinemia，LPL/WM)。它们在细胞形态、免疫表型及分子遗传学等方面有部分相似，但在治疗和预后上有明显差异。B-CLPD的诊断与鉴别诊断一直是临床工作中的难点，而免疫表型是该类疾病诊断的重要依据之一。CLL具有特殊的免疫表型，目前可根据指南使用英国马斯登皇家医院(Royal Marsden Hospital，RMH)免疫标志积分系统诊断并与其他B-CLPD进行鉴别。RMH免疫标志积分系统在诊断典型表型CLL中有较高的特异性，但是在诊断非典型CLL中能力不足。

近年来，对CLL的免疫表型的研究日益进步，特别是对于CD200这一新的免疫标志的研究日趋成熟，为CLL及其他B-CLPD的精确诊断提供了依据。2017年，意大利研究者^[1]报道了含CD200的改良型Matutes免疫标志积分(modified Matutes score，MMS)系统，MMS在诊断CLL方面有较好的敏感性和特异性。

本研究对103例B-CLPD进行分析，比较RMH免疫标志积分系统及MMS系统在CLL中的诊断效能、敏感性及特异性，以了解这两种免疫标志积分系统的差异，进一步评估含CD200的MMS在诊断CLL中的临床应用价值。

1. 资料与方法

1.1. 资料

收集2020年1月至2021年7月在中南大学湘雅医院血液科诊断为CLL及其他B-CLPD的103例患者的临床资料，包括免疫表型。其中女31例，男72例，年龄29~80(61.0±10.2)岁。临床最终诊断为CLL的64例，其他B-CLPD 39例(其中FL 11例、MCL 14例、MZL 6例、HCL 1例、LPL/WM 7例)。诊断标准参照《中国慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤的诊断与治疗指南(2018年版)》^[2]《Ｂ细胞慢性淋巴增殖性疾病诊断与鉴别诊断中国专家共识(2018年版)》^[3]，以及美国国家综合癌症网络临床实践指南《B细胞淋巴瘤》^[4]《慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤》^[5]。本研究获得中南大学湘雅医院临床医学伦理委员会批准(审批号：202206133)。

1.2. 试剂与仪器

鼠抗人单克隆抗体CD45-PerCP、CD19-PE-Cy7、CD10-APC、CD22-PE、CD20-APC-Cy7、HLA-DR-APC-Cy7、CD5-APC、CD23-PE、FMC7-FITC、CD79b-PE、CD200-APC、CD38-FITC、CD123-PE-Cy7、CD103-PE、CD25-PE、CD11c-PE，胞内Kappa-FITC、Lambda-PE试剂及各通道IgG阴性对照均为美国BD公司产品。FACS CantoⅡ(两激光6色)流式细胞仪和 BD FACS Diva Software软件为美国BD公司产品。

1.3. 标本的收集与检测

采集待检者EDTA抗凝骨髓或外周血标本3~5 mL，常温保存，并立即送湘雅医院血液科流式细胞学实验室检测。根据送检项目制订方案。样本前处理用PBS洗涤，加抗体，于室温避光孵育，加溶血素溶解红细胞，用PBS洗涤，通过流式细胞仪获取细胞，同时进行电压和补偿调节，一般每管获取10万个有核细胞。根据前向散射光(forward scatter，FSC)/侧向散射光(side scatter，SSC)和SSC/CD45对细胞进行设门分析，根据SSC/CD19选择CD19⁺的细胞，记录每个免疫标志的阳性细胞百分比。用阳性细胞百分比和平均荧光强度比(mean fluorescence intensity ratio，MFI)评价所测免疫标志的表达。使用同型对照抗体或自身阴性细胞群体作为阴性对照，CD表达率≥20%为阳性标准。在标本检测前，先用细胞计数设置和跟踪磁珠(cytometry setting and tracking beads，CST)校准，同时验证并确保各通道补偿调节正常，方可进行检测。

1.4. 免疫标志积分系统

RMH免疫标志积分系统标志及积分见表1 ^[3]。CD5⁺、CD23⁺、FMC7^-、sIg弱表达、CD22/CD79b^-或弱表达各积1分，通常CLL积分为4~5，其他B-CLPD积分为0~2，积分为3时建议进行荧光原位杂交技术等相关检查以排除其他B-CLPD。MMS系统标志及积分见表2 ^[1]。CD200⁺、CD5⁺、CD23⁺、sIg弱表达各积1分，通常CLL积分为3~4，其他B-CLPD积分为0~2。

表1.

英国马斯登皇家医院免疫标志积分系统

Table 1 Royal Marsden Hospital (RMH) immunophenotyping score system

免疫标志	积分
	1	0
CD5	阳性	阴性
CD23	阳性	阴性
FMC7	阴性	阳性
sIg	弱表达	中等/强表达
CD22/CD79b	弱表达/阴性	中等/强表达

表2.

改良型Matutes免疫标志积分系统

Table 2 Modified Matutes score system

免疫标志	积分
	1	0
CD5	阳性	阴性
CD23	阳性	阴性
CD200	阳性	阴性
sIg	弱表达	中等/强表达

1.5. 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。CLL组与非CLL组CD分子表达差异均采用χ²检验，使用受试者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲线比较两种系统诊断的敏感性及特异性，计算ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)。采用McNemar检验、Kappa系数分别评价RMH及MMS诊断结果与标准结果(临床诊断)的一致性，Kappa系数≥0.7表示吻合度较强，0.4≤Kappa系数<0.7表示吻合度一般，Kappa系数<0.4表示吻合度较弱。以P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 积分结果

在103名患者中，RMH免疫标志积分为4~5的有47例(CLL 47例)、3的有13例(CLL 10例，非CLL 3例)、0~2的有43例(CLL 7例，非CLL 36例)。MMS为3~4的有59例(CLL 58例，非CLL 1例)，0~2的有44例(CLL 6例，非CLL 38例)。

2.2. CLL组和非CLL组各免疫标志表达比较

CLL组和非CLL组CD5、CD23、FMC7、CD22、CD79b、CD200、sIg表达比较，差异均有统计学意义(χ²分别为37.42、54.98、30.71、11.67、55.26、68.48、17.88，均P<0.01；表3)。CLL组与其他B-CLPD组的CD表达差异详见表4。

表3.

CLL组和非CLL组各免疫标志表达比较

Table 3 Comparison of the expressions of CD markers between the CLL group and the non-CLL group

组别	n	免疫标志阳性/例
		CD5	CD23	FMC7	CD22	CD79b	CD200	sIg
CLL	64	60	58	11	38	12	59	29
非CLL	39	15	7	28	33	36	4	34
χ2		37.42	54.98	30.71	11.67	55.26	68.48	17.88
P		<0.001	<0.001	<0.001	0.001	<0.001	<0.001	<0.001

CLL：慢性淋巴细胞白血病。

表4.

CLL组和其他B-CLPD组各免疫标志的阳性率

Table 4 Positive rates of CD markers in the CLL group and other B-CLPD groups

组别	n	免疫标志阳性/[例(%)]
		CD5	CD23	FMC7	CD22	CD79b	CD200	sIg
CLL	64	60(93.75)	58(90.63)	11(17.19)	38(59.38)	12(18.75)	59(92.19)	29(45.31)
FL	11	0	4(36.36)	8(72.73)	11(100.00)	11(100.00)	2(18.18)	10(90.91)
MCL	14	13(92.86)	1(7.14)	11(78.57)	12(85.71)	12(85.71)	1(7.14)	12(85.71)
MZL	6	1(16.67)	1(16.67)	5(83.33)	5(83.33)	6(100.00)	0	5(83.33)
LPL/WM	7	1(14.29)	1(14.29)	4(57.14)	4(57.14)	7(100.00)	1(14.29)	7(100.00)
HCL	1	0	0	0	1(100.00)	0	0	0

CLL：慢性淋巴细胞白血病；B-CLPD：B细胞慢性淋巴增殖性疾病；FL：滤泡性淋巴瘤；MCL：套细胞淋巴瘤；MZL：边缘区淋巴瘤；LPL/WM：淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症；HCL：毛细胞白血病。

2.3. RMH免疫标志积分及MMS在诊断CLL中的 效能分析

ROC曲线结果显示：当RMH免疫标志积分≥3时，敏感性94.4%，特异性86.5%；RMH免疫标志积分≥4时，敏感性79.7%，特异性100%；RMH免疫标志积分=5时，敏感性49.1%，特异性93.4%。当MMS≥3时，敏感性95.3%，特异性100%；MMS=4时，敏感性52.8%，特异性100%。RMH免疫标志积分系统AUC值为0.968，MMS系统AUC值为0.972。RMH免疫标志积分系统Kappa系数为0.677，MMS系统Kappa系数为0.860(均P<0.001)，经McNemar检验提示两种系统诊断与临床诊断一致性较高。

3. 讨 论

虽然遗传学及分子生物学发展迅猛，但免疫表型仍是诊断与鉴别诊断B-CLPD的重要手段。使用复合免疫标志并结合病理形态、免疫组织化学、细胞遗传学等检测可以有效诊断B-CLPD。1990年代早期，英国RMH使用含5个免疫标志(CD5、CD22、CD23、FMC7、sIg)的免疫标志积分诊断CLL^[6]。几年后，他们将CD22替换成CD79b，进一步提升了诊断的准确性^[7]。

CD200属于白细胞分化抗原，是一种细胞表面的跨膜糖蛋白，与其受体(CD200R)均属于免疫球蛋白超家族。CD200在多种组织中广泛表达，包括中枢和外周神经系统、胸腺细胞、B细胞、滤泡树突细胞、内皮细胞、平滑肌细胞及卵巢细胞。CD200与CD200R相互作用后，可以提供负调控信号，诱导Th1型细胞因子向Th2型细胞因子“克隆转换”，引起免疫低应答，参与调节机体免疫^[8]。

CD200在CLL中高表达，在MCL中缺乏，被认为是区别CLL与MCL的标志^[9]。CD200的检查也广泛用于其他淋巴细胞增殖性疾病。Sorigue等^[10]系统性回顾分析了27项研究共计5 764名B-CLPD患者，在3 208例CLL中，95%为CD200阳性，不管是经典还是非经典CLL，其CD200表达无差异；在1 180例MCL中，8%为CD200阳性，并且主要是在惰性的、非淋巴结性MCL中阳性表达；在99例MZL中，CD200阳性率为45%，其中主要为脾MZL(66例)，阳性率59%；91例LPL的CD200阳性率为80%；377例不能分类的淋巴增殖性疾病(unclassified lymphoproliferative diseases，uPLD)CD200阳性率为63%。CD200对HCL与变异性毛细胞白血病(variant hairy cell leukemia，vHCL)也有很好的鉴别作用，前者CD200强阳性，后者CD200阴性。此外，在FL、LPL、MZL中，CD200在不同研究中有不同程度的表达^[11]。Debord等^[12]认为，在CLL和HCL中，CD200为强阳性，在MZL和v-HCL中为阳性，在LPL/WM和FL中一般为阳性，也可以为阴性，而在B幼淋巴细胞白血病(prolymphocytic leukaemia，PLL)中一般为阴性，也可以为阳性。CLL及HCL的CD200荧光强度明显高于FL、MCL、LPL、PLL、MZL、vHCL^[13-15]。CD200的高表达使其成为一个可能的治疗靶点。在CLL小鼠模型中，予以抗CD200的抗体后几乎可以完全抑制肿瘤的生长^[16]。2019年，临床试验(NCT00648738)^[17]使用抗CD200单克隆抗体(Samalizumab)治疗23名复发难治的CLL患者，降低了部分患者的肿瘤负荷。这些结果表明针对CD200的单克隆抗体可能是CLL患者新的治疗选择。

基于CD200在CLL中的高表达及其潜在的治疗靶点价值，许多研究者联合其他免疫表型构建积分系统，为CLL的诊断提供依据。如：Arlindo等^[15]将CD200联合CD123，CD43及CD52来进行B-CLPD的诊断评估。Hoffmann等^[18]将CD200、CD43联合RMH积分系统对CLL进行诊断及鉴别诊断。Köhnke等^[19]认为在CLL中CD200有很好的敏感性及特异性。2018年，D’Arena等^[1]利用含CD200的MMS系统对CLL进行诊断，CD200⁺、CD5⁺、CD23⁺、sIg弱表达各计1分，CLL积分为3~4，其他B-CLPD积分为0~2；与RMH积分系统比较，有更高的敏感性，同样的特异性。以上研究均表明，含有CD200在内的免疫积分系统，改善了CLL诊断的敏感性，同时保留了特异性，具有更好的诊断价值，与本研究结果类似。CD200作为一种非常有价值的免疫标志，应纳入CLL的诊断体系中。其中MMS系统选择的免疫标志组合临床普遍可及、方法简单，具有很好的推广性。

本研究比较了RMH免疫标志积分及MMS系统中CD5、CD23、FMC7、CD22、CD79b、CD200、sIg在CLL与非CLL患者中的表达，发现它们的差异有统计学意义。但是具体到某一种疾病、某一个CD分子，表达阳性率高低各有不同。没有任何一个分子特异性地在某一种疾病中表达，没有任何一种单一标志能对单一疾病做出诊断。故联合几种免疫标志构建敏感性、特异性良好的诊断系统十分重要。本研究将包含CD200的MMS与RMH免疫标志积分系统进行比较：当RMH≥3时，敏感性不低，但是特异性较低；RMH≥4时，敏感性明显降低，特异性高；而MMS≥3时，兼具较好的敏感性及特异性。结果与D’Arena等^[1]的结果类似。RMH免疫积分系统Kappa系数0.677，MMS系统Kappa系数0.860，也进一步说明MMS的诊断结果与临床诊断有更好的一致性，提示将在CLL中普遍高表达的标志CD200纳入CLL的诊断系统是一个很好的选择。MMS系统与RMH免疫标志积分系统相比，特异性相同，敏感性提高，并且积分的方式简单方便，可操作性强，容易掌握，值得临床推广。

综上，免疫表型是诊断与鉴别诊断B-CLPD的重要依据之一，在进行B-CLPD的诊断与鉴别诊断时，综合分析几种关键免疫表型表达情况，有利于提高诊断的敏感性和特异性，必要时还可联合形态学、细胞和分子遗传学等检查。CD200是一种非常有价值的诊断标志，是未来潜在的治疗靶点，包括CD200在内的免疫标志积分系统在诊断CLL上有很好的应用前景。后续还应不断研究新的免疫标志并进行组合分析，以期为CLL的精确诊断提供更好的积分系统。

基金资助

萍乡市科技计划项目(2019PY024)。

This work was supported by the Science and Technology Project of Pingxiang, China (2019PY024).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

李文锦 数据分析，论文撰写与修改；方鹏、梁慧 数据采集；傅敢 论文审阅、修订；彭敏源 论文构想、设计、审阅。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2022121689.pdf