基于胶质瘤细胞来源胞外囊泡制作的仿生纳米材料在靶向递送STAT3-siRNA中的作用

Abstract

Objective

Glioma is the most common primary intracranial tumor and there is still no ideal treatment at present. Gene therapy, as one of the new methods for treating glioma, has attracted attention in recent years. But its application in treating glioma is very limited due to lack of effective delivery vectors. This study aims to investigate the feasibility of biomimetic nanomaterials made from glioma cells-derived extracellular vesicles (EV) for targeted delivery of signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3)-small interfering RNA (siRNA) in treating glioma.

Methods

First, U251 glioma cells-derived extracellular vessel (EVU251) was extracted by ultra-centrifugal method. Nanoparticle tracking analysis was used to characterize the particle size distribution, the transmission electron microscope was used to analyze the morphology, and Western blotting was used to verify the expression of srface characteristic protein. The homing ability was verified by cell uptake assay after labeling EVU251 with membrane dye kit PKH67; the EVU251 contents were removed by a low permeability method and then EVMU251 was prepared through a microporous membrane. Finally, the biomimetic nanomaterials EVMU251@STAT3-siRNA were prepared by loading STAT3-SiRNA with electro-dyeing method. The real-time quantitative PCR was used to quantify the successful encapsulation of siRNA, and the encapsulation and drug loading rate was calculated; then Cy5-labeled siRNA was used to evaluate the ability of biomimetic nanomaterials (EVMU251@CY5-siRNA) to target U251 cells. Lysosomal escape ability of the biomimetic nanomaterial was evaluated by lysosomal dye lyso-tracker green. At last, the ability of EVMU251@STAT3-siRNA to knock down STAT3 gene and selective killing of U251 cells was detected by cell experiments in vitro.

Results

The size of EVU251 ranged from 50 nm to 200 nm with a natural disc shape. The expression of extracellular vesicle marker proteins could be detected on the membrane of EVU251. The cell uptake assay demonstrated that it had homing ability to target U251 cells. After EVU251 was prepared as EVMU251@STAT3-siRNA, the particle size was (177.9±5.0) nm, the siRNA loading rate was (33.5±2.2)% and the drug loading rate was (3.24±0.21)%. The biomimetic nanomaterial EVMU251@STAT3-siRNA still had the ability to target U251 cells and successfully deliver siRNA to the cytoplasm without lysosomal degradation. The EVMU251@STAT3-siRNA can effectively knock down the expression of STAT3 gene and produce selective killing ability in U251 cells.

Conclusion

The biomimetic nanomaterials EVMU251@STAT3-siRNA made from glioma U251 cells-derived extracellular vesicles can knock down STAT3 gene of U251 cells and produce selective killing effect, which can provide a new idea for the treatment of glioma.

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，目前胶质瘤的治疗手段是手术切除后进行放射治疗(以下简称放疗)以及使用替莫唑胺(temozolomide，TMZ)进行化学治疗(以下简称化疗)等辅助治疗，然而这些治疗方法无法达到满意的效果。首先，由于胶质瘤具有很强的侵袭性，它们可以在脑实质中呈高度浸润性生长，这导致了外科手术难以将其完全切除^[1-2]。其次，放疗在胶质瘤治疗中的作用也非常有限。低级别胶质瘤是一种恶性程度较低的胶质瘤，约占中枢神经系统肿瘤的10%。有研究^[3]表明增大放疗的剂量不能延长低级别胶质瘤患者的生存期，并且由于大脑器官的特殊性，过大的放疗剂量会使患者出现严重的疲劳、不适、失眠以及情绪功能恶化等副作用。因胶质瘤组织的微血管增生明显，化疗药物通过静脉系统能有效地被递送到肿瘤组织的微血管。然而，中枢神经系统中存在一种独特的血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)，它在保护脑组织的同时，严重限制了化疗药物从循环系统进入颅内，从而使其不能在胶质瘤中达到有效浓度，从而难以发挥治疗效果^[4]。因此，寻找一种行之有效的胶质瘤治疗方法十分迫切。

近年来，基因治疗正逐渐成为胶质瘤治疗的新方法，这种方法通过将治疗用的遗传物质传送到肿瘤细胞中，从而产生特定的抗肿瘤效应^[2]。干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)是一种20~25个碱基对的双链RNA，当其进入胞质后能够选择性降解特定信使RNA、沉默指定基因表达并阻止蛋白翻译，是一种安全性高、免疫原性低、特异性好的基因治疗药物。但siRNA易被内源性酶降解，并且体积大(大约13 kD)、带有大量负电荷等特点使其无法跨过细胞膜，所以必须通过有效的载体递送才能使其进入靶细胞的胞质，从而启动基因沉默^[5]。

目前阳离子脂质类纳米材料是siRNA最有潜力的载体^[6]，但因其存在毒性高和无法透过BBB等问题，严重限制着它们在胶质瘤治疗中的应用。胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)是一种大多数细胞类型都可以分泌的纳米膜囊，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。值得注意的是，EV可以运输不同的生物分子(包括蛋白质和核酸等)，可逃避溶酶体的降解途径^[7]，从它们的亲本细胞运送到受体细胞的胞质，这使得它们天生具有作为siRNA递送载体的能力；并且EV具有高生物相容性、较强的稳定性和低免疫原性，对比传统的阳离子脂质体具有显著的优势^[8]。此外，由于EV含有整合素相关的跨膜蛋白CD47和膜锚定蛋白，这使得它们可以逃避体循环中单核细胞和巨噬细胞的吞噬^[9]，并且具有增强同型细胞特异性内吞的归巢能力^[10]，所以EV可以比合成载体拥有更长的体内循环时间，并能靶向特定组织。更重要的是，已有大量研究^[11-13]证实EV可透过BBB进入大脑，因此胶质瘤来源的EV有潜力成为靶向胶质瘤、递送siRNA的有效载体，但有碍于癌细胞来源的EV具有潜在的致癌风险，目前尚未有相关研究报道。

信号转导与转录活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)是经典致癌信号通路中重要的信号转导蛋白，其中STAT3已被研究^[14]证明为抗癌靶点，通过抑制其活性，能选择性杀伤癌细胞。本研究利用人类神经胶质瘤细胞U251来源的EV制备仿生纳米材料，以其包载STAT3-siRNA，靶向U251细胞，从而实现精准基因治疗。研究使用超速离心法分离得到U251来源的EV(U251 glioma cells derived EV，EV_U251)，证明其具有靶向U251细胞的归巢能力；然后去除其致瘤性内容物并将其制备为基于U251来源的EV纳米粒子EV_U251囊泡(U251 glioma cell derived EV memberane，EVM_U251)；再通过电转染法包载STAT3-siRNA制备仿生纳米药物EVM_U251@STAT3-siRNA。EVM_U251@STAT3-siRNA保留了EV_U251的归巢特性，能够将STAT3-siRNA靶向递送至U251细胞并产生选择性杀伤作用，这可为胶质瘤提供一种有希望的治疗方法。

1. 材料与方法

1.1. 材料

1.1.1. 试剂与耗材

PBS、胎牛血清、细胞培养基等购自美国Gibco公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)购自日本Dojindo Laboratories公司；反转录试剂盒、real-time PCR试剂盒购自美国GeneCopoeia TRIzol公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、苯甲基磺酰氟(phenylmethysulfonyl fluoride，PMSF)蛋白酶抑制剂、绿色溶酶体示踪剂购自上海碧云天生物技术有限公司；膜染料试剂盒PKH67购自美国Sigma公司；SDS、三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自德国BioFroxx公司；BCA试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；TSG101抗体、CD9抗体购自美国Abcam公司；上样缓冲液、一抗稀释液、快速转膜液、快速封闭液购自苏州新赛美生物科技有限公司；ECL超敏显影液购自美国Santa Cruz公司。

1.1.2. 仪器

纳米粒子追踪分析仪(nanoparticle tracking analysis，NTA)购自英国Malvern公司；MicroPulser电穿孔仪购自美国Bio-Rad公司；XPN-100超高速离心机购自美国Beckman Coulter Optima公司；5804R低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；Quant Studio 5 qPCR仪购自美国Applied Biosystems公司；TM100普通PCR仪购自美国Bio-Rad公司；Multiskan FC酶标仪、YZB/USA7322低温保存箱购自上海赛默飞世尔仪器有限公司；G260-300透射电子显微镜购自美国Titan公司；PerkinElmer Operetta CLS^TM高内涵成像系统购自美国PerkinElmer公司；SB-5200DT超声清洗器购自中国宁波新芝生物股份有限公司；Binder CB 37 ℃恒温培养箱购自德国Binder公司；无菌操作台、YXQ-LS-50G高压蒸汽灭菌锅购自上海博迅实业有限公司；LAS-500凝胶成像系统购自美国General Electric公司。

1.1.3. 细胞

人类神经胶质瘤细胞系U251和人胚肾细胞系293T购自中国科学院上海细胞库。

1.2. 方法

1.2.1. U251胶质瘤细胞来源EV的提取与表征

首先制备无EV胎牛血清。提前将胎牛血清解冻，倒入超高速离心机专用离心管中，每管质量差不超过0.01 g，于4 ℃以 150 000 g离心16 h以上。离心结束后，将血清吸出，并用0.22 μm的滤器对血清进行过滤除菌处理，1周内使用可置于4 ℃保存，需要长时间使用则储存于-20 ℃保存。用无EV胎牛血清配制的细胞完全培养液培养U251细胞1周后，收集含有EV_U251的培养基。采用超速离心法提取EV_U251，该步操作于无菌条件完成。将收集的培养基于4 ℃以300 g离心10 min，取上清液并以2 000 g继续于4 ℃离心20 min，收集上清液。将收集的上清液倒入超高速离心机专用离心管，以150 000 g于4 ℃离心 2 h，小心吸去上清，向沉淀中加入适量的PBS重悬，继续以150 000 g离心率于4 ℃离心2 h，小心吸去上清液，沉淀即为EV_U251，用0.2 mL PBS重悬，得到的EV溶液短期使用于4 ℃保存，长期使用于-20 ℃保存。

为了检测EV_U251的浓度和水合直径，将100 μL EV_U251稀释到1 mL，并通过纳米粒子追踪分析仪进行分析。收集约10⁸个EV_U251，冻干后重为0.5~1.0 mg。将EV_U251使用磷钨酸染色后，用透射电镜观察EV_U251的形态。

为了在体外检测EV_U251，将PKH67修饰到其外膜上。操作如下：在500 μL PBS(pH值7.4)中，将5 μL 1 mg/mL PKH67溶液加入10⁸个EV_U251中，在漩涡震荡仪上混匀后孵育0.5 h。之后以150 000 g离心4 h收集PKH67标记的EV_U251(PKH67-EV_U251)，去除游离PKH67，最后用PBS重悬。

1.2.2. EVM_U251@STAT3-siRNA的制备与表征

采用低渗法去除EV_U251致瘤性内容物。具体操作如下：将收集到的EVs加入低渗缓冲液(2 mmol/L Tris，1 mmol/L MgCl₂和1 mmol/L KCl)中，其中含有蛋白酶抑制剂，并在4 ℃中保存过夜。悬浮液以150 000 g于4 ℃下进一步离心4 h。收集到沉淀在PBS中重新分散，然后进行超声处理，通过微孔膜(孔径为200 nm)挤压形成均匀的悬浮液制得EVM_U251。

为了装载STAT3-siRNA，根据以下步骤使用基因脉冲X细胞电穿孔系统进行电穿孔：将EVM_U251和siRNA以质量比10꞉1混合在电穿孔缓冲液[1.15 mmol/L磷酸钾(pH 7.2)，25 mmol/L氯化钾，21%密度梯度离心液Optiprep]中，电穿孔仪参数选用400 V和125 μF，电穿孔后立即转入冰中。用动态光射散系统测定新制备纳米颗粒的粒径。为了测量STAT3-siRNA电穿孔至EVM_U251@STAT3-siRNA的数量，将其超滤后去除上清液中游离的siRNA，使用real-time PCR对成功包载的siRNA进行定量分析。并根据下列公式计算EVM_U251@STAT3-siRNA的siRNA包载率和载药率。siRNA包载率=成功包载siRNA的量/siRNA总投料量×100%；siRNA载药率=(成功包载siRNA的量/成功包载siRNA的量+EV投入量)×100%。

1.2.3. 蛋白质印迹法

首先将蛋白质变性，按照1꞉4加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液中，并用振荡器进行混匀，加热至100 ℃变性10 min，完成后立即将样品转移至冰上冷却。在电泳槽中安装好事先配置的凝胶并加入电泳液，在上样孔中依次加入蛋白质标志物和30~50 μg的蛋白质样品。使用80 V恒定电压浓缩蛋白，大约 30 min后使蛋白质进入分离胶，切换至120 V恒定电压分离蛋白质，待样品跑至凝胶底部后停止电泳分离。根据目的蛋白质分子量切割凝胶，并置于快速转模液事先润湿的下层滤纸板上，裁剪出与凝胶大小匹配的PVDF膜并用甲醇活化5~10 s，活化完成后将PVDF膜覆盖在切割后的凝胶上，再将上层滤纸板及海绵垫放下，形成夹心三明治结构，以恒定电流 400 mA转膜30~50 min。转膜结束后，将PVDF膜用TBST缓冲液漂洗后放入快速封闭液中，在水平摇床上室温封闭20 min。完成封闭后，按照蛋白质标志物对应的分子量裁剪所需要的条带并进行标记，放入相应的一抗工作液中，置于摇床在4 ℃下孵育过夜，完成后用TBST洗膜3次，每次10 min。之后进行相应种属的二抗孵育，于水平摇床上慢摇2 h，孵育完成后，吸走二抗，用TBST继续洗膜3次，每次 10 min。完成抗体孵育后滴加发光液，使用凝胶成像仪成像。

1.2.4. 细胞成像研究

取对数生长期的U251或293T细胞，以5×10³/孔的浓度接种于96孔板中，于5% CO₂、37 ℃培养箱中贴壁24 h，使用红色荧光基团CY5修饰的siRNA制备EVM_U251@CY5-siRNA，并加入细胞中孵育2 h，在溶酶体逃逸实验中孵育时间为4 h，最后用生理盐水清洗细胞，并使用高内涵成像系统进行细胞荧光成像。

1.2.5. Real-time PCR测定STAT3 mRNA的表达

将U251细胞以2×10⁵/孔密度接种于6孔培养板中，培养过夜。实验分为对照组、EVM_U251组、EVM_U251@siSTAT3(50 μg/mL)组和EVM_U251@siSTAT3(100 μg/mL)组，按照组别进行相应的换液和干预。于37 ℃、5% CO₂培养箱恒温培养48 h，吸走培养基，用预冷的PBS缓冲液清洗2~3次，每孔加入适当体积的TRIzol裂解液，按照流程提取总RNA并用反转录试剂盒按照说明书反转录为cDNA，然后以cDNA为模板进行real-time PCR检测，以β-actin为内参。实验的目的基因和内参引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，STAT3正向引物5'-CTCTTACTTC-TCCAGCAACACT-3'，反向引物5'-ATACATGCTAC-CTAAGGCCAT-3'；β-actin正向引物5'-TAGTTGCG-TTACACCCTTTCTTG-3'，反向引物5'-TCACCTTC-ACCGTTCCAGTTT-3'。每个样品设3个复孔，反应总体系10 μL。PCR反应条件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40个循环。然后对相应数据进行分析，各目的基因表达水平用荧光实时定量值(real-time quantitative，RQ)值来表示，RQ值计算公式为RQ=2^-ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt_实验组-ΔCt_对照组。在细胞实验中，EV_U251浓度为100 μg/mL，EVM_U251@STAT3-siRNA浓度为50 μg/mL和100 μg/mL。

1.2.6. 细胞毒性研究

取对数生长期的U251或293T细胞，以5×10³/孔的浓度接种于96孔板中，于5% CO₂、37 ℃培养箱中贴壁24 h，随后加入用无血清培养基稀释的纳米药物，培养箱中孵育72 h。吸去培养基，加入CCK-8工作液孵育2 h，用酶标仪测量其450 nm处吸光度值，并计算细胞生存率。在细胞实验中，EV_U251浓度为 100 μg/mL，EVM_U251@STAT3-siRNA浓度为50 μg/mL和100 μg/mL。

1.3. 统计学处理

使用GraphPad Prism 7软件进行统计学分析。数据用均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析，统计图的绘制采用Graph Pad Prism 7.0。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. EV_U251 的表征及归巢能力的验证

透射电镜和纳米粒子追踪分析仪的结果显示(图1A和1B)：EV_U251呈天然的圆盘形态，大小为50~200 nm，峰值为124 nm。可见EV_U251中EV标志蛋白肿瘤易感基因101蛋白(tumor susceptibility gene 101 protein，TSG101)和CD9蛋白的表达(图1C)。细胞摄取实验显示U251细胞对PKH67-EV_U251(携带绿色荧光的EV_U251)的摄取明显强于293T细胞(图1D)。

图1.

EV_U251 的表征及其归巢能力的验证

Figure 1 Characterization of EV_U251 and verification of its homing ability

A: Characterization of EV_U251 by transmission electron microscopy; B: Nanoparticle tracking analysis of EV_U251; C: Protein expressions of TSG101 and CD9 in EV_U251; D: Uptake of EV_U251 by U251 cells and 293T cells. PKH67 dye labels the location of EV_U251 (green), Hochest labels the nucleus (blue). Mergy represents the overlay plot.

2.2. EVM_U251@STAT3-siRNA的制备与表征

将EV_U251内容物中的RNA和蛋白质去除后，总RNA量为未去除前的(9.3±1.5)%，总蛋白质的质量为未去除前的(38.1±4.9)%(图2A)。随后使用real-time PCR对包载后进入EVM_U251的STAT3-siRNA进行定量，测得的STAT3-siRNA包载率为(33.5±2.2)%。动态光射散系统检测到的EVM_U251@STAT3-siRNA粒径为(177.9±5.0) nm(图2B)。EV_U251与EVM_U251@STAT3- siRNA的表面电势分别为(-21.5±0.7)和(-22.8±0.9) mV，差异无统计学意义(P>0.05，图2C)。

图2.

EVM_U251@STAT3-siRNA的表征

Figure 2 Characterization of EVM_U251@STAT3-siRNA

A: Analyses of total protein and RNA of EV_U251 andEVM_U251; B: Size distribution of EVM_U251@STAT3-siRNA; C: Analysis of zeta potential of EVs and EVM_U251@STAT3-siRNA. POI: Polydiseperse index.

2.3. EVM_U251@STAT3-siRNA具有靶向U251细胞 及溶酶体逃逸能力

EVM_U251@CY5-siRNA具有靶向U251细胞和递送siRNA的能力，U251细胞中的CY5荧光信号(红色)远多于293T细胞。U251细胞的胞质中溶酶体染色显示：CY5(红色)和溶酶体探针(绿色)重叠率为(46.5±4.7)%(图3)。

图3.

EVM_U251@STAT3-siRNA在靶向U251细胞中的作用及溶酶体的逃逸能力

Figure 3 Effect of EVM_U251@STAT3-siRNA on the targeting U251 cells and the escape ability of lysosomal

A: Uptake of EVM_U251@STAT3-siRNA in 293T cells. B: Uptake of EVM_U251@STAT3-siRNA in U251 cells. CY5 dye lables the siRNA (red), and Hochest labeles the nucleus (blue). C: Study on the lysosomal escape ability of EVM_U251@STAT3-siRNA. Lysosomal tracker labeles the lysosome (green). Overlap rate=(46.5±4.7)%.

2.4. EVM_U251@STAT3-siRNA对癌细胞U251中的STAT3敲低作用以及特异性细胞杀伤作用

在分别用浓度为50和100 μg/mL的EVM_U251 @STAT3-siRNA处理后，U251细胞中的STAT3 mRNA表达水平均显著降低，分别敲低至(53.4±0.6)%和(28.3±7.9)%(图4A)。细胞毒性结果显示：50和100 μg/mL的EVM_U251@STAT3-siRNA均能对U251细胞产生显著杀伤作用，细胞存活率分别为(59.5±4.8)%和(18.7±5.0)%；相反，50 和100 μg/mL的EVM_U251@STAT3-siRNA对正常细胞293T的杀伤作用不明显，细胞存活率分别为(87.5±2.2)%和(72.6±2.1)%(图4B)。

图4.

EVM_U251@STAT3-siRNA对U251细胞的STAT3敲低作用及特异性杀伤作用

Figure 4 STAT3 knockdown and selective killing effects of EVM_U251@STAT3-siRNA on U251 cells

A: STAT3 mRNA in U251 cells by real-time PCR after incubating with various formulations. *P<0.05, **P<0.01 vs the control group. B: Cell viability of U251 and 293T cells cultured with various formulations after 72 h, respectively.

3. 讨 论

EV作为细胞间天然的信号传递工具，具有体内稳定性高，免疫原性小，逃避吞噬以及归巢能力等优势，已被作为药物载体进行了广泛的研究。有研究^[15-16]证明EV可能含有整合素相关的跨膜蛋白CD47，它能介导避免吞噬的信号，从而有更长的体内循环时间^[9]。而EV固有的各种膜锚定蛋白、细胞黏附分子和肿瘤特异性配体则赋予了它们靶向起源细胞的归巢能力^[13]。此外，已有证据^[7]证明EV能逃避溶酶体降解途径，是核酸药物理想的载体。利用癌细胞来源的EV包载治疗性siRNA，从而靶向杀伤肿瘤细胞会是个不错的策略。癌细胞来源EV运输的内容物在肿瘤发生、发展中发挥了重要作用，如建立转移前生态位、促进血管生成、破坏腹膜或BBB、诱导耐药和癌症相关成纤维细胞异质性的形成等^[17]。这使得研究者们很难将癌细胞来源的EV与癌症治疗载体联系起来。在此，作者采用低渗法破膜，从而去除U251来源的EV中所有的内容物以去除其致瘤性，用超速离心法收集破损的膜后，重新整粒制得EVM_U251。EVM_U251保留了EV作为药物载体稳定性高、免疫原性小、能靶向U251细胞的优势。

EV包载外源性物质的方法目前一共有4种，分别为电转染法、超声法、直接转染和细胞工程^[18]。它们都是有效的策略，但在产品质量与可放大性方面有较大差异。超声法操作简单、易扩大生产规模，它能有效包载疏水性药物，但它只限于包载小分子，并且可能将药物黏附在表面不利于其缓释，此方法不能用于包载核酸。使用转染试剂直接对EV转染治疗性核酸是一种可行的方法，但这种方法可能重构EV膜，扰乱其传递功能或引起免疫原性。利用细胞工程将EV载入外源性核酸，则过于耗时且操作难度大。电转染法包载外源性核酸也存在如下问题：1)核酸的大小严重限制包封率。由于电穿孔大小限制，电转染包载过大的核酸会使其包载率严重下降。2)核酸的沉淀和降解。3)对EV的表面电势、胶体稳定性和某些生物分子可能有不良影响。4)扩大生产规模有困难等。但目前实验室用EV包载治疗性siRNA最简单有效的方法仍是电转染，有研究^[19]证明在电转染液中加入EDTA能有效避免核酸的沉降问题，siRNA的包载率较高。在本研究中，利用电转染法以约32.7%的包载率将治疗性核酸STAT3-siRNA载入EVM_U251，验证了制备的仿生纳米药物EVM_U251 @STAT3-siRNA的稳定性良好，并且仍保留了U251细胞来源的EVs的归巢能力。

肿瘤的发生、发展往往涉及多个异常基因，因此一般来说基因治疗癌症相对困难，但如果找到合适的靶点，利用基因治疗能够有效治疗癌症。目前肿瘤信号通路包括Ras(一个保守癌基因族的产物)-丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B信号通路。而STAT是其中最重要的信号转导蛋白，这一蛋白家族包括7种不同的蛋白，即STAT1~4、STAT5A、STAT5B以及STAT6。这些蛋白既能够作为信号分子传递质膜信号，也能够作为核转录因子激活一系列基因，这其中就包括很多能导致细胞恶性转化的潜在致癌基因。STAT3最早被证明与致癌基因有关，已有证据^[14]证明抑制STAT3作为抗癌策略是可行的，抑制其信号只会杀死肿瘤细胞而对正常组织细胞没有影响。本研究使用仿生纳米药物EVM_U251@STAT3-siRNA对U251和293T细胞进行了毒性实验，结果证明该纳米药物在浓度为100 μg/mL、孵育72 h条件下可有效杀伤U251细胞(杀伤率约为81.3%)，而对正常细胞细胞杀伤作用不明显(杀伤率约为27.4%)。

综上所述，本研究利用U251细胞来源的EV，再用低渗去除其致癌内容物后，采用电转染法装载STAT3-siRNA制备仿生纳米药物EVM_U251@STAT3-siRNA。该材料保留了EV_U251稳定性和靶向U251的归巢能力，能够有效敲低STAT3 mRNA的水平和选择性杀伤U251细胞，可为胶质瘤药物治疗提供一个有希望的策略。

基金资助

国家自然科学基金(81872919，82070857)。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81872919, 82070857).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

胡敦 实验操作及论文起草；李鑫 数据分析；聂盛丹 最终版本修订；王珊 研究思路的提出，研究方案的设计。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2022121646.pdf