晚期糖基化终末产物对成骨细胞自噬能力的影响

Abstract

Objective

Excessive production of AGEs in diabetic patients will affect the normal function of osteoblasts, and this process may be related to autophagy of osteoblasts. This study aims to explore the effect of advanced glycation end products (AGEs) on autophagic activity during osteogenic differentiation in rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).

Methods

BMSCs were isolated and cultured in vitro, treated with different concentrations (0, 50, 100, 200, and 400 mg/L) of AGEs for different time (3, 6, 12, 24, 48, and 72 h). The proliferation activity was detected by CCK-8 method. The mRNA and protein expression levels of Beclin1 and LC3 in cells were detected by real-time PCR and Western blotting, respectively.The autophagic vacuoles were observed under the transmission electron microscope. The cells were treated with autophagy promoter rapamycin or autophagy inhibitor 3MA. After 7 days of osteogenic induction, we performed alkaline phosphatase (ALP) staining and real-time PCR to detect the mRNA expression levels of osteogenesis-related genes.

Results

In the low-concentration groups, the proliferation activity in BMSCs was increased (P<0.01), the mRNA and protein expressions of autophagy-related genes LC3 and Beclin1 were increased (both P<0.01). The number of autophagosome also was increased. In the high-concentration groups, the results were just the opposite. In the low-concentration groups, the ALP staining was deeper than that of the 0 mg/L AGEs group, and the mRNA expressions of the osteogenic related genes were increased (P<0.01). But the results were reversed in the presence of autophagy inhibitor 3MA. In the high-concentration groups, the ALP staining was lighter than that of the 0 mg/L AGEs group, and the mRNA expressions of the osteogenic related genes were decreased (P<0.01). After the addition of the autophagy promoter rapamycin, the results were reversed.

Conclusion

Low concentration of AGEs can enhance the proliferative activity of BMSCs and promote osteogenic differentiation by accelerating autophagy. High concentration of AGEs can suppress the proliferation of BMSCs and inhibit osteogenic differentiation by reducing autophagy.

糖尿病是一种以血糖升高为特征的慢性代谢性疾病，可对机体多种重要靶器官造成损伤，引发众多并发症^[1]，骨质疏松症也是其中之一，主要表现为骨量减少、骨脆性增加，其具体发病机制还未完全明确^[2]。糖尿病患者体内血糖含量持续升高，会造成各种组织、器官的慢性损害、功能障碍，当波及到骨组织时，常导致骨质疏松^[3-4]。患者常无明显自觉症状，即使在未受外伤的情况下也可导致骨折^[5]，严重影响其生活质量。

晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是指蛋白质等大分子在没有酶参与下，通过非酶促糖基化反应自发地与葡萄糖或其他还原单糖反应所生成的稳定的共价加成物，糖尿病患者血糖长期控制不佳会导致AGEs过量生成^[6]。AGEs在骨骼中的过量累积，会影响成骨细胞的正常功能^[7]，是导致糖尿病性骨质疏松的重要因素之一^[8]。而其机制可能与成骨细胞自噬有关。细胞自噬是细胞将自身的一些蛋白质和细胞器包裹在特定的膜结构中，送入溶酶体降解，供细胞再次利用的过程，这一过程在真核生物细胞中广泛存在^[9]。AGEs可与蛋白质发生直接的交联作用引起细胞自噬水平的变化；AGEs与其受体——晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)结合后，激活细胞内一系列信号转导通路，引发细胞自噬活性的改变，影响成骨分化，导致骨质疏松^[10-11]。AGEs对BMSCs成骨分化的影响暂无文献报道。本实验拟研究不同浓度AGEs对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中自噬能力的影响，以期为探索AGEs对骨代谢异常中自噬的作用提供新思路。

1. 材料与方法

1.1. 试剂与动物

4周龄的SD大鼠购自重庆医科大学，雌雄不限，均按照重庆医科大学实验动物伦理委员会要求处置。AGEs购自北京博奥森生物技术有限公司；胎牛血清(FBS)购自阿根廷Natocor公司；DMEM/ F12培养基购自美国Hyclone公司；β-甘油磷酸钠、地塞米松、葡萄糖、抗坏血酸、3MA、碱性磷酸酶染色试剂盒均购自美国Sigma公司；0.25%胰酶、CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TRIzol Regent购自美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自美国Promega公司；雷帕霉素购自美国MedChemExpress公司。

1.2. SD大鼠BMSCs 的提取与培养

取4周龄SD大鼠3只，以脱颈法处死，用75%乙醇浸泡5 min，在超净工作台内剥离大鼠胫骨及股骨部分的皮毛及附着的肌肉组织，分离出大鼠胫骨及股骨，剪去干骺端，暴露骨髓腔，反复用4 ℃培养基(不含血清)冲洗骨髓腔，吹打混匀。分离骨髓血液中的BMSCs，放入含10% FBS的DMEM/F12培养基中，置37 ℃、5% CO₂的孵育箱中贴壁培养，24 h后进行半换液，48 h后进行全换液，此后每72 h换液1次。当BMSCs融合至90%时，用0.25%胰酶消化、离心，将第3代细胞作为实验细胞。

1.3. CCK-8法检测不同浓度AGEs对BMSCs增殖 活性的影响

当第3代BMSCs生长至70%~80%时，用0.25%的胰酶消化，随机分为5组，以5×10³个/孔的密度植于96孔板，各孔加入DMEM/F12低糖培养液(10% FBS)200 µL，于次日更换含AGEs质量浓度分别为0、50、100、200及400 mg/L的DMEM/F12低糖培养基，每组设置3个复孔，分别于加药后3、6、12、24、48及72 h行CCK-8检测。吸取各孔内的培养基，用PBS洗3次，每孔加入10 µL CCK-8液体，继续孵育4 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，取平均值，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制生长曲线图，纵坐标的值反映各组的细胞活性。

1.4. 透射电镜观察自噬体

用PBS清洗各组细胞3次，每次5 min，用0.25%的胰酶消化，离心收集细胞后立即用体积分数为2%戊二醛溶液于4 ℃固定，置于冰上并立即送至重庆医科大学电镜室。制片后，于透射电镜下用6 000倍随机观察各组10个细胞的自噬体形成情况并计数。

1.5. Real-time PCR技术检测自噬相关基因和成骨相关基因的mRNA表达

根据美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中SD大鼠自噬相关基因Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，成骨分化相关基因RUNX2、ALP、OPN、OCN及GAPDH的mRNA序列设计引物，引物序列如表1。用TRIzol法提取各组BMSCs的总RNA，按照Promeg反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA。测各组cDNA浓度，并配平后稀释5倍。取各组稀释后的cDNA 2 µL，进行real-time PCR反应。以GAPDH为内参基因，２^-ΔΔCt计算基因的相对表达量，进行定量分析。

表1.

Real-time PCR引物序列

Table 1 Real-time PCR primer sequences

Target genes	Forward primer (5'-3')	Reverse primer (3'-5')
Beclin1	GAAGCTCAGTACCAGCGAGAATA	ACTGCTCCTCAGAGTTAAACTGG
LC3	GGTGATCATCGAGCGCTACA	TGAGGGGCAAGATGGGTAGA
RUNX2	CCGAGACCAACCGAGTCATTTA	AAGAGGCTGTTTGACGCCAT
ALP	CCTGCAGGATCGGAACGTCAATTA	TGAGTTGGTAAGGCAGGGTCC
OCN	CTCAACAATGGACTTGGAGCC	GGCAACACATGCCCTAAACG
OPN	CCAGCCAAGGACCAACTACA	AGTGTTTGCTGTAATGCGCC
GAPDH	AGTGCCAGCCTCGTCTCATA	GATGGTGATGGGTTTCCCGT

1.6. 蛋白质印迹法检测自噬相关基因Beclin1和LC3的蛋白质表达

收取各组细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白质。用BCA法测定各组细胞的蛋白质浓度，使各组细胞蛋白质浓度相同。各组分别加入40 µL总蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭(5%脱脂牛奶)2 h。加入兔抗鼠LC3抗体(1꞉1 000)、Beclin1抗体(1꞉1 000)及GAPDH内参抗体(1꞉1 000)于4 ℃摇床孵育过夜。以TBTS漂洗3次，每次5 min。加入山羊抗兔IgG抗体(1꞉1 000)于室温孵育2 h。以TBTS漂洗3次，每次5 min。ECL发光法显色，成像，进行图像采集。采用Image Pro Plus6.0软件进行灰度值分析。按相同方法重复3次实验。

1.7. 碱性磷酸酶染色观察成骨能力

在第3代BMSCs生长至70%~80%后，用0.25%的胰酶消化，随机分为5组。细胞贴壁并长至80%后分别换为含0 mg/L AGEs、100 mg/L AGEs、100 mg/L AGEs+自噬抑制剂3MA(5 mmol/L)、200 mg/L AGEs、200 mg/L AGEs+自噬促进剂雷帕霉素(1 µmol/L)的成骨细胞诱导分化培养液(10%胎牛血清、0.l µmol/L地塞米松、0.2 mmol/L 抗坏血酸、10 mmol/L β甘油磷酸钠、100 U/mL青霉素和l00 U/mL链霉素)培养1周。吸除细胞培养液，以PBS清洗3次，于室温以4%甲醛固定液固定细胞 30 min；吸除甲醛溶液，用PBS 清洗3次，加入碱性磷酸酶染色剂，于室温孵育30 min；吸除染色剂，用PBS 清洗2次，于显微镜下观察。

1.8. 统计学处理

所有数据采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，以均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示。两组比较采用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 不同浓度AGEs对BMSCs增殖活性的影响

与0 mg/L AGEs组相比，在72 h之内，BMSCs增殖活性在50、100 mg/L AGEs处理后有所上升，而用200、400 mg/L AGEs处理后有所下降。在AGEs的质量浓度≤400 mg/L内，所有组BMSCs的活性在12~24 h内随时间的延长而升高(图1)。

图1.

不同浓度晚期糖基化终末产物处理不同时间对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响

Figure 1 Effect of different concentrations of advanced glycation end products on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells at different time

**P<0.01 vs 0 mg/L AGEs.

2.2. 透射电镜结果

透射电镜结果(图2)显示：自噬体、自噬溶酶体为双层或单层膜结构，膜内含有消化分解过程中各种阶段的细胞质成分，如线粒体、内质网碎片等。降解物质电解密度增加，形成黑色颗粒状或不定形的聚集，且可见大量空泡状结构。与0 mg/L AGEs组相比，50、100 mg/L AGEs组细胞自噬体形成的数量随AGEs浓度的增加而增多、密度加大；200、400 mg/L AGEs组细胞自噬体形成数量随AGEs浓度的增加而减少、密度减小。

图 2.

晚期糖基化终末产物处理各组骨髓间充质干细胞24 h后自噬体的形成情况(×6 000)

Figure 2 Formation of autophagosomes after treatment of bone marrow mesenchymal stem cells with advanced glycation end products for 24 hours in each group (×6 000)

A: 0 mg/L AGEs; B: 50 mg/L AGEs; C: 100 mg/L AGEs; D: 200 mg/L AGEs; E: 400 mg/L AGEs.

2.3. 不同浓度的AGEs对自噬相关因子LC3和Beclin1的影响

加入上述不同浓度AGEs培养24 h后，与0 mg/L AGEs组相比，50和100 mg/L AGEs组细胞LC3和Beclin1 mRNA表达增加(均P<0.01)；200和400 mg/L组细胞LC3和Beclin1 mRNA表达减少(均P<0.01，图3)。LC3、Beclin1蛋白质表达量趋势与mRNA一致(图4)，200 mg/L组细胞LC3和Beclin1蛋白质表达与0 mg/L AGEs组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

图3.

晚期糖基化终末产物处理骨髓间充质干细胞24 h后Beclin1、LC3 的mRNA表达

Figure 3 mRNA expression of Beclin1 and LC3 after treatment of bone marrow mesenchymal stem cells with advanced glycation end products for 24 h

**P<0.01 vs 0 mg/L AGEs.

图4.

晚期糖基化终末产物处理骨髓间充质干细胞24 h后Beclin1、LC3的蛋白质表达

Figure 4 Protein expression of Beclin1 and LC3 after treatment of bone marrow mesenchymal stem cells with advanced glycation end products for 24 h

**P<0.01 vs 0 mg/L AGEs.

2.4. 干预自噬通路对BMSCs成骨分化的影响

碱性磷酸酶染色结果显示：与0 mg/L AGEs组相比，100 mg/L AGEs组碱性磷酸酶染色较深；而加入自噬抑制剂3MA后碱性磷酸酶染色浅于0 mg/L AGEs组和100 mg/L AGEs组。200 mg/L AGEs组碱性磷酸酶染色浅于0 mg/L AGEs组，加入自噬促进剂雷帕霉素后碱性磷酸酶染色深于200 mg/L AGEs组(图5)。与0 mg/L AGEs组相比，100 mg/L AGEs组细胞成骨相关基因RUNX2、ALP、OPN、OCN mRNA表达增加，加入自噬抑制剂3MA后，成骨相关基因表达量相对100 mg/L AGEs组减少。与0 mg/L AGEs比较，200 mg/L AGEs组细胞成骨相关基因RUNX2、ALP、OPN、OCN mRNA表达减少。加入自噬促进剂雷帕霉素后，成骨相关基因表达量较200 mg/L AGEs组有所增加(图6)。

图5.

晚期糖基化终末产物及自噬促进剂、自噬抑制剂对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色的影响(×40)

Figure 5 Effect of advanced glycation end products, autophagy enhancer, and autophagy inhibitor on alkaline phosphatase staining for bone marrow mesenchymal stem cells (×40)

A: 0 mg/L AGEs; B: 100 mg/L AGEs; C: 100 mg/L AGEs+3MA (5 mmol/L); D: 200 mg/L AGEs; E: 200 mg/L AGEs+rapamycin (1 µmol/L).

图6.

晚期糖基化终末产物及自噬促进剂、自噬抑制剂处理骨髓间充质干细胞24h后对RUNX2、ALP、OPN、OCN 的mRNA表达的影响

Figure 6 Effect of advanced glycation end products, autophagy enhancer, and autophagy inhibitor on mRNA expression of RUNX2, ALP, OPN, and OCN after treatment with bone marrow mesenchymal stem cells for 24 h

**P<0.01 vs 0 mg/L AGEs.

3. 讨 论

AGEs可降低成骨细胞的增殖活性，增加破骨细胞的增殖活性，加速骨吸收，影响骨再造，从而导致骨质疏松^{[7, 12]}，增加糖尿病患者的骨折风险，其机制可能与AGEs的累积影响了成骨及破骨细胞自噬有关。

自噬是一种重要的细胞自我保护反应。当细胞遭受外界如饥饿、缺氧等不良环境刺激时，会通过增强自噬来维持内环境的稳定。但自噬过于强烈，反而会引起细胞结构破坏，导致细胞死亡^[13]。LC3是自噬体膜上的一种标志性蛋白，分为细胞质型LC3(即LC3-I)和膜型LC3(即LC3-II)，细胞质里的LC3-I通过泛素化反应与磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)结合转变为LC3-II，LC3II与LC3I的比值是体现自噬水平的重要标志^[14]。Beclin1在自噬体的形成中是一个必需分子，它与PI3KC3复合体、调节性蛋白激酶p150以及Atg14等形成复合体，调控哺乳动物自噬体的形成与成熟^[15]。细胞内对自噬进行调控的信号通路非常复杂，包括丝裂原细胞外信号调节激酶(mitogen extracellular signal-regulated kinase，MEK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信号通路、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 hydroxy kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路、单磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)/mTOR信号通路等。目前研究得最多的是PI3K/Akt/mTOR信号通路^[16]。一方面，PI3K/Akt信号可以通过激活mTOR信号，促进mTOR在细胞内的累积来抑制自噬；另一方面，PI3K/Akt信号可以激活核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)，导致细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加，而ROS可促进自噬^[17-18]。

研究^[19]表明：低剂量的AGEs在短时间内可以通过限制Akt/mTOR信号转导的磷酸化，刺激软骨细胞增殖和自噬；高剂量的AGEs长时间刺激软骨细胞可使Akt/mTOR信号转导的磷酸化水平增高，从而抑制其增殖活性和自噬^[19]。另有研究^[20]表明：AGEs与RAGE结合，通过Raf/MEK/ERK通路影响人成骨细胞活性，不同浓度的AGEs对其自噬活性有不同的影响。故AGEs调控自噬的机制还有待更深入的研究。本研究结果显示：不同浓度的AGEs对大鼠BMSCs增殖活性的影响有所不同，低浓度(≤100 mg/L)的AGEs增加BMSCs的增殖活性，通过增强BMSCs的自噬，从而促进BMSCs的成骨分化，加入自噬抑制剂后，结果得到逆转；而高浓度(≥200 mg/L)的AGEs抑制BMSCs的增殖活性，导致BMSCs自噬减弱，从而抑制BMSCs的成骨分化，加入自噬促进剂后，结果得到逆转。这提示AGEs导致糖尿病性骨质疏松的机制可能与BMSCs的自噬能力失衡相关；不同浓度的AGEs对BMSCs成骨分化过程中的自噬能力有不同的影响。但不同浓度的AGEs对自噬产生不同作用的具体机制仍然未知。因此，探明不同浓度的AGEs对自噬产生不同作用的机制，寻找最佳干预靶点对糖尿病性骨质疏松的治疗有重要的现实意义。

本研究也有一些局限性：糖尿病的发生、发展受多种因素的影响，AGEs只是其中一个；单纯在体外研究AGEs对BMSCs自噬的影响，无法完全模拟糖尿病的内环境，尚需在动物体内验证AGEs的增高对糖尿病BMSCs自噬能力的影响。

基金资助

国家自然科学基金(81470772)；重庆市科卫联合医学科研重点项目(2018ZDXM020)；重庆市自然科学基金(cstc2016jcyjA0238)。

This work was supported by the National Natural Science Foundation (81470772), the Medical Scientific Research Project of Chongqing (2018ZDXM020) and the Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2016jcyjA0238), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202104361.pdf