Abstract
目的
分析放射性肺损伤大鼠的差异表达基因，从转录组水平揭示亚低温对大鼠放射性肺损伤的防护机制。
方法
选取10只6~8周龄雄性SD大鼠并随机分为模型组与亚低温治疗组。建立放射性肺损伤大鼠模型，并对亚低温治疗组进行亚低温干预治疗，分别提取2组大鼠左侧肺组织RNA，用BGISEQ-500平台进行测序。采用edgeR差异分析软件分析2组基因表达的差异，对有统计学意义的差异表达基因进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，然后采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)对其中5个关键差异表达基因进行验证。
结果
亚低温治疗组与模型组之间有2 790个差异表达基因[错误发现率<0.001，|log2(fold change)|>1]，其中2 257个基因上调，533个基因下调。5个关键基因real-time RT-PCR验证结果与转录组测序(RNA sequence，RNA-Seq)分析趋势一致。GO功能富集分析结果表明差异表达基因与细胞结合、代谢过程及细胞膜结构等有关；KEGG通路富集分析结果表明这些基因参与细胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAMs)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、紧密连接(tight junction)及核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等重要生物学通路。
结论
获得了亚低温防护大鼠放射性肺损伤相关差异表达基因及其显著富集通路，为亚低温技术防护放射性肺损伤提供了实验依据。
Keywords: 亚低温, 紧密连接通路, RNA测序, 放射性肺损伤
Abstract
Objective
To analyze the differentially expressed genes (DEGs) with radiation-induced rat lung injury, and to reveal the protective mechanism for mild hypothermia in the radiation-induced lung injury in rats at the transcriptome level.
Methods
A total of 10 male SD rats aged 6-8 weeks were randomly divided into 2 groups to establish a rat model of radiation-induced lung injury, and one group was treated with mild hypothermia. RNA was extracted from left lung tissue of each group, and sequenced by BGISEQ-500 platform. Significance analysis of DEGs was carried out by edgeR software. Gene ontology (GO) function enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were used to analyze the gene function. Then 5 key DEGs were verified by real-time reverse transcription PCR (real-time RT-PCR).
Results
There were 2 790 DEGs (false discovery rate<0.001, |log2(fold change)|>1) in the mild hypothermia group compared with the model group, in which 2 257 genes were up-regulated and 533 genes were down-regulated. When real-time RT-PCR was used to validate the 5 key genes, the result was consistent with the RNA-seq. GO functional enrichment analysis showed that these DEGs were related to cell binding, metabolic process and cell membrane structure, etc. KEGG pathway enrichment analysis showed that these genes were involved in important biological pathways such as cell adhesion molecules, mammalian target of rapamycin, tight junction, and NF-κB.
Conclusion
The DEGs and pathways related to mild hypothermia protection against radiation-induced lung injury in rats are obtained, which provides an experimental basis for the protection of mild hypothermia against radiation-induced lung injury.
Keywords: mild hypothermia, tight junction pathway, RNA-sequence, radiation-induced lung injury
2018年的癌症统计报告[1]指出：肺癌的发病比例(11.6%)和死亡比例(18.4%)依然最高，女性乳腺癌的发病比例(11.6%)次之。由于胸部肿瘤高发，在进行放射治疗(以下简称放疗)时所导致的肺损伤就更为突出，在接受放疗的肺癌患者中放射性肺损伤的发生率约为30%[2]。在探索放射性肺损伤防护方法的过程中，亚低温治疗正受到广泛的关注。其中亚低温干预的方法在实验室阶段已经取得了极大的进展[3-4]：亚低温干预能减轻大鼠放射性肺损伤的程度，并且能提高放射性肺损伤大鼠的抗氧化、抗炎症及抗凋亡能力，与临床常用抗辐射药氨磷汀效果相近。RNA测序(RNA-Seq)是近年来发展较为成熟的高通量测序技术，具有快捷分析、高分辨率等优势[5]。本研究拟对放射性肺损伤大鼠模型进行亚低温干预，采用RNA-Seq技术研究亚低温对放射性肺损伤大鼠的基因表达的影响，筛选出在亚低温状态下发挥作用的相关特异性基因及通路，为揭示亚低温在放射性肺损伤防护过程中的作用机制提供一些思路。
1. 材料与方法
1.1. 动物
10只6~8周龄SPF级雄性SD大鼠，体重(205±15) g，由北京维通利华实验动物公司提供[SCXK(京)2016-0006]。动物饲养于中国辐射防护研究院中心动物实验室[SYXK(晋)2013-0002]。
1.2. 主要试剂与仪器
柱式法总RNA提取试剂盒(Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)、反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT Master Mix)、扩增试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ)均购自北京宝日医生物技术公司。扩增基因及大鼠内参基因引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
Veriti梯度PCR扩增仪和Quantstudio 7 Flex实时荧光定量PCR仪均为美国Applied Biosystems公司产品，Nanodrop2000超微量分光光度计为美国Thermofisher Scientific公司产品，Agilent 2100生物分析仪为美国Agilent公司产品，BGISEQ-500平台为华大基因公司产品。
1.3. 方法
1.3.1. 动物分组
10只SD大鼠随机被分为模型组和亚低温治疗组，每组5只。
1.3.2. 大鼠放射性肺损伤及亚低温干预模型的建立
用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，将其仰卧位固定，在X线模拟机下定位照射野(全肺)，用12 MeV电子线进行20 Gy垂直单次照射，源皮距100 cm，照射深度3 cm，剂量率300 cGy/min。模型组在麻醉后进行定位及放射线照射，亚低温治疗组在照射后立即将大鼠置于可调节温箱中，使其体温维持在亚低温[(34±1) ℃]并持续6 h[3]。
1.3.3. 肺组织总RNA提取
在亚低温干预结束后，立即采用柱式法提取大鼠左肺总RNA，分别采用Nanodrop2000超微量分光光度计和Agilent2100生物分析仪检测RNA样品的纯度和RNA完整系数(RNA integrity number，RIN)等，确保RNA的质量能满足后续测序要求。
1.3.4. 文库构建及测序
提取总RNA后，富集mRNA，将RNA片段化，反转录合成cDNA并进行末端修复，连接产物通过特异的引物进行桥式PCR扩增，从而建立测序用cDNA文库。文库构建成功后，用BGISEQ-500平台进行高通量测序。
1.3.5. 数据处理及分析
过滤掉低质量、未知碱基N含量过高及接头污染的reads，用FKPM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)方法计算基因的表达量，以|log2(fold change)|>1且错误发现率(false discovery rate，FDR)<0.001为标准筛选出差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)。并绘制火山图以更加直观地了解2组基因表达水平的差异。对DEGs进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，以了解DEGs的功能。
1.3.6. 实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)验证
选取5个差异表达明显的DEGs(转录组学分析结果显示表达上调的Mpp7、Lmo7、Ctnnd1及Ptprf 4个基因和表达下调的Gsdma基因)进行real time RT-PCR验证，以β-actin为内参基因，使用2-ΔΔCt 方法计算基因的相对表达量。基因引物序列见表1。
表1.
实时反转录聚合酶链反应引物序列
Table 1 Primers used for real-time RT-PCR
| Gene name | Primer sequence (5'-3') | Product size/bp |
|---|---|---|
| β-actin | Forward: TCAGGTCATCACTATCGGCAAT | 147 |
| Reverse: AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA | ||
| Mpp7 | Forward: GGTGGCAGGCTAAGCATGAAGG | 94 |
| Reverse: GGTCGTCTCAGAGCCAGTCTCC | ||
| Lmo7 | Forward: CAGGAAGCGGCTGATGGTTGAG | 107 |
| Reverse: GCTGACGCAGGCTCTGAACATC | ||
| Ctnnd1 | Forward: AGGATGCAGGAGCCAGGTCAG | 154 |
| Reverse: TCCGCGTTGTCATCGTCTTCAC | ||
| Ptprf | Forward: ACAAGCAGCACGGACAGATTCG | 108 |
| Reverse: GAGCCTCAGCCAGCATGACATC | ||
| Gsdma | Forward: TCCGCACCGACTACACTCTCC | 137 |
| Reverse: CACTGTCTTCGGCACGTCCAC |
2. 结 果
2.1. 肺组织RNA提取结果
经检验，所有样品OD260/OD280的比值均在1.8~2.0范围内，RNA纯度较高；RIN值全部大于8.2，28S/18S全部大于1.1，RNA完整性良好，符合建库标准。2组所提取RNA的总量>0.2 μg，质量-体积浓度>20.0 ng/μL，能够满足2次及以上的建库需求，可用于后续实验。
2.2. DEGs
亚低温治疗组与模型组比较有2 790个DEGs，其中2 257个上调基因，533个下调基因。DEGs的整体分布情况见图1。
图1.
亚低温组和模型组差异基因表达的火山图
Figure 1 Volcanic map of differentially expressed genes between the mild hypothermia group and the model group
Red represents the up-regulated gene and blue represents the down-regulated gene.
2.3. GO功能富集分析及KEGG通路富集分析
GO功能富集分析结果显示：DEGs参与的生物过程主要有细胞内进程、代谢过程等，富集的分子功能主要包括细胞结合、催化活性及信号转导等方面，富集的细胞组件主要包括细胞组分以及细胞膜等(图2)。
图2.
亚低温组与模型组DEGs的GO功能富集分析
Figure 2 GO enrichment analysis of differentially expressed genes between the mild hypothermia group and the model group
KEGG通路富集分析结果显示：亚低温治疗组中显著富集的通路有78条，DEGs参与了细胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAMs)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、紧密连接及核因子-κB等通路(图3)。
图3.
亚低温组与模型组DEGs的KEGG通路富集分析
Figure 3 Enrichment analysis of KEGG pathway of differentially expressed genes in the mild hypothermia group and the model group
2.4. Real time RT-PCR的验证结果
从基因检测结果中挑选5个差异表达显著的基因作为目的基因，以测序用的RNA样品进行cDNA合成，通过real time RT-PCR对RNA-seq测序结果进行验证。结果显示5个关键基因的上、下调趋势与RNA-Seq结果(图4)相符。
图4.
基因的实时反转录聚合酶链反应验证结果
Figure 4 Real-time reverse transcription PCR validation results of genes
*P<0.05 vs the model group.
3. 讨 论
自从20世纪50年代第1次正式报道亚低温治疗脑损伤成功的案例后，各国学者将亚低温应用于不同的临床实践并探索其机制。目前通过文献调研及实验室前期的探索，已经可以较好地复制大鼠放射性肺损伤模型，并且能够熟练快速地使大鼠体温达到亚低温范围并维持所需的时间，保证后续实验的顺利进行。转录组学是研究基因表达及功能的基础，它研究特定组织在某一特定功能状态下所转录出来的所有RNA[6]。在受到放射线照射后，大鼠肺相关基因异常表达是肺损伤发生的重要生物学基础，但在亚低温对放射性肺损伤的保护作用机制研究方面尚缺乏转录水平的研究，因此，本研究用RNA-seq技术全面分析亚低温作用前后肺组织的转录组，获得了亚低温治疗放射性肺损伤的相关DEGs及其显著富集通路，在real time RT-PCR验证的结果中，也得到了相同的趋势，证明技术的可信度高。
Ctnnd1在不同的肿瘤中有不同的作用，既可以是癌基因，也可以是抑癌基因。曹建中[7]通过敲低Ctnnd1的表达，发现肝癌细胞的增殖和迁移等都受到了抑制，证实Ctnnd1在肝癌中的促癌作用。Karlsson等[8]对肺癌中的Lmo7基因进行分析，发现Lmo7在正常肺组织中高表达，提示Lmo7免疫反应是肺癌的强预后标志物。在许多实体肿瘤中，PTP基因家族中的许多基因被报道为致癌物，其中Ptprf基因被认为是非小细胞肺癌和其他类型肿瘤的标志物。Soulières等[9]通过real time RT-PCR分析非小细胞肺癌患者标本中Ptprf基因的表达，认为Ptprf基因可作为预测非小细胞肺癌预后的标志物。
紧密连接是上皮细胞、内皮细胞间的重要连接方式，是一种由多种蛋白质组成的动态的功能性复合体，能使相邻的细胞紧密贴合，起到栅栏、屏障的作用[10]。紧密连接蛋白是保持紧密连接结构与功能非常重要的调节蛋白，包括膜蛋白和闭小环蛋白两大类[11]，其中膜蛋白包括claudin蛋白、occludin蛋白及连接黏附分子；闭小环蛋白包括ZO-1、ZO-2及ZO-3蛋白。尽管各种蛋白质功能各异，但是相互之间通过连接形成的复合体都能参与到维持内环境稳态、细胞极性等过程中。研究[12]发现：多种肺部疾病(肺水肿、纤维化甚至肿瘤)的发生都与紧密连接蛋白复合体被破坏有关，其中Wray等[13]研究发现：在急性肺损伤时，肺泡上皮紧密连接中claudin蛋白的改变会影响细胞旁路和肺泡内液体清除率，从而导致肺水肿，因此调节紧密连接蛋白claudin的表达水平可能是治疗急性肺损伤和肺水肿的一种有效的方法；Eutamene等[14]应用脂多糖诱导大鼠肺损伤模型，发现肺纤维化大鼠的呼吸道病变与紧密连接蛋白复合体的破坏是同时存在的，这也反映出肺紧密连接蛋白结构异常和功能损害可能是纤维化的促进因素。本研究发现：紧密连接通路存在于亚低温治疗组中，并且与模型组比较，此通路DEGs富集明显。我们推断紧密连接通路是亚低温防护放射性肺损伤的作用通路。
紧密连接蛋白的种类很多，但不同家族的特异性功能和调节机制不完全清楚，亚低温在放射性肺损伤的防治过程中是如何通过调节紧密连接蛋白家族来起作用的需要进一步探讨，这将是未来放射性肺损伤诊断、预防和治疗的一个新途径。
基金资助
山西省实验动物专项基金(2014k10)。
This work was supported by Special Funds for Experimental Animals of Shanxi Province, China (2014k10).
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202104345.pdf
参考文献
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