外泌体作为药物载体在胰腺癌化学治疗中的作用

Abstract

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是预后极差的消化道恶性肿瘤。PC的发病率仍在持续增长，其5年生存率仅为10%。手术切除是当前治疗PC最有效的手段，但有80%的患者诊断为PC时已错过手术最佳时间。化学治疗(简称化疗)是PC的主要治疗方式之一，但PC对化疗不敏感、容易产生耐药且不良反应多，这与化疗药物缺乏靶向性有关。外泌体是一种几乎所有类型细胞都可分泌的纳米级囊泡，携带有各种生物活性物质，介导细胞间的转导及物质运输。外泌体具有低免疫原性、低细胞毒性、高穿透性和归巢能力，具有成为良好药物载体的潜力。将外泌体作为各类化疗药物的载体用于治疗肿瘤已成为研究的热点。外泌体载药可以缓解化疗耐药、减轻不良反应和增强疗效。近年来外泌体作为药物载体在PC化疗的研究中取得了较好的成果。

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一种恶性程度极高且5年生存率极低的消化道恶性肿瘤，是“癌中之王”。2021年1月美国癌症协会(American Cancer Society，ACS)报道了美国2010至2016年间诊断的所有癌症平均5年相对生存率为67%，PC的发病率和病死率仍在持续增长，其5年相对生存率仅为10%^[1]。手术治疗是PC患者的优先选择，但只有20%左右的患者存在手术机会^[2]。所以大部分PC患者会进行化学治疗(以下简称化疗)，但PC患者化疗易产生耐药且不良反应多，这可能与PC的肿瘤微环境和化疗药物缺乏靶向性有关。目前PC的诊治水平仍有很大的进步空间^[3]。外泌体是由细胞分泌的小囊泡，经修饰后的外泌体具有成为良好药物载体的潜力^[4-5]。外泌体装载化疗药物治疗PC，有望攻克化疗不敏感、化疗耐药和化疗不良反应多等难题。本文总结具有代表性的外泌体装载化疗药物治疗肿瘤的研究，重点讨论外泌体作为化疗药物载体治疗PC的研究进展。

1. 外泌体的形成及生物学作用

1.1. 外泌体的形成

20世纪80年代，Johnstone等^[6]发现体外培养的绵羊红细胞在成熟过程中会向外分泌一种有膜结构的小囊泡，并将其命名为外泌体。外泌体是一类由细胞分泌的直径30~150 nm的细胞外囊泡^[7]，具有脂质双分子层结构，含有反映其细胞起源的各种生物活性分子(图1)。外泌体普遍存在于血液、尿液、唾液和母乳等生物体液中^[8-11]。目前普遍认可的外泌体形成过程如下：细胞膜向内凹陷形成早期内体，早期内体膜向内出芽形成含腔内囊泡的晚期内体，富含腔内囊泡的晚期内体称为多囊泡体；一部分多囊泡体与溶酶体融合后被降解，另一部分与细胞膜融合，将其包含的腔内囊泡释放至胞外，这些释放的腔内囊泡即为外泌体^[12-13]。

图1.

外泌体的结构

Figure 1 Structure of exosomes

Exosomes are extracellular vesicles, possessing with the lipid bilayer and a diameter of 30-150 nm, secreted by cells. Exosomes contain DNA, RNA, lipids and various proteins.

1.2. 外泌体的生物学作用

外泌体在细胞间物质和信息传递中发挥重要作用。外泌体通过递送亲本细胞来源的蛋白质、脂质和核酸等生物活性物质来发挥细胞间物质转运和传递功能，从而调控受体细胞的功能状态^[14-15]。外泌体参与机体各种生理活动和疾病发生、发展的调控(图2)。

图2.

外泌体的生物学作用

Figure 2 Biological function of exosomes

Exosomes can transfer substances and biological information between cells to regulate the functional state of the body. Exosomes regulate disease progression, immune response, metabolism, neuronal excitability, and cell survival.

总之，外泌体广泛分布在机体的各个角落，时刻发挥着物质运输和通信功能。外泌体作为一种携带有复杂生物活性成分的纳米级分子，对其进行体内跟踪和功能分析是困难的。目前对外泌体调控生理活动和疾病发生、发展机制的认识仍然有限，对外泌体的探索还在不断进行。

2. 外泌体作为化疗药物载体的优势和挑战

最近的研究^[16]发现：在单细胞水平上，肿瘤细胞对外泌体的摄取量高于巨噬细胞和其他免疫细胞，这表明基于外泌体的药物递送系统可以在肿瘤部位蓄积，有利于增强治疗分子的抗癌作用和减少对正常细胞的不良反应。

外泌体作为化疗药物载体的优势：1)外泌体的免疫原性和细胞毒性低^[17]；2)外泌体对亲本细胞具有“归巢”能力，而且作为纳米级尺寸的分子，外泌体可以穿透许多生物屏障，提高药物的运输效率^[18-19]；3)可通过多种途径对外泌体进行改造和修饰，使其携带或表达靶向分子和抗癌分子^[20]。

外泌体作为化疗药物载体的挑战：1)目前外泌体缺乏标准化的分离和纯化方法，临床级外泌体产能不足^[21]；2)外泌体载药效率较低，常用的载药技术有共孵育、超声和电穿孔，共孵育操作简单，但只适用于疏水分子且载药效率较低，超声和电穿孔技术有利于亲水分子和生物大分子的装载^[22]；3)天然外泌体靶向性较差，在体内容易被巨噬细胞捕获^[23]，然而通过阻断单核吞噬细胞系统可以改善工程化外泌体输送到靶细胞^[24]。

可从以下几个方面考虑设计高效安全的药物递送系统：1)选择来源合适的外泌体，有些外泌体携带有天然的靶向分子或抗癌分子；2)对外泌体进行改造或修饰可增强外泌体的靶向性或抗癌作用；3)选择适合的载药技术可提高外泌体的载药能力；4)选择有针对性的化疗药物载于外泌体，可联合抗耐药分子或免疫治疗分子协同治疗。

增强外泌体靶向性的策略如下：1)把自体外泌体作为药物载体，自体外泌体具有亲和靶向能力，如将肿瘤来源的外泌体作为药物载体治疗同种肿瘤；2)通过转染等方法使外泌体表达靶向分子；3)通过超声和电穿孔等方法使外泌体负载靶向分子；4)改造或修饰外泌体使其表达抗单核巨噬细胞吞噬的分子，增加外泌体在体内的循环时间。

3. 外泌体作为化疗药物载体治疗PC

目前有较多研究^[25-36]把外泌体作为化疗药物载体治疗肿瘤，并取得了较好的疗效(表1)。作为药物载体的外泌体可来源于间充质干细胞和免疫细胞等正常细胞^[37-38]。肿瘤来源的外泌体也被用作药物载体治疗肿瘤，但其安全性需要论证^[39]。工程化外泌体载药治疗肿瘤，将有望解决化疗耐药、不良反应多及疗效差等难题，实现化疗药物的精准化治疗。

表1.

外泌体装载各类化学药物治疗肿瘤

Table 1 Exosomes loaded with various chemicals for the treatment of tumors

外泌体的来源	载药技术	装载的药物	肿瘤类型	治疗效果	不良反应	靶向性	文献
巨噬细胞	电穿孔	吉西他滨、地拉罗司	胰腺癌	好	未讨论	未讨论	[25]
间充质干细胞	电穿孔	吉西他滨单磷酸盐、 紫杉醇	胰腺癌	好	少	好	[26]
胰腺癌细胞	超声处理	吉西他滨	胰腺癌	很好	少	很好	[27]
间充质干细胞	药物预处理细胞使细胞分泌富含药物的外泌体	紫杉醇	胰腺癌	好	未讨论	好	[28]
间充质干细胞	药物预处理细胞使细胞分泌富含药物的外泌体	紫杉醇	胰腺癌	好	未讨论	未讨论	[29]
胰腺癌细胞	超声处理	紫杉醇,磁性纳米颗粒、含有精氨酸-甘氨酸- 天冬氨酸的短肽	胰腺癌	很好	少	好	[30]
THP-1细胞	共孵育	阿霉素、miRNA-159	乳腺癌	很好	少	很好	[31]
中性粒细胞	超声处理	阿霉素	神经胶质瘤	很好	少	很好	[32]
胰腺癌细胞、胰腺星状细胞和 巨噬细胞	药物预处理细胞使细胞分泌富含药物的外泌体	阿霉素	胰腺癌	好	未讨论	未讨论	[33]
THP-1细胞	电穿孔	阿霉素、磁性纳米颗粒	宫颈癌、乳腺癌	很好	少	很好	[34]
HEK293T细胞	超声处理	铁死亡诱导剂、光敏剂	肝细胞癌	很好	少	好	[35]
间充质干细胞	电穿孔	奥沙利铂、siRNA	胰腺癌	很好	少	好	[36]

3.1. 外泌体装载吉西他滨治疗PC

吉西他滨(gemcitabine，GEM)是一种嘧啶核苷酸类似物，在肿瘤细胞内活化后可抑制DNA合成，导致肿瘤细胞死亡，GEM适用于PC、肺癌、膀胱癌和乳腺癌等肿瘤的治疗^[40]。肿瘤患者长期使用GEM容易出现骨髓抑制和消化系统反应等不良反应^[41]。更重要的是，长期使用GEM容易产生耐药。外泌体装载GEM治疗肿瘤，能有效缓解耐药、减轻药物不良反应和增加疗效。M1巨噬细胞来源的外泌体装载GEM和地拉罗司治疗PC，这为耐药PC提供了一种有效的治疗策略，运用电穿孔载药技术，GEM和地拉罗司的包封率分别为6.5%和5.7%；GEM是PC的一线化疗药物，在临床化疗中疗效较好；地拉罗司是一种铁螯合剂，通过耗竭铁从而抑制耐药相关蛋白RRM2的表达，从而改善耐药PC细胞对GEM的敏感性。细胞实验^[25]表明：外泌体载药比游离药物抑癌效果更好，GEM+地拉罗司处理耐药PC细胞后的细胞存活率为55%，而载药外泌体为29%^[25]。

值得注意的是，与其他实体肿瘤相比，细胞外基质异常增生是PC的显著特征，异常增生的细胞外基质介导了PC的化疗耐药^[42-43]。为了克服PC的化疗耐药，有研究^[26]将间充质干细胞来源的外泌体负载GEM单磷酸盐和紫杉醇用于治疗PC，GEM单磷酸盐的包封率为5.92%，紫杉醇的包封率为2.62%。该药物递送系统具有良好的穿透性、抗基质和抗化疗耐药性，为PC的抗耐药治疗提供了一种有前景的策略；与游离药物相比，载药外泌体的抗肿瘤活性更高，通过流式细胞术检测两组药物的抗PC活性，载药(GEM单磷酸盐和紫杉醇)外泌体组诱导细胞凋亡的比例为39.81%，而GEM加紫杉醇游离药物诱导细胞凋亡的比例为33.02%。动物体内实验^[33]表明：载药外泌体组治疗的PC荷瘤小鼠存活88 d，而游离药物组治疗的小鼠只存活73 d，取小鼠主要器官行HE染色以评估载药外泌体的安全性，HE染色结果显示主要器官无明显变化，载药外泌体是安全可靠的。为了增强载药外泌体在肿瘤部位的蓄积，一项研究^[27]将PC细胞来源的外泌体作为药物载体负载GEM用于治疗PC荷瘤小鼠，通过超声法载药技术，GEM的载药量为11.68%；自体外泌体具有归巢靶向性，明显增加了药物在肿瘤部位的蓄积，更重要的是接受载药外泌体治疗的小鼠中有50%的肿瘤在治疗后消失且无明显不良反应，而接受游离GEM治疗的小鼠，在停止用药后，肿瘤迅速反弹。这一策略为基于自体外泌体作为药物载体治疗自体肿瘤提供了有价值的参考。

3.2. 外泌体装载紫杉醇治疗PC

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是一种从植物中提取的天然抗癌药物。PTX通过阻滞肿瘤细胞有丝分裂发挥抗肿瘤作用，主要应用于乳腺癌、卵巢癌、晚期非小细胞肺癌和PC的治疗^[44]。PTX具有血液毒性、神经毒性且影响心脏活动，长期使用PTX可能会导致中性粒细胞减少、周围神经病变和心律紊乱等症状^[45]。而且，PTX难溶于水，应用于临床治疗需添加聚氧乙烯蓖麻油和乙醇助溶，但聚氧乙烯蓖麻油可能会引起过敏反应^[46]。工程化外泌体装载PTX治疗肿瘤，可有效减轻PTX的不良反应且增强疗效。

间充质干细胞具有靶向肿瘤微环境的能力。研究^[28]发现：鼠源骨髓间充质干细胞系(SR4987)对PTX的细胞毒性有很强的抗性，暴露在高剂量PTX中的间充质干细胞有85%可以存活且能够分泌富含PTX的外泌体，这表明可以利用间充质干细胞作为工厂来生产富含PTX的外泌体，开发具有更高肿瘤靶向性的药物以减轻PTX的不良反应。此研究应用高剂量PTX处理间充质干细胞，使其分泌富含PTX的外泌体，通过红外光谱分析技术证明外泌体中结合有PTX；实验结果表明装载PTX的外泌体对PC细胞的增殖有剂量依赖性抑制作用，当载药外泌体蛋白质浓度为0.047~0.095 mg/mL时，对PC细胞生长的抑制率为50%，当蛋白质浓度为0.38 mg/mL时，对PC细胞生长的抑制率为80%，但未讨论其包封率。该研究团队进一步发现：从人牙龈中分离的间充质干细胞对PTX也有很强的抗性，暴露在高剂量PTX中的牙龈间充质干细胞可以存活和释放富含PTX的外泌体，PTX在外泌体中的装载量约为36.8 ng/mL；此实验通过共培养系统检测间充质干细胞分泌物的抗PC活性，经PTX处理的间充质干细胞与PC细胞共培养为实验组，未经PTX处理的间充质干细胞与PC细胞共培养为对照组，共培养24 h后台盼蓝染色结果显示：对照组共培养的癌细胞没有任何毒性迹象，而实验组观察到许多被染成蓝色的死亡癌细胞^[29]。

用靶向分子修饰外泌体从而提高外泌体肿瘤靶向性的策略是实现化疗药物精准给药的可靠选择。PTX是PC化疗的常用药物。功能性配体RGD(由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的几个重复序列组成的多肽)与PC细胞中高表达的整合素αvβ3具有较好的亲和力，把RGD结合到PC细胞衍生的外泌体表面可提高外泌体的靶向能力；然后将PTX负载到RGD修饰的外泌体上治疗PC小鼠模型，此研究采用超声法载药技术，PTX的载药效率为36.8%；结果显示与游离PTX相比，RGD修饰的载药外泌体可有效穿透PC的肿瘤微环境靶向肿瘤细胞，从而有效抑制PC荷瘤小鼠肿瘤的生长且化疗不良反应少^[30]。

3.3. 外泌体装载阿霉素治疗PC

阿霉素(doxorubicin，Dox)是一种抗肿瘤抗生素，其主要作用机制是药物分子进入细胞与DNA结合，抑制核酸的合成^[47]。Dox可用于白血病、肉瘤、乳腺癌和卵巢癌等肿瘤的治疗，但有骨髓抑制和心脏毒性等不良反应^[48]。最近的研究^[31-32]把Dox负载于外泌体上用于抗肿瘤治疗取得了较好的疗效且减轻了化疗不良反应。

一项研究^[33]比较了不同类型细胞分泌外泌体的效率、不同来源外泌体装载DOX的效率及不同载药外泌体的抗PC活性。此研究将PC细胞、胰腺星状细胞和巨噬细胞分别置于含DOX的培养基中培养使其分泌富含DOX的外泌体，然后用超速离心法收集细胞上清中的载药外泌体，通过测量外泌体的蛋白质浓度发现PC细胞分泌的外泌体最多，其次是巨噬细胞和胰腺星状细胞，用高效液相色谱测定外泌体中DOX的装载效率，PC细胞来源的外泌体药物装载效率最高(14.06 ng/µg)，其次是巨噬细胞(7.27 ng/µg)和胰腺星状细胞(3.99 ng/µg)来源的外泌体；通过流式细胞术检测不同来源载药外泌体的抗PC细胞活性，装载DOX的巨噬细胞来源外泌体显示出最高的抗癌活性(细胞凋亡指数为80.1%)，其次是胰腺星状细胞(细胞凋亡指数为73.2%)和PC细胞(细胞凋亡指数为65.3%)来源的载药外泌体。这项研究表明外泌体存在供体细胞特异性差异，这可能影响其作为药物载体用于治疗的效果，此研究结果为构建安全高效的载药体系提供了重要的理论基础。

结合多种疗法的外泌体载药体系可为外泌体载药治疗PC提供重要参考。一项研究^[34]探索了结合化学、基因和光热疗法的载药体系，能有效靶向治疗宫颈癌荷瘤小鼠，对实验小鼠行组织切片HE染色和血液分析以评价其体内生物安全性，结果表明该载药体系的组织毒性低，是安全可行的。该载药体系由外泌体负载Dox和分子信标修饰的磁性纳米颗粒组成，外部的磁场和近红外辐射诱导载药体系发挥作用；分子信标修饰的磁性纳米颗粒能够通过外部磁场引导载药外泌体在肿瘤部位富集；当外泌体富集在肿瘤部位后，应用近红外辐射诱导局部热疗，并触发外泌体内货物的释放，释放的分子信标可以靶向miRNA-21进行成像和基因沉默，Dox可以杀死癌细胞。最近有研究^{[35-36, 49]}也将爱拉斯汀和奥沙利铂等化疗药物载于外泌体用于肿瘤的化疗，将化疗药物负载于外泌体有利于提高药物的靶向性、增加疗效和减轻不良反应。

4. 结 语

外泌体作为可靠的药物载体具有重要的临床应用价值。外泌体可能是将来突破PC化疗不良反应多和耐药瓶颈的一个关键因素。通过多种途径对外泌体进行改造或修饰，可提高外泌体的靶向性和抗耐药作用。构建安全高效的标准化载药体系，将有利于推动外泌体药物载体应用于临床。肿瘤的治疗仍然是难题，单一疗法通常达不到预期效果，结合化疗、靶向治疗和免疫治疗的方法被越来越多的临床医生和患者尝试、认可和接受。多疗法结合的外泌体载药体系很可能是外泌体药物载体未来的发展趋势。

基金资助

湖南省自然科学基金(2020JJ4053)；长沙市科技项目(KQ2004130)。

This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province (2020JJ4053) and the Science and Technology Project of Changsha (KQ2004130), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

徐彪铭 论文的构思与撰写；左朝晖 论文的构思与修改。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202302268.pdf