长链非编码RNA 114227对胃癌细胞增殖与迁移能力的影响

Abstract

目的

胃癌是消化系统的常见癌症，患者晚期预后较差。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在胃癌的发生、发展中起重要调控作用。本研究主要探讨lncRNA 114227对胃癌细胞生物学行为的影响。

方法

实验分为4组：阴性对照(NC)组、lncRNA 114227小干扰(si-lncRNA 114227)组、空载体(Vector)组、过表达载体(OE-lncRNA 114227)组。采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)检测lncRNA 114227在胃黏膜组织及胃癌组织、胃黏膜上皮细胞及不同胃癌细胞株中的表达情况；采用CCK-8实验检测lncRNA 114227对胃癌细胞增殖的影响；采用Transwell实验、划痕愈合实验和蛋白质印迹法检测lncRNA 114227对胃癌细胞迁移能力和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)相关分子表达的影响；采用裸鼠皮下荷瘤实验检测lncRNA 114227对胃癌细胞体内增殖的影响。

结果

LncRNA 114227在胃癌组织的表达水平明显低于胃黏膜组织，在4种胃癌细胞中的表达水平明显低于胃黏膜上皮细胞(均P<0.01)。过表达lncRNA 114227后细胞的增殖和迁移能力明显减弱；沉默lncRNA 114227后细胞的增殖和迁移能力增强(均P<0.05)。体内裸鼠皮下荷瘤实验显示：OE-lncRNA 114227 组过荷瘤小鼠的成瘤体积明显小于Vector 组，成瘤质量低于Vector组(P<0.05)，表明lncRNA 114227抑制肿瘤生成。

结论

LncRNA 114227在胃癌组织和胃癌细胞中低表达，可能通过EMT抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。

胃癌是全球癌症病死率较高的疾病。中国胃癌呈现高发病率、高病死率、高年龄段高发的特点^[1-2]。目前临床现有的肿瘤标志物尚不能完全揭示早期胃癌的发生及复发^[3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200 nt，极少数具有编码短肽能力的RNA^[4]，在肿瘤发生、发展过程中通过调控转录、转录后和表观遗传水平发挥重要作用^[5]。研究^[6]显示恶性肿瘤中lncRNAs异常表达与患者预后密切相关。LncRNA 114227是新发现的一种RNA，在胃癌中的表达及其功能尚未明确。本研究通过实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)、蛋白质印迹法等方法探讨沉默和过表达lncRNA 114227后对胃癌细胞增殖与迁移能力的影响，为进一步阐述胃癌的发病机制提供实验依据。

1. 材料与方法

1.1. 主要材料

反转录试剂盒购于南京诺唯赞公司，RNA FISH试剂盒购于苏州吉玛基因股份公司，lncRNA 114227小干扰序列由苏州吉玛基因股份公司合成，E-Cadherin、N-Cadherin、MMP2、Vimentin、GAPDH兔源单克隆抗体购于美国Abcam公司。BALB/C(nu/nu)雌性裸鼠(4周龄)购于常州卡文斯实验动物有限公司(实验动物合格证号：202019236)。

1.2. 方法

1.2.1. 临床组织标本的收集

收集2019年至2021年镇江康复医院的25例正常胃黏膜组织和25例胃癌组织标本。本研究已通过江苏大学医学伦理委员会批准。

1.2.2. 细胞培养及转染

人胃癌细胞株(BGC-823、MGC-803、SGC-7901 和HGC-27)及人胃黏膜上皮细胞(GES-1)培养于含10%胎牛血清的DMEM中，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱。实验分为4组：阴性对照(NC)组、lncRNA 114227小干扰(si-lncRNA 114227)组、空载体(Vector)组、过表达载体(OE-lncRNA 114227)组。按照转染说明书进行转染，转染6 h后更换为新鲜完全培养基进行后续实验。siRNA序列如表1所示。

表1.

siRNA序列

Table 1 Sequences of siRNAs

名称	序列(5'-3')
si-lncRNA 114227正向	GGACAAAGAAUUUCCACUUTT
si-NC正向	UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

1.2.3. LncRNA 114227在胃癌组织及细胞系中的表达

采用real-time RT-PCR进行检测。按照TRIzol试剂说明书提取组织和细胞的总RNA，检测RNA的浓度和纯度，其中组织RNA采用超声破碎裂解；根据反转录说明书将样本反转录为cDNA模板。反转录程序：50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min。扩增后，采用2^-ΔΔCt法分别计算GAPDH和lncRNA 114227的相对表达量。Real-time RT-PCR反应条件：首先95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环。Real-time RT-PCR引物序列如表2所示。

表2.

实时反转录聚合酶链反应引物序列

Table 2 Sequences of real-time RT-PCR primers

名称		序列(5'-3')
GAPDH	正向引物	GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
	反向引物	TGGTGAAGACGCCAGTGGAC
LncRNA 114227	正向引物	CTCTGCTGTAACTATGGTTGTGT
	反向引物	CTGGGTAAAGGGTAAGTGGAAAT

1.2.4. RNA FISH检测lncRNA 114227细胞系定位

根据RNA FISH试剂盒说明书进行操作。Cy3标记lncRNA 114227探针，通过共聚焦荧光显微镜检测细胞内荧光信号的表达差异。

LncRNA 114227探针序列：5'-GGTAAACCTGG-GTAAAGGGTAAGTG-3'。

1.2.5. 蛋白质印迹法检测相关蛋白质的表达

用RIPA裂解液提取细胞总蛋白质，于-20 ℃保存备用。采用超声破碎后提取组织蛋白质。用12% SDS-PAGE分离蛋白质后，用300 mA电流转膜 120 min，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗于4 ℃孵育过夜。使用TBST洗膜，每次15 min，洗涤4次。用二抗孵育1 h后，TBST洗膜同上。使用ECL试剂呈现图像，Image J软件灰度扫描并计算蛋白质的相对表达量。

1.2.6. CCK-8实验检测胃癌细胞增殖能力

收集转染48 h后的细胞，以1 000/孔的密度种于96孔板，每组设3个复孔。各孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱培养1 h，用酶标仪检测450 nm波长处各孔的吸光度值。

1.2.7. Transwell实验和划痕愈合实验检测胃癌细胞 迁移能力

收集转染后48 h的细胞，用无血清培养基重悬细胞后，将20 000个/孔细胞种于Transwell小室上室，600 μL完全培养基置于下室。16 h后取出小室，用4%多聚甲醛于室温固定30 min，结晶紫染色 30 min，蒸馏水清洗2次，风干后于显微镜下拍摄。

待转染48 h的细胞长满后，用枪头笔直划线，PBS洗涤后加入无血清培养基置于细胞培养箱中孵育。分别在划线后0、24 h于镜下观察细胞的迁移情况。

1.2.8. 裸鼠皮下荷瘤实验检测胃癌细胞体内增殖和迁移能力

取对数生长期的HGC-27细胞分别转染空载质粒和过表达质粒，48 h后消化，用PBS重悬。注射细胞悬液于裸鼠背部，1个月后观察小鼠的荷瘤情况。安乐死处理裸鼠后，称量裸鼠的质量和体积。

1.3. 统计学处理

采用Graphpad Prism 8.0进行数据处理。计量资料用均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. LncRNA 114227在胃组织和细胞系中的表达 及定位情况

Real-time RT-PCR检测结果显示：lncRNA 114227在胃癌组织表达相对较低于正常胃黏膜组织[(1.119 0±0.296 3) vs (0.643 4±0.463 9)，P<0.01；图1A]；lncRNA 114227在4种胃癌株BGC-823、SGC-7901、MGC-803及HGC-27中相对表达量分别为0.005 8±0.001 6、0.046 3±0.005 0、0.132 6±0.005 4、0.007 9±0.001 6，均低于胃黏膜上皮细胞GES-1相对表达量(1.007 0±0.147 5)，差异均有统计学意义(均P<0.01，图1B)。RNA FISH结果显示：Cy3标记的lncRNA RNA探针主要位于细胞核中(图1C)。

图1.

LncRNA114227在胃癌组织及细胞中的表达及定位

Figure 1 Expression and location of lncRNA114227 in gastric tissues and cells

A: Expression levels of lncRNA 114227 in gastric mucosal tissues and gastric cancer tissues; B: Expression levels of lncRNA 114227 in gastric epithelial cells and gastric cancer strains; C: Localization of lncRNA 114227 in GES-1 and MGC-803 (×600). **P<0.01 vs the GES-1. DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole.

2.2. LncRNA 114227对胃癌细胞增殖能力的影响

Real-time RT-PCR检测结果显示：与NC组相比，沉默后lncRNA 114227的RNA表达量降低[(0.166 0±0.038 0) vs (0.771 6±0.112 3)，P<0.01；图2A]；过表达后RNA表达量明显升高[(75.200 0±17.310 0) vs (1.004 0±0.034 6)，P<0.01；图2B]。提示模型构建成功。CCK-8实验结果显示：沉默lncRNA 114227后的细胞吸光度值高于NC组(P<0.05，图2C)，过表达后的细胞吸光度值低于Vector组(P<0.01，图2D)。表明lncRNA 114227具有抑制胃癌细胞增殖的能力。

图2.

LncRNA 114227对胃癌细胞增殖能力的影响

Figure 2 Effect of lncRNA 114227 on proliferation of gastirc cancer cells

A: LncRNA 114227 expression levels of MGC-803 after NC or si-lncRNA 114227 transfection; B: Expression levels of lncRNA 114227 of HGC-27 after Vector or OE-lncRNA 114227 transfection; C: Growth curves of MGC-803 transfected NC and si-lncRNA 114227; D: Growth curves of HGC-27 transfected with Vector and OE-lncRNA 114227. *P<0.05, **P<0.01.

2.3. LncRNA 114227对胃癌细胞迁移能力的影响

Transwell实验结果显示：lncRNA 114227沉默后MGC-803细胞数目明显多于NC组[(608.7±30.5)个 vs (357.0±33.4)个，P<0.01；图3A]，过表达后HGC-27细胞数目明显少于Vector组[(390.3±39.3)个 vs (1 109.0±32.9)个，P<0.01；图3B]。划痕愈合实验结果显示：相比于NC组，lncRNA 114227沉默后MGC-803的愈合速度明显加快[(72.49±0.84)% vs (67.96±0.38)%，P<0.01；图3C]，过表达后HGC-27细胞的愈合速度明显减慢[(35.28±1.75)% vs (45.63±1.50)%，P<0.01；图3D]。表明lncRNA 114227具有抑制胃癌细胞迁移的能力。

图3.

LncRNA 114227对胃癌细胞迁移的影响

Figure 3 Effect of lncRNA 114227 on migration of gastric cancer cells

A: Migration cell number of MGC-803 after NC or si-lncRNA 114227 transfection (×100); B: Migration cell number of HGC-27 after Vector or OE-lncRNA 114227 transfection (×100); C: Wound healing rate of MGC-803 after NC or si-lncRNA 114227 transfection (×40); D: Wound healing rate of HGC-27 after Vector or OE-lncRNA 114227 transfection (×40). **P<0.01.

2.4. LncRNA 114227对EMT相关分子表达的影响

蛋白质印迹法结果显示：lncRNA 114227沉默后MGC-803细胞的EMT相关蛋白E-Cadherin表达量降低，N-Cadherin、MMP2及Vimentin表达量升高(均 P<0.05，图4A)，lncRNA 114227过表达HGC-27后呈现与此相反的结果(均P<0.01，图4B)。

图4.

LncRNA 114227对胃癌细胞EMT相关蛋白质表达的影响

Figure 4 Effect of lncRNA 114227 on EMT-related proteins expressions of gastric cancer cells

A: EMT-related protein expressions of MGC-803 transfected NC or si-lncRNA 114227; B: EMT-related protein expressions of HGC-27 transfected with Vector or OE-lncRNA 114227. *P<0.05, **P<0.01.

2.5. LncRNA 114227对胃癌细胞体内增殖和迁移的影响

裸鼠皮下荷瘤实验结果显示：OE-lncRNA 114227组荷瘤小鼠的成瘤体积明显小于Vector组 (图5A)，成瘤质量低于Vector组(P<0.05，图5B)。在裸鼠组织中，过表达lncRNA 114227后E-Cadherin表达量升高，N-Cadherin、Vimentin和MMP2表达量降低(均P<0.05，图5C)，与体外实验的结果一致。

图5.

LncRNA 114227对胃癌细胞体内增殖的影响

Figure 5 Effect of lncRNA 114227 on proliferation of gastric cancer cells in vivo

A: Tumor size of the Vector group and the OE-lncRNA group; B: Tumor weight of the Vector group and the OE-lncRNA group; C: EMT-related protein expressions of nude mice tumor tissues transfected Vector or OE-lncRNA 114227. *P<0.05, **P<0.01. EMT: Epithelial-mesenchymal transformation.

3. 讨 论

全球每年约有100万人确诊为胃癌^[7]，且呈年轻化趋势^[8]，早期诊断与筛查有助于胃癌患者的临床诊断和治疗，因此寻找胃癌有效监测和检测标志物对于胃癌患者的诊断、治疗及预后有重要意义。近年来研究^[9-11]表明lncRNAs可通过直接或间接与RNA、蛋白质等结合参与肿瘤细胞的增殖、转移、血管生成、耐药及免疫逃避等行为。据文献^[12]报道：LEF1-AS1通过miR-5100/DEK轴促进胃癌自噬的发生；SNHG22在胃癌组织中的上调提示不良预后，其激活Wnt相关信号通路促进胃癌的增殖和迁移，且胃癌来源的SNHG22通过间接调控HMGA1进而促进血管生成^[13]。

LncRNA 114227是新发现的一种RNA，在胃癌中的表达及其功能尚未十分明确。本研究主要探讨其对胃癌细胞增殖与迁移能力的影响，结果显示lncRNA 114227在胃癌组织及胃癌细胞系中表达量较低，且位于胞核中。比较其在4种胃癌细胞株(BGC-823、SGC-7901、HGC-27及MGC-803)中的表达水平发现，在HGC-27中表达水平最低，MGC-803中表达水平最高。因此，在HGC-27中构建过表达模型，在MGC-803中构建敲减模型。在敲减和过表达细胞模型成功构建的基础上，进一步研究lncRNA 114227在胃癌细胞中的生物学行为，发现lncRNA 114227过表达后胃癌细胞增殖能力明显减弱，沉默后胃癌细胞增殖能力增强，与lncRNA 114227在胃癌组织和胃癌细胞株相对表达量的结论相符。

正常细胞在遗传、化学、物理等多种因素作用下，经历增殖、迁移和侵袭、血管生成、淋巴结转移等过程发展为恶性肿瘤。EMT是其中的重要环节^[14-15]，其特点是细胞失去上皮细胞黏连功能，发展为转移能力较强类似间充质细胞功能的一类细胞。参与EMT进程的蛋白质中主要是E-Cadherin表达降低，N-Cadherin和Vimentin表达升高。研究^[16]发现lncRNA DGCR5间接上调PTEN，进而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。LncRNA p4516通过上调Vimentin、Snail等EMT有关蛋白表达促进胃癌的进展^[17]。本研究发现过表达lncRNA 114227后能明显抑制胃癌细胞的EMT进程，沉默后呈现与此相反的结果。提示lncRNA 114227可能通过EMT抑制胃癌的发生、发展。值得注意的是，lncRNAs在细胞中的定位决定了其可能的调控方式。细胞质中的lncRNAs主要与细胞质中的microRNA竞争结合，从而影响转录后水平的表达^[18]，而胞核中的lncRNAs主要参与核染色质重塑^[19]，通过与DNA、转录因子等结合，调节有关基因的表达^[20]。lncRNA 114227位于细胞核，还需要通过RNA免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀等技术确定与靶基因有关的调控机制，其作为肿瘤诊断标志物用于临床诊断还需进一步验证。

综上所述，lncRNA 11227在胃癌组织及胃癌细胞株中低表达，可能通过EMT进程延缓胃癌细胞的增殖和迁移。

基金资助

国家自然科学基金(81772157)。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81772157).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

甘海宁、向惠英 实验操作，论文撰写与修改；奚悦、姚敏 数据采集及统计分析；邵晨 论文修改；邵世和 实验设计和指导，论文修改。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202302157.pdf