肝脏X受体激动剂TO901317对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病小鼠认知功能的影响及其机制

Abstract

目的

肝脏X受体(liver X receptor，LXR)是核受体超家族中的一员，其中LXR-β是脑细胞内胆固醇含量的重要感受器，而LXR-β/类视黄醇X受体(retinoic X receptor，RXR)-α/ATP结合盒转运子A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)胆固醇跨膜转运体系与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的发生、发展密切相关。LXR激动剂TO901317能影响APP/PS1双转基因小鼠脑组织中β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)的生成，但其具体机制尚未阐明。本研究旨在观察LXR激动剂TO901317对高胆固醇饲料饲喂的AD小鼠的认知功能的影响，并从胆固醇代谢的角度探讨其可能的机制。

方法

选取24只雄性6月龄APP/PS1双转基因AD小鼠，并随机分为4组，即普通饲料(control)组、高胆固醇饮食(cholesterol rich diet，CRD)组、CRD联合LXR激动剂TO901317饲喂组(TO901317组)以及CRD、TO901317联合LXR拮抗剂GSK2033饲喂组(GSK2033组)，每组各6只。以CRD为基础饲料混合猪油、蛋黄粉、鱼肝油等加工制成的颗粒饲料，按每天两次饲喂小鼠；药物组在CRD的同时给予药物，TO901317及GSK2033溶解后均稀释至最终浓度0.03%，并按照小鼠体重通过胃管每日灌胃给药，各组总治疗时间为3个月。饲喂3个月后，采用Morris水迷宫实验观察各组小鼠空间探索和记忆能力的变化；酶标仪比色法检测各组小鼠血清中TC、LDL和HDL的含量；ELISA法检测各组AD小鼠脑组织中Aβ₄₂的表达情况；蛋白质印迹法检测各组小鼠脑组织LXR-β、RXR-α、ABCA1和Caveolin-1蛋白质水平的变化。

结果

Morris水迷宫实验结果显示：与control组相比，CRD组小鼠穿越平台的次数、距离和时间均显著降低(均P<0.05)；相较于CRD组，TO901317组小鼠穿越平台的次数、距离和时间显著增加(均P<0.05)；而相较于TO901317组，GSK2033组上述指标均降低(均P<0.05)。酶标比色仪检测结果显示：CRD组小鼠血清中TC和LDL含量较control组显著增加，而HDL却显著减少(均P<0.001)；TO901317组中TC和LDL含量较CRD组减少，HDL含量增加(均P<0.001)；GSK2033组小鼠血清中TC和LDL含量较TO901317组却显著增加，HDL含量显著减少(均P<0.001)。ELISA结果显示：4组中CRD组小鼠脑内的Aβ₄₂生成量最多；与CRD组比较，TO901317组小鼠脑内的Aβ₄₂量显著减少(P<0.001)，4组中含量最低；control组与GSK2033组含量接近。蛋白质印迹法结果显示：CRD组中LXR-β、RXR-α、ABCA1蛋白质水平较control组显著降低，Caveolin-1蛋白质水平却明显升高(均P<0.01)。而经TO901317处理后，AD小鼠脑组织中LXR-β、RXR-α、ABCA1蛋白质水平明显升高，Caveolin-1蛋白质水平降低(均P<0.001)；在GSK2033组中，TO901317对AD小鼠的影响被GSK2033部分逆转，相较于TO901317组，小鼠脑内的LXR-β、RXR-α、ABCA1蛋白质水平降低，Caveolin-1蛋白质水平升高(均P<0.05)。

结论

CRD导致转基因AD小鼠产生更加严重的空间探索障碍和学习记忆能力障碍，而LXR激动剂TO901317减轻了这一效应。其机制可能为TO901317通过激活LXR-β/RXR-α/ABCA1跨膜转运体系促进胆固醇外排，降低Caveolin-1的表达并改善脂筏的构成，最终降低脑内Aβ₄₂的生成。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的进行性退行性变疾病，是老年人群痴呆的主要类型，其病理改变主要表现为β淀粉样蛋白(β- amyloid protein，Aβ)在脑组织中的过度生成并沉积而形成老年斑、Tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结以及神经元死亡等。AD的发病机制不清，是多因素、多机制共同作用的结果^[1]，高胆固醇在AD的发生、发展等过程中发挥了关键作用^[2]，已有研究^[3]证实他汀类降胆固醇药物可延缓AD的发展过程，并改善患者的认知功能。脑内富含胆固醇，但其自身不能降解，过多的胆固醇主要是通过ATP结合盒转运子跨膜转运体系从神经细胞内排出。在此转运过程中，首先肝脏X受体(liver X receptor，LXR)和类视黄醇X受体(retinoic X receptor，RXR)结合，生成异二聚体，然后与靶基因上增强子区域中的LXR反应原件结合，从而调控靶基因ATP结合盒转运子A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)的表达，促进胆固醇的外排，进而降低细胞内的胆固醇。ABCA1跨膜胆固醇转运体系的激活通过降低胆固醇的生成，在Aβ的沉淀及清除中发挥重要作用，这一机制为防治AD药物的开发提供了新的靶点^[4]。本研究以APP/PS1双转基因AD小鼠为研究对象，分别给予普通饲料、高脂饲料、LXR激动剂TO901317或/和LXR抑制剂GSK2033饲喂，旨在观察AD小鼠空间探索和学习记忆能力，小鼠血液中TC、LDL和HDL的含量及脑内Aβ₄₂生成的变化，探讨其可能的机制，以期为寻找新的AD治疗药物和靶点提供更多的理论基础和实验证据。

1. 材料与方法

1.1. 材料

1.1.1. 实验动物

24只雄性双转基因小鼠AD小鼠Tg2576(APPswe/PSEN1dE9)购自南京大学模式动物研究所。所有小鼠饲养于重庆医科大学动物实验中心，室内温度维持在(25±1) ℃，每天给予12 h光照、SPF级饲料和水。

1.1.2. 主要试剂

LXR激动剂TO901317和LXR拮抗剂GSK2033购自美国Medicine Chemistry Express公司；Aβ₄₂的ELISA检测试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；总蛋白质抽提试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒和RIPA蛋白质裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；所有的抗体均购自英国Abcam公司；TC、LDL和HDL检测试剂盒购自南京建成生物研究所。

1.2. 方法

1.2.1. 实验分组

将所有AD小鼠随机分为4组，即普通饲料(control)组、高胆固醇饮食(cholesterol rich diet，CRD)组、TO901317组(CRD联合LXR激动剂TO901317)以及GSK2033组(CRD、TO901317联合LXR拮抗剂GSK2033)，每组各6只。

CRD的成分及饲喂：基础饲料(70%，包含玉米、豆粕、鱼粉、面粉、酵母粉、植物油、食盐、多种维生素和矿物元素等)、奶粉(10%)、猪油(10%)、蛋黄粉(10%)、鱼肝油(10滴)等成分混合后，加工制成颗粒饲料，使用前在冰箱中保存，按每天2次饲喂。

TO901317组和GSK2033组的饲喂：药物组同时给予CRD和相应药物。将TO901317溶解在二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，并用双蒸馏水稀释至最终浓度0.03%。给药剂量为每只小鼠每天 15 mg/kg；GSK2033的饲喂方法与TO901317相同，剂量为每只小鼠每天10 mg/kg^[5]。所有药物均通过胃管灌胃给药，各组总治疗时间为3个月。所有小鼠均顺利完成实验。

1.2.2. Morris 水迷宫实验

饲喂3个月后，采用Morris水迷宫实验观察各组小鼠空间探索和记忆能力的变化。实验第1天，将插有小红旗的平台固定于水迷宫装置的第2象限，并且保证平台漏出水面约1 cm。任意选择一个象限，将AD小鼠依次放入水中，并开始计时，记录小鼠找到并登上平台的时间。若小鼠在1 min内成功登上平台，则准确记录其时间(称作逃避潜伏期)；若小鼠在1 min后仍未找到平台，记录其潜伏期为60 s，则手动引导AD小鼠至平台附近使之爬上平台并停留 10 s。实验第2至第5天，使水面略高于平台约1 cm，按照第一天的顺序放入小鼠，每只小鼠每天训练5次，每一轮的训练至少间隔1 h，记录逃避潜伏期。实验第6天，将平台撤掉，任意选择一象限(第3象限)放入小鼠，使之在池内游泳1 min，观察小鼠的游泳轨迹，记录小鼠穿越原平台所在象限(第3象限)的次数、游泳的时间和距离。

1.2.3. ELISA法

采用ELISA法检测各组小鼠脑组织中Aβ₄₂的浓度。严格按照试剂盒说明进行操作。收集各组脑组织，并加入蛋白裂解液，充分裂解离心后获得待测样品悬液。取出96孔板，加入标准品、待测样品，同时设空白对照组。采用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度值，根据标准曲线计算出Aβ₄₂的浓度。

1.2.4. 血清TC、LDL和HDL检测

按照说明书进行酶标比色法测量。获得各组血清后按照空白管(2.5 µL蒸馏水、250 µL试剂)、标准管(2.5 µL标准品、250 µL试剂)、测定管(2.5 µL血清、250 µL试剂)的方法进行加样，分别混匀后于37 ℃水浴5 min，以空白管调零，分别在510 nm、546 nm波长下比色，读取各管吸光度值，测定TC、LDL和HDL的浓度。样本TC(LDL或HDL)含量=(样本管吸光度值-空白管吸光度值)/(标准管吸光度值-空白管吸光度值)×校准品浓度。

1.2.5. 蛋白质印迹法

收集各组脑组织，加入1 mL RIPA蛋白裂解液，充分裂解后于4 ℃，以13 000 r/min离心15 min，用Bradford法测定每组蛋白质样品浓度并分装保存。配置8%~10%的Page胶，取50 μg经SDS-PAGE电泳，将蛋白质电转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉在室温下封闭2 h，然后加入TBST缓冲液稀释的LXR-β、RXR-α、ABCA1、Caveolin-1和内参β-actin抗体，于4 ℃孵育过夜；充分洗涤后加入1꞉5 000的HRP标记的羊抗兔二抗，室温下孵育2 h，最后用化学发光试剂盒行曝光显影，经Bio-rad凝胶成像系统进行条带分析。

1.3. 统计学处理

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料均采用均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示。两样本均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. LXR激动剂TO901317改善小鼠的空间探索和学习记忆能力

在实验的第6天撤掉平台后，对小鼠游泳运动的轨迹分析结果显示：与control组相比，CRD组在原固定平台所在第3象限内穿越平台的次数、穿越的距离和穿越的时间均显著减少(均P<0.05)；与CRD组相比，TO901317组小鼠穿越平台的次数、距离和时间均明显增加(均P<0.05)；与TO901317组相比，GSK2033组小鼠穿越平台的次数、距离和时间又显著减少(均P<0.05，图1)。

图 1.

LXR激动剂TO901317改善双转基因AD小鼠的空间探索和学习记忆能力

Figure 1 LXR agonist TO901317 improved spatial exploration and ability of learning and memory in double transgenic AD mice

A: Number of times of the AD mice crossed the quadrant of the original platform in each group; B: Distance of the AD mice acrossed the quadrant of the original platform in each group; C: Time of the AD mice acrossed the quadrant of the original platform in each group; D: Movement trajectory diagram of AD mice in each group in the water maze. *P<0.05 vs the control group; †P<0.05 vs the CRD group; ‡P<0.05 vs the TO901317 group. AD: Alzheimer’s disease; CRD: Cholesterol rich diet.

2.2. LXR激动剂TO901317降低小鼠脑组织中Aβ₄₂ 的含量

ELISA结果显示：4组中CRD组小鼠脑组织中的Aβ₄₂生成量最多，TO901317组最少。与control组比较，CRD组AD小鼠脑组织中Aβ₄₂的含量明显增多[(39.84±3.15) pg/mL vs (52.36±3.28) pg/mL，P<0.001]；与CRD组比较，TO901317组Aβ₄₂的含量显著减少[(28.51±2.74) pg/mL，P<0.001]；而GSK2033部分抵消了TO901317的作用，与TO901317组相比，GSK2033组小鼠脑组织中Aβ₄₂的含量显著增多[(43.48±3.56) pg/mL；P<0.001，图2]。

图2.

LXR激动剂TO901317降低转基因AD小鼠脑组织中Aβ₄₂ 的含量

Figure 2 LXR agonist TO901317 reduced the content of Aβ₄₂ in the brains of transgenic AD mice

***P<0.001 vs the control group; †††P<0.001 vs the CRD group; ‡‡‡P<0.001 vs the TO901317 group.

2.3. LXR激动剂TO901317对小鼠血清TC、LDL 和HDL含量的影响

酶标仪比色法检测结果显示：与control组相比，CRD组小鼠血清中的TC和LDL含量增加，而HDL的含量却显著减少(均P<0.001)；与CRD组相比，TO901317组小鼠血清中的TC和LDL含量减少，HDL含量增加(均P<0.001)。再给予LXR拮抗剂GSK2033处理后，与TO901317组相比，GSK2033组小鼠血清中的TC和LDL的含量显著增加，而HDL的含量显著减少(均P<0.001，表1)。

表1.

各组转基因AD小鼠血清中TC、LDL和HDL的含量(n=6， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Table 1 TC, LDL, and HDL levels in serum in each group of transgenic AD mice (n=6, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

组别	TC/(mmol·L-1)	LDL/(mmol·L-1)	HDL/(mmol·L-1)
Control	2.49±0.11	0.76±0.14	1.55±0.09
CRD	3.57±0.17***	2.54±0.18***	0.66±0.07***
TO901317	2.72±0.19†††	1.03±0.23†††	1.29±0.15†††
GSK2033	3.31±0.15‡‡‡	1.83±0.12‡‡‡	0.86±0.11‡‡‡
F	60.841	130.937	82.252
P	<0.001	<0.001	<0.001

***P<0.001 vs the control group; †††P<0.001 vs the CRD group; ‡‡‡P<0.001 vs the TO901317 group. AD: Alzheimer’s disease; CRD: Cholesterol rich diet; TC: Total cholesteol; LDL: Low density lipoprotein; HDL: High density lipoprotein.

2.4. LXR激动剂TO901317对小鼠脑组织中LXR-β、RXR-α、ABCA1和Caveolin-1蛋白质水平的影响

与control组比较，CRD组小鼠脑组织中LXR-β、RXR-α和ABCA1的蛋白质水平均显著降低，而Caveolin-1蛋白质水平显著升高(均P<0.01)；与CRD组比较，TO901317组小鼠脑内的LXR-β、RXR-α和ABCA1蛋白质水平均有显著升高，而Caveolin-1蛋白质水平降低(均P<0.001)。再给予LXR拮抗剂GSK2033处理后，与TO901317组比较，GSK2033组小鼠脑内的LXR-β、RXR-α、ABCA1蛋白质水平又显著降低，而Caveolin-1蛋白质水平则升高(均P<0.05，图3)。

图3.

LXR激动剂TO901317对转基因AD小鼠脑组织中LXR-β、RXR-α、ABCA1和Caveolin-1蛋白质表达的影响

Figure 3 Effects of TO901317 on the expressions of LXR-β, RXR-α, ABCA1, and Caveolin-1 protein in the brains of transgenic AD mice

A: Protein expressions of LXR-β, RXR-α, ABCA1, and Caveolin-1 in the brain of rats in each group. B: Statistical analysis of expressions of LXR-β, RXR-α, ABCA1 and Caveolin-1 protein in the brain of mice in each group. **P<0.01 vs the control group; †††P<0.001 vs the CRD group; ‡P<0.05 vs the TO901317 group. AD: Alzheimer’s disease; CRD: Cholesterol rich diet; LXR-β: Liver X receptor-β; RXR-α: Retinoic X receptor-α; ABCA1: ATP binding cassette transporter A1.

3. 讨 论

虽然AD的发病机制尚不清楚，但Aβ在脑组织中的过度生成并积聚是各种原因诱发AD的共同通路，也是目前公认的关键的致病因素。Aβ是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经过体内多次分解形成的一段多肽。在正常神经元内，APP经β-和γ-分泌酶的切割分解后形成Aβ，Aβ又被降解，以维持在低浓度水平。Aβ的降解途径有3种：1)细胞外可溶性的Aβ单体直接由相应的蛋白酶分解；2)Aβ由ABCA1、ApoE多种因子等介导的细胞内吞作用吞噬，再与溶酶体融合后，被相应的蛋白酶水解；3)Aβ结合特定的分子(如HDL、LDL等)后，通过血脑屏障在外周组织内完成降解。在形成和降解过程中，任一环节出现异常，都会导致Aβ的生成增多并沉积，最终导致AD的发生；而干预其中任一环节，则会抑制Aβ的形成或促进其降解，降低其沉积的可能，进而抑制AD的发生、发展^[6]。

脑是富含胆固醇的器官，其含量占人体总胆固醇的25%。由于血脑屏障的存在，一方面，脑组织不能直接从血液循环中获取胆固醇，而是靠星形胶质细胞和神经元合成胆固醇；另一方面，脑内过多的胆固醇也不能直接降解或直接排到血液中，而主要是通过ABCA1跨膜转运体系来促进胆固醇的外排，减少因过多胆固醇堆积造成的神经元损害^[7]。与先前的报道^[8-9]结果一致，本研究用富含胆固醇的食物饲喂转基因AD小鼠后发现：AD小鼠认知功能障碍明显加重，脑内Aβ的含量增多，血清中的TC和LDL含量也显著增高，而HDL的含量却减少。这都表明胆固醇代谢紊乱与AD的发病机制有着重要的关联。

ABCA1跨膜转运体系通常单向转运胆固醇，它是以ABCA1为核心，以贫脂的载脂蛋白(如apoA1、HDL)为受体，主要通过LXR和RXR结合形成二聚体，进而调控胞内游离胆固醇和磷脂偶联后向外转运，整个过程都需要ATP的供能。LXR是核受体超家族的一员，也是多种细胞内胆固醇含量的感受器。LXR有LXR-α和LXR-β两种亚型，其中LXR-β在机体内广泛分布，以脑组织含量最为丰富，是肝脏组织的2~5倍。RXR存在RXR-α、RXR-β和RXR-γ 3种亚型，其中RXR-α主要表达于脑组织的海马和新皮质区。当脑细胞内胆固醇含量增高时，激活的LXR-β配体进一步激活LXR-β，并与RXR-α形成异二聚体，接着结合靶基因上特异的脱氧核糖核酸元件，从而调节靶基因(如ABCA1)在转录水平上的表达，LXR-β/RXR-α/ABCA1胆固醇跨膜转运体系与AD的发生、发展过程有着密切联系。Lei等^[10]研究显示：LXR激活剂TO901317可通过激活LXR-α/ABCA1轴减轻Aβ_1-40诱导的人视网膜色素上皮细胞的炎症及衰老反应。Martens等^[11]利用LXR激动剂24(S)-Saringosterol处理6月龄AD转基因鼠APPswe/PS1dE9后，发现小鼠脑内的Aβ沉积显著减少，记忆能力也增强。Fitz等^[12]使用TO901317治疗APP23转基因小鼠时发现：TO901317可减少高脂饮食饲喂导致的脑组织中Aβ的沉积，促进Aβ清除，并改善认知功能。这些体内、体外实验都表明LXR激动剂能抑制Aβ生成以及减轻Aβ引起的各种不良反应，但其机制并未阐明。本研究也发现TO901317处理CRD饲喂的转基因AD小鼠后，小鼠损伤的学习记忆能力和空间探索能力得到提升，脑组织中Aβ₄₂的含量也减少，同时血清中TC和LDL的含量减少，而HDL的含量却增加。此外，本研究结果显示：高脂饲料饲喂能引起AD小鼠脑组织中LXR-β、RXR-α、ABCA1蛋白质表达水平降低，但TO901317却能减弱这一效应；而在TO901317联合LXR拮抗剂GSK2033后，与单用TO901317相比，LXR-β、RXR-α、ABCA1蛋白质的表达水平降低，这提示TO901317可通过激活LXR-β/RXR-α/ABCA1胆固醇跨膜转运体系促进AD小鼠脑内Aβ的生成，进而改善认知功能。

本研究还发现：激活LXR-β/RXR-α/ABCA1通路影响Aβ生成与细胞膜上的脂筏结构相关。脂筏是质膜上富含胆固醇和神经鞘脂的微结构区域，分布着大量的膜蛋白受体，是一种动态结构。脂筏与信号转导 ^[13]、物质转运^[14]以及神经突触的可塑性^[15]均有密切的关系。越来越多的证据表明脂筏与Aβ生成有关，主要表现在以下3个方面：1)脂筏上含有Aβ降解所需的β-分泌酶和γ-分泌酶^[16]；2)脂筏上存在ABCA1、ApoE等，它们可结合Aβ^[17-18]；3)在AD的典型发病区，如大脑皮层和海马区域的神经元中脂筏含量要明显高于其他脑区^[19]。作为细胞膜脂筏结构小凹的标志蛋白Caveolin-1，它不仅与AD发生时胆固醇稳态失调有关，还参与了APP的裂解和Aβ的生成^[20-21]。因此，脂筏是神经元Aβ生成的关键场所，降低胆固醇的含量不仅会改变脂筏的构成，也会影响Aβ的生成过程。本研究结果显示：TO901317降低了AD小鼠脑中的脂筏标志蛋白Caveolin-1的表达，而GSK2033却能部分拮抗TO901317的作用。

综上所述，高胆固醇饮食能引起AD小鼠更加严重的认知功能损伤，其机制可能是神经元胆固醇的转运障碍导致脂筏的结构异常，从而引起Aβ的生成增加，进而促进AD的发生、发展。而LXR激动剂TO901317却能改善这一效应，其主要机制则可能是通过激活LXR-β/RXR-α/ABCA1通路，促进胆固醇的外排，调整脂筏的构成，从而最终减少Aβ的生成。

基金资助

重庆市自然科学基金(Cstc2019jcyj-msxmX0673)。

This work was supported by the Natural Science Foundation of Chongqing, China (Cstc2019jcyj-msxmX0673).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

罗英茂 实验操作，论文撰写；李远、黄杰 动物饲喂及样品收集处理；谭小林、张雄 数据收集及统计分析；邓煜 研究设计，实验操作统筹及论文修改。所有作者阅读并同意最后的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2022101324.pdf