纳米银制备工艺优化及其生物活性

Abstract

Objective

Recently, the use of biological synthesis of metal nanoparticles has attracted widespread attention. Researchers are trying to find a biological method to synthesize silver nanoparticles with little environmental pollution and easy preparation, and to explore the impact of preparation conditions on the synthesis of silver nanoparticles. This study aims to explore the biological synthesis of silver nanoparticles (AgNPs) with controllable size and good effect and to compare their biological activity with that of AgNPs prepared by chemical method.

Methods

In this study, AgNPs were prepared by biological method with water extract of Tricholomagambosum (WET) and cell-free supernatant of Lactobacillus crispatus (CFS) as reducing agent and protective agent, and silver nitrate solution as precursor. Meanwhile, AgNPs was synthesized by sodium citrate chemical method. The effects of temperature, pH, dosage of extraction solution and light conditions on the biosynthesis of WET-AgNPs and CFS-AgNPs were investigated, and their characteristic of the synthesized WET-AgNPs and CFS-AgNPs were analyzed. Finally, the antibacterial effect, toxicity and selectivity of the 3 different AgNPs were compared.

Results

AgNPs were synthesized successfully by the 3 methods with various characteristics. The AgNPs prepared by biological method (WET-AgNPs, CFS-AgNPs) were greatly affected by pH and temperature. The WET-AgNPs and CFS-AgNPs prepared by the biological methods had better antibacterial effect than the AgNPs by the chemical method (all P<0.01). Between them, the WET-AgNPs had a slightly higher antibacterial effect than the CFS-AgNPs. Compared with the AgNPs prepared by chemical method, the toxicity of the WET-AgNPs and CFS-AgNPs to normal cells was lower (both P<0.01), and the cell selectivity of the CFS-AgNPs was better when the concentration was 480 μg/mL.

Conclusion

AgNPs with biological activity can be synthesized from WET and CFS, which have different biological activity compared with the AgNPs prepared by biological method.

纳米银粒子(silver nanoparticles，AgNPs)是一种具有独特的光学、电学以及优良的抗菌性能、生物兼容性的纳米材料，已被广泛应用在各种商品中^[1]。AgNPs已被证明具有良好的抗菌活性，与四环素、加替沙星和万古霉素具有协同作用^[2-3]。此外，AgNPs还具有抗病毒、抗肿瘤等优良生物活性^[4]。

AgNPs的合成主要有物理、化学和生物3种方法。物理合成法对仪器设备要求高，生产设备昂贵且耗能高。化学合成法不利于控制AgNPs的形貌尺寸，质量较低，容易发生团聚现象^[5]。而化学合成法虽然可以短时间内合成大量的AgNPs，但原料昂贵，后续的纯化过程较困难，在制备的过程中存在不安全的因素^[6-7]。同时由于在实验过程中使用了有毒的化学试剂，产生了不环保的副产品，有毒性试剂残留等问题，限制了其在食品检测、生物医学领域的应用^[8-9]。生物法具有原料来源广、价廉易得、绿色环保、反应条件温和等优点^[10]。故本研究分别以口蘑水提液(water extract of Tricholomagambosum，WET)、卷曲乳杆菌发酵上清液(cell-free supernatant of Lactobacillus crispatus，CFS)为还原剂和保护剂，AgNO₃溶液为前驱体，采用生物法制备AgNPs，同时采用柠檬酸钠化学法合成AgNPs。本文研究温度、pH、提取液用量、光照条件对生物法合成AgNPs的影响，并对所合成的AgNPs进行表征分析，最后对比了3种制备方法所获得的AgNPs的抗菌效果以及细胞的毒性和选择性。

1. 材料与方法

1.1. 菌株来源及培养条件

CGMCC 1.2743卷曲乳杆菌由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，ATCC10231白色念珠菌由广东省微生物保藏中心提供，菌种于-80 ℃冰箱保存，使用前接种于琼脂培养基，传代2次使其性状稳定。

1.2. 主要仪器和试剂

UV-2450紫外分光光度计购自日本Shimadzu公司；Multiskan FC酶标仪、YZB/USA7322低温保存箱购自上海赛默飞世尔仪器有限公司；PHS-3C酸度计购自上海仪电科学仪器股份有限公司；马尔文粒度分析仪购自英国Malvern公司；Binder CB 37 ℃恒温培养箱购自德国Binder公司；SW-CJ-IFO洁净工作台购自苏州安泰空气科技有限公司；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器购自上海博迅实业有限公司；硝酸银等有机试剂均购自成都市科隆化学品有限公司；胎牛血清、细胞培养基购自美国Gibco公司；人卵巢癌细胞SKOV3、人正常卵巢上皮细胞IOSE均购自湖南丰晖生物科技有限公司。

1.3. 方法

1.3.1. AgNPs的制备

1.3.1.1. 真菌制备AgNPs

取新鲜口蘑、平菇、金针菇、香菇各取20 g，用去离子水清洗菌类表面，用研钵完全碾碎至无明显固体颗粒，加入40 mL去离子水，置于磁力加热搅拌器上，30 ℃恒温加热，在400 r/min离心下搅拌4 h，抽滤得到真菌水提液。用5 mmol/L NaOH溶液调节WET的pH值，取一定体积的WET，在恒温水浴搅拌的条件下，加入新鲜配置的10 mmol/L AgNO₃溶液，并用去离子水调节使其终浓度为1 mmol/L，体积为20 mL。置于不同光照条件下，水浴加热反应数小时，每间隔一定时间取样液测量吸光度值。观察溶液颜色变化。待反应完成时，将合成的AgNPs溶液在12 000 r/min下离心15 min。弃上清液，收集AgNPs颗粒。用超纯水重复离心(12 000 r/min， 15 min)操作3次以纯化。冻干，收集AgNPs粉末。

1.3.1.2. CFS制备AgNPs

在无菌操作台上，将存放于-80 ℃超低温冰箱中冻存的卷曲乳杆菌接种于乳酸细菌培养基，放入CO₂产气袋，在37 ℃下孵育24 h。用接种环选取长势良好的菌落3~5个接种于沙氏葡萄糖液体培养基(sabouraud dextrose agar，SDA)。取96孔板，用移液枪取混匀菌液200 μL/孔，用酶标仪测量其吸光度，减去200 μL SDA液体培养基的吸光度值，得到菌液的吸光度值。调整菌液浓度使其吸光度值在波长为600 nm时为1.5，按2%接种数接种。取200 μL菌液，加入10 mL SDA液体培养基，放置于37 ℃恒温培养箱培养。将培养24 h的卷曲乳杆菌发酵液在6 000 g下离心10 min，利用2 mL注射器吸取适量的上清液，用0.22 μm滤膜过滤，得到CFS，在4 ℃下储存备用。

CFS制备AgNPs的制作方法与1.3.1.1中的制作方法相同。

1.3.1.3. 化学法制备AgNPs

取新鲜配置100 mL的1 mmol/L AgNO₃溶液，置于磁力搅拌器上搅拌加热，逐滴加入5 mL的1%柠檬酸钠溶液，煮沸1 h。观察溶液颜色变化。后面的操作流程与生物合成法相同。

1.3.2. AgNPs的表征分析

1.3.2.1. 紫外-可见光分光光度计分析

利用紫外-可见分光光度计检测体系中AgNPs的合成。从加入AgNO₃溶液后开始，间隔一定时间取样检测。量取一定量的待测溶液，加入一定量的蒸馏水稀释。取稀释后的AgNPs溶胶置于石英样品池中，在波长300~800 nm的范围进行紫外-可见光吸收光谱分析，根据最大吸收波长及其吸光度，可判断AgNPs合成情况。

1.3.2.2. 傅里叶红外光谱分析

使用傅里叶变换红外光谱仪(fourier transform infrared，FTIR)对样品进行扫描，分析生物法制备的AgNPs上可能含有的基团。在进行FTIR分析前，先将制备的AgNPs粉末放置在50 ℃烘箱中干燥30 min，用无水乙醇清洁样品台，用刮刀取少量样品，置于检测仪上，进行样品检测。

1.3.2.3. 粒径及电位分析

为了进一步分析不同制备条件对AgNPs粒径、分散度、稳定性的影响，取不同制备条件的样品，用一定量的去离子水稀释，用马尔文粒度仪测定不同实验条件对AgNPs粒径大小、分散情况以及对电动电位(zeta potential，Zeta)的影响，单位用百分数表示，即该粒径颗粒强度占总强度的百分比。

1.3.2.4. 电子显微镜分析

扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)主要用于分析不同方法合成的AgNPs的形貌和分散情况。能谱仪(energy dispersive spectrometer，EDS)可用于对AgNPs进行元素种类与含量分析，配合SEM或透射电子显微镜的使用。将少量冻干样品溶于水，超声震荡30 min后使其充分溶解，然后置于洁净铜片上，待其晾干后，进行透射电子显微镜分析。将洁净铜片置于SEM中，观察AgNPs粒子的粒径和形貌，并分析AgNPs元素。

1.3.3. KB纸片琼脂扩散实验

采用KB纸片琼脂扩散法测定AgNPs的抑菌效果，通过观察同一浓度、不同制备方法合成的AgNPs对白色念珠菌的抑制圈大小来初步判断AgNPs对供试菌种的抑菌效果。

调整白色念珠菌浓度使其在600 nm时吸光度值为0.1，此时菌液浓度为1×10⁷ 菌落形成单位(colony forming unit，CFU)/mL，用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast extract peptonedextrose medium，YPD)稀释10³倍。用无菌棉花蘸取一定浓度的菌液，均匀地涂满YPD琼脂培养基。将4个无菌的直径为6 mm圆形滤纸片等距放置在培养基上，每个无菌滤纸片分别缓慢滴加40 μL WET-AgNPs、CFS- AgNPs、化学法制备的AgNPs以及超纯水。然后将其放置于37 ℃恒温培养箱孵育24 h。用游标卡尺测量4个抑制圈直径(包含滤纸片)，初步判断AgNPs的抑菌效果大小。

1.3.4. 最低抑菌浓度的测定

最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)是指能抑制细菌生长的最低药物浓度，是测量抗菌药物的抗菌活性大小的一个重要指标。用二倍稀释法调整菌液浓度，使菌液的浓度为1×10⁴ CFU/mL。取96孔板，在第2至5列加入100 μL YPD培养基，在第1、2列加入不同方法制备的AgNPs 100 μL，第2列吹打15次混匀后，取100 μL至第3列，如此连续等比稀释至第5管，混匀后从第5管中吸取100 μL弃去。然后每孔加入100 μL的菌液。此时各孔药物浓度被稀释2倍，此时每孔菌液浓度为5×10³ CFU/mL。将96孔板放置在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，MIC即为肉眼可见的抑制细菌增殖的最低AgNPs浓度。以上实验均平均进行3次。

1.3.5. AgNPs抗癌选择性研究

将对数生长期的人卵巢癌细胞SKOV3、正常卵巢上皮细胞IOSE接种至96孔板，在细胞培养箱孵育。24 h后，分别加入浓度为0、80、160、320、400、480 mg/L的3种AgNPs，37 ℃恒温培养箱中静置孵育24 h。用1×PBS(pH=7.4)洗涤2次去除残留药物后，每孔添加100 μL细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)稀释液，并设置空白对照，继续孵育1 h。用酶标仪在450 nm处测定吸光度值。以无药物处理为阳性对照，空白对照为阴性对照。细胞存活率计算公式如下：

细胞存活率=100%× $\frac{A_{\mathrm{药物}}-A_{\mathrm{阴性}}}{A_{\mathrm{阳性}}-A_{\mathrm{阴性}}}$ 。

式中A _药物为AgNPs处理的吸光度值，A _阴性为空白对照的吸光度值，A _阳性为无药物处理的吸光度值。

1.4. 统计学处理

采用GraphPad 8.3统计学软件进行分析，计量资料用均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 不同材料和制备方法合成的AgNPs

2.1.1. 真菌制备的AgNPs

利用紫外-可见分光光度计检测真菌合成的AgNPs，发现平菇和金针菇反应液在400 nm附近没有明显吸收峰，而香菇及WET在400 nm附近有较强的吸收峰(图1A)。由紫外光谱图可知，WET合成的AgNPs效果最佳，后续实验采用WET为实验材料。

图1.

AgNPs紫外吸收光谱

Figure 1 Ultraviolet absorption spectrum of AgNPs

A: Ultraviolet absorption map of AgNPs from aqueous extracts of different kinds of fungi; B: Ultraviolet absorption spectra of WET-AgNPs and WET; C: Ultraviolet absorption spectra of CFS supernatant and CFS-AgNPs; D: Ultraviolet absorption spectra of AgNPs prepared by chemical method. AgNPs: Silver nanoparticles; WET: Water extract of Tricholomagambosum; CFS: Cell-free supernatant of Lactobacillus crispatus.

利用WET制备AgNPs，随着反应进行，溶液颜色由浅黄色逐渐变为砖红色。通过紫外-可见分光光度计的检测，可以明显发现反应液在450 nm左右有明显的吸收峰，而未加入AgNO₃溶液的WET在400 nm附近没有明显吸收峰(图1B)。

2.1.2. CFS制备的AgNPs

随着反应的进行，溶液颜色由无色逐渐变为砖红色，初步表明有AgNPs的合成。利用紫外-可见分光光度计进行检测，可以发现CFS-AgNPs在450 nm左右有明显的吸收峰，而CFS在450 nm附近没有明显吸收峰(图1C)。

2.1.3. 化学法制备的AgNPs

随着反应的进行，溶液颜色由无色逐渐变为黄色，最后为棕灰色，初步表明有AgNPs的合成。反应液在440 nm左右有明显的吸收峰，而银离子和柠檬酸钠在400 nm附近均无特征峰(图1D)。

2.2. 反应时间对生物法合成AgNPs的影响

通过紫外-可见分光光度计的检测，可以明显发现合成CFS-AgNPs的最佳时间为4 h，合成WET-AgNPs的最佳时间为80 min(图2)。

图2.

反应时间对生物法合成AgNPs的影响

Figure 2 Effect of reaction time on AgNPs prepared by biosynthesis method

A: Ultraviolet absorption spectra of CFS-AgNPs at different times; B: Ultraviolet absorption spectra of WET-AgNPs at different times. AgNPs: Silver nanoparticles; WET: Water extract of Tricholomagambosum; CFS: Cell-free supernatant of Lactobacillus crispatus.

2.3. 反应温度对AgNPs稳定性的影响

为检测反应温度的影响，分别调节溶液反应温度分别为30、50、70、90 ℃，发现随着WET-AgNPs溶液温度的升高，溶液颜色加深，最大吸收波长处的吸光度值逐渐增高(图3A)。粒径及电位测定结果表明50 ℃时，WET-AgNPs的平均粒径为58.17 nm，多分散性指数(polydispersity，PDI)为0.507，电位为-19.7 mV；90 ℃时，平均粒径为48.12 nm，PDI为0.360，电位为-23.9 mV(图3C，3D)。在一定范围内，随着温度升高，WET-AgNPs的粒径略有减小，电位绝对值增加，稳定性增加。

图3.

反应温度对AgNPs稳定性的影响

Figure 3 Influence of reaction temperature on the stability of AgNPs

A: Ultraviolet absorption spectra of WET-AgNPs at different temperatures; B: Ultraviolet absorption spectra of CFS-AgNPs at different temperatures; C, D: Size distribution of WET-AgNPs at 50 ℃ (C) and 90 ℃ (D); E, F: Size distribution map of CFS-AgNPs at 50 ℃ (E) and 90 ℃ (F). AgNPs: Silver nanoparticles; WET: Water extract of Tricholomagambosum; CFS: Cell-free supernatant of Lactobacillus crispatus.

随着CFS-AgNPs溶液温度的升高，最大吸收波长处的吸光度值逐渐增高(图3B)。对应的吸收峰的位置从 430 nm蓝移到420 nm。吸收峰的移动表明溶胶中的银粒子粒径减小。50 ℃时，CFS-AgNPs的平均粒径为111.17 nm，PDI为0.282，电位为-22.4 mV；90 ℃时，AgNPs的平均径为79.23 nm，PDI为0.296，电位为-17.2 mV(图3E，3F)。在一定范围内，随着温度升高，CFS-AgNPs的粒径显著减小，分散性基本不变，电位绝对值略有下降，显示CFS-AgNPs的稳定性略有下降。

上述结果表明在较高温度有利于WET-AgNPs和CFS-AgNPs的合成。考虑经济、操作等方面因素，后期采用水浴70 ℃来进行合成实验。

2.4. 反应溶液pH对生物法合成AgNPs的影响

为探究反应溶液pH对AgNPs合成的影响，使用5 mmol/L NaOH溶液调节水提液pH值分别为6、8、10、12。通过紫外-可见分光光度计的检测，发现随着水提液pH的升高，WET-AgNPs最大吸收波长处的吸光度值逐渐增高(图4A)；CFS-AgNPs最大吸收波长处的吸光度值逐渐增高，同时最大吸收波长从 450 nm移至430 nm(图4B)。

图4.

反应溶液pH对生物法合成AgNPs的影响

Figure 4 Influence of pH of reaction solution on biosynthesis of AgNPs

A: Ultraviolet absorption spectra of WET-AgNPs at different pH; B; Ultravioletabsorption spectra of CFS-AgNPs at different pH; C, D: Size distribution map of WET-AgNPs at pH=8 (C) and pH=12 (D); E, F: Size distribution map of CFS-AgNPs at pH=8 (E) and pH=12 (F). AgNPs: Silver nanoparticles; WET: Water extract of Tricholomagambosum; CFS: Cell-free supernatant of Lactobacillus crispatus.

为进一步确认水提液pH对所合成AgNPs稳定性的影响，将AgNPs用去离子水稀释后通过粒径和电位分析仪进行测定。结果表明WET在pH=8条件下，WET-AgNPs的平均粒径为53.92 nm，PDI为0.292，电位为-20.1 mV；WET在pH=12条件下，平均粒径为48.29 nm，PDI为0.475，电位为-23.5 mV(图4C，4D)。在一定范围内，随着水提液pH升高，AgNPs的粒径略有减小，分散性下降，稳定性略有上升。过高的pH会导致AgNPs的分散性降低，而过低的pH不利于AgNPs的合成。考虑经济、操作等方面因素，后续实验将WET的pH调节为8来制备AgNPs。CFS在pH=8条件下，CFS-AgNPs的平均粒径为111.17 nm，PDI为0.392，电位为-30.3 mV；CFS在pH=12条件下，AgNPs的平均粒径为57.58 nm，PDI为0.266，电位为-26.9 mV(图4E，4F)。在一定范围内，随着上清液pH升高，AgNPs的粒径显著减小，分散性略有提高，而稳定性略有下降，较高的pH有助于AgNPs的合成。考虑经济、操作等方面的因素，后期以调节CFS的pH为12来进行AgNPs合成实验。

2.5. AgNPs粒子的表征

2.5.1. SEM分析

WET-AgNPs、CFS-AgNPs和化学法制备的AgNPs平均粒径分别约为120、60及150 nm，WET-AgNPs和CFS-AgNPs分散较为良好，而化学法制备的AgNPs发生明显的团聚现象(图5)，说明生物法制备的AgNPs比较稳定，而化学法制备的AgNPs不稳定。

图5.

不同方法制备的AgNPs电镜图

Figure 5 Electron microscopy results of AgNPs prepared by different methods

A: WET-AgNPs; B: CFS-AgNPs; C:AgNPs by chemical method. AgNPs: Silver nanoparticles; WET: Water extract of Tricholomagambosum; CFS: Cell-free supernatant of Lactobacillus crispatus.

2.5.2. EDS分析

用EDS对生物法制备的AgNPs进行元素分析，以初步判断AgNPs上的所含元素来推断AgNPs上的基团情况。WET-AgNPs、CFS-AgNPs上均含有大量的C、N、O等元素，但CFS-AgNPs上O元素含量更多。

2.5.3. 红外光谱分析

将不同制备方法制备的AgNPs进行FTIR分析，WET-AgNPs和CFS-AgNPs红外光谱图相似，从结果上看，3 200 cm^-1是O-H伸缩运动造成的，该宽峰表示有缔合状态的羟基存在，1 600~1 500 cm^-1处的强而尖的吸收峰可能是酰胺的伸缩振动引起的，3 000~2 850 cm^-1主要是C-H伸缩震动，1 465~1 340 cm^-1主要是C-H弯曲震动导致的，C-O的伸缩振动主要在1 300~1 000 cm^-1附近。以上结果说明生物法制备的AgNPs表面存在蛋白质或多肽以及多糖类物质等，而化学法制备的AgNPs红外光谱图没有明显的出峰现象，说明化学法制备的AgNPs上几乎没有有机基团。

2.6. 抗菌活性

2.6.1. KB纸片琼脂扩散法

WET-AgNPs、CFS-AgNPs和化学法制备的AgNPs平均抑制直径分别1.5、1.3 和0.7 cm(纸片直径为0.6 cm)，而去离子水作为对照没有抑制效果。由此可初步判断WET-AgNPs抑菌效果最佳，其次为CFS-AgNPs，化学法制备的AgNPs抑菌效果最差，生物法制备AgNPs与化学法比较，差异有统计学意义(均P<0.01)。

2.6.2. MIC的测定

由于不同制备方法的AgNPs的颜色有较为明显的差异，故采用观测每孔底部浑浊情况来判断抑菌效果。肉眼观察使孔板澄清透明的最小药物浓度即为MIC。WET-AgNPs、CFS-AgNPs和化学法制备的AgNPs的MIC分别为58、63和197 mg/L。结果表明不同制备方法得到的AgNPs对白色念珠菌均有抑制作用，与化学法相比，生物法合成的AgNPs的抗菌活性更强，且差异有统计学意义(均P<0.01)。

2.7. 抗癌活性

用不同浓度的AgNPs测定人卵巢癌细胞SKOV3的体外杀伤活性，并与正常卵巢上皮细胞IOSE进行比较，结果显示：随着AgNPs浓度的增加，癌细胞生存率不断下降，且在480 μg/mL时，3种AgNPs与未处理者相比差异均有统计学意义(均P<0.05)，表明AgNPs具有抗癌作用(图6)。WET-AgNPs和化学法制备的AgNPs的细胞选择性规律不明显，而CFS-AgNPs在浓度为480 mg/L时呈现为较强的细胞选择性。

图6.

不同方法制备AgNPs的细胞毒性对比图.

Figure 6 Comparison of cytotoxicity of AgNPs prepared by different methods

A:WET-AgNPs; B: CFS-AgNPs; C: AgNPs by chemical method. AgNPs: Silver nanoparticles; WET: Water extract of Tricholomagambosum; CFS: Cell-free supernatant of Lactobacillus crispatus. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs IOSE cells.

3. 讨 论

AgNPs在很早之前就已经得到广泛关注，独特的形状、小而可控的尺寸和高表面积使AgNPs能与细菌细胞膜相互作用，并在细胞膜上释放金属离子，进入细胞后，可通过与DNA链的磷和氮基团结合，破坏DNA链而导致细胞死亡^[11]。与化学合成的AgNPs相比，生物合成的AgNPs生物相容性好，且其形状和尺寸能够得到较好的控制，抗癌效果更佳，在癌症治疗方面潜力巨大。

本研究选定的口蘑和卷曲乳酸杆菌通过细胞外机制证明了其合成AgNPs的能力。首先，在反应过程中颜色从淡黄色变为棕色，这一现象在实际反应过程中是可视的。曾有研究^[12]报道过银离子还原为AgNPs并伴随着颜色变化。这也证明了在实验过程中观察到的颜色变化可以作为形成AgNPs的标志。其次，通过紫外-可见光谱分析确定了AgNPs在水溶液中的形成和稳定性，结果表明所合成的AgNPs在400 nm左右处有一吸收峰^[13-14]。

笔者利用SEM进一步证实了实验合成了AgNPs，并且生物法合成的AgNPs近似球形，大小均一，分散性良好。WET-AgNPs粒径在120 nm左右，CFS-AgNPs粒径在60 nm左右。化学法合成的AgNPs的粒径在150 nm左右。红外光谱结果表明：蛋白质的酰胺键与银的结合能力最大，正是这种特性促进了CFS中的生物分子形成稳定的AgNPs。本研究的结果与文献[15-16]中报道的结果一致。

本研究首次利用卷曲乳杆菌生物法合成AgNPs，并与利用口蘑等菌类生物法合成的AgNPs和化学法合成的AgNPs进行对比。实验证明：通过控制反应温度、pH、AgNO₃浓度、光照条件等参数可以控制AgNPs的大小、形状以及合成的速率。利用微生物细胞外合成纳米粒子的机制尚不完全清楚，但已经证实微生物分泌的还原性物质和酶等有助于将金属离子生物还原为金属纳米粒子^[17]，还需要进一步研究揭示卷曲乳杆菌合成AgNPs的机制。

本研究对制备的3种AgNPs进行抑菌活性分析，WET-AgNPs、CFS-AgNPs和化学法制备的AgNPs平均抑制直径分别1.5、1.3和0.7 cm。当白色念珠菌浓度为5×10³ CFU/mL时，WET-AgNPs、CFS-AgNPs和化学法制备的AgNPs的MIC分别为58、63和197 mg/L，表明生物法制备的AgNPs抑菌效果更好。

大多数研究^{[13, 18]}认为纳米粒子的大小对其细胞毒活性有显著影响。当纳米粒子尺寸减小时，表面积增加，从而增加暴露在外部环境中的银原子的数量，这些原子可用于生化反应和与细胞的相互作用。本研究采用CCK-8法检测了3种制备方法合成的AgNPs对人IOSE、SKOV3细胞的细胞毒性作用，结果表明随着AgNPs浓度的增加，24 h后癌细胞活力下降，表明AgNPs具备抗癌作用。与化学法制备的AgNPs相比，CFS-AgNPs在高浓度下对正常细胞的毒性较小，细胞选择性较大，这可能与CFS-AgNPs表面黏附的多肽和蛋白质有关。

CFS-AgNPs在体外研究中显示了良好的抗菌抗癌效果，有可能成为新的治疗载体。本文可能是第一份由卷曲乳杆菌合成的AgNPs具有抗癌活性的报道，这一研究为进一步探索用微生物合成纳米粒子和寻找有效的抗癌成分提供了新的途径。然而，在将其应用于医学领域之前，还需要更深入地研究微生物合成的AgNPs对不同癌细胞株作用的选择性。

王艳 论文构想和论文设计。所有作者阅读并同意最终的文本。

基金资助

湖南省自然科学基金(2018JJ2491)。

This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province, China (2018JJ2491).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

邹俊娜 数据分析，论文撰写与修改；罗文环 图像分析，论文撰写；王珊 文章审阅、修订；

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2022101398.pdf