Abstract
目的
母亲围孕期服用叶酸是迄今为止减少子代先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)最有效的一级预防措施，既往研究提示其相关机制涉及基因和环境因素，但仍未阐明。本研究旨在探讨母亲围孕期服用叶酸、叶酸受体1基因(FOLR1)和叶酸受体2基因(FOLR2)多态性及两者的交互作用与子代CHD的关系，以期为围孕期叶酸服用剂量的个体化指导提供流行病学证据。
方法
采用医院为基础的病例对照研究，招募2017年12月至2020年3月在湖南省儿童医院确诊的569例单纯性CHD患儿的母亲为病例组，以同期、该院确诊的无先天性疾病的652例正常儿的母亲为对照组。通过以问卷为基础的面对面访谈，收集母亲人口学信息和围孕期相关暴露信息，同时采集母亲静脉血 5 mL用于FOLR1和FOLR2基因多态性检测。采用多因素logistic回归分析探讨母亲围孕期服用叶酸、FOLR1和FOLR2基因多态性及两者交互作用与子代CHD的关联性。
结果
多因素logistic回归分析显示：调整混杂因素后，围孕期服用叶酸能够显著降低子代CHD的风险[调整的相对危险比(adjusted odds ratio，aOR)=0.58，95% CI：0.35~0.95]。母亲FOLR1基因位点rs2071010(G/A vs G/G：aOR=0.67，95% CI：0.47~0.96)与子代CHD风险显著相关[P<0.05，错误发现率P值(false discovery rate P value，FDR_P)<0.1]；FOLR2基因位点rs514933(T/C vs T/T：aOR=0.60，95% CI：0.43~0.84；C/C vs T/T：aOR=0.55，95% CI：0.33~0.90)在显性模型[(T/C+C/C) vs T/T：aOR=0.59，95% CI：0.43~0.81]和加性模型(C/C vs T/C vs T/T：aOR=0.70，95% CI：0.56~0.88)下均与子代CHD风险显著相关(均P<0.05，FDR_P<0.1)。rs2071010 G→A(aOR=0.59，95% CI：0.41~0.86)和rs514933 T→C(aOR=0.52，95% CI：0.37~0.74)与母亲围孕期服用叶酸在子代CHD发生中存在交互作用(P<0.05，FDR_P<0.1)。
结论
母亲携带FOLR1基因rs2071010 G→A与FOLR2基因rs514933 T→C的突变型能够降低子代CHD的发生风险，且围孕期服用叶酸可以强化SNP rs2071010和SNP rs514933对子代发生CHD的保护作用。
Keywords: 先天性心脏病, FOLR1基因, FOLR2基因, 交互作用, 病例对照研究
Abstract
Objective
Maternal periconceptional folic acid supplement is by far the most effective primary prevention strategy to reduce the incidence of congenital heart disease (CHD) in offspring. It was revealed that the underlying mechanisms are complex, including a combination of genetic and environmental factors. The purpose of this study is to investigate the association between periconceptional folic acid supplement, the genetic polymorphisms of maternal folic acid receptor 1 gene (FOLR1) and folic acid receptor 2 gene (FOLR2) and the impact of their interaction on the risk of CHD in offspring, and to provide epidemiological evidence for individualized folic acid dosing in hygienic counseling.
Methods
A case-control study on 569 mothers of CHD infants and 652 mothers of health controls was performed. The interesting points were periconceptional folate supplements, single nucleotide polymorphisms (SNPs) of maternal FOLR1 gene and FOLR2 gene.
Results
Mothers who took folate in the periconceptional period were observed a decreased risk of CHD [adjusted odds ratio (aOR)=0.58, 95% CI 0.35 to 0.95]. Our study also found that polymorphisms of maternal FOLR1 gene at rs2071010 (G/A vs G/G: aOR=0.67, 95% CI 0.47 to 0.96) and FOLR2 gene at rs514933 (T/C vs T/T: aOR=0.60, 95% CI 0.43 to 0.84; C/C vs T/T: aOR=0.55, 95% CI 0.33 to 0.90; the dominant model: T/C+ C/C vs T/T: aOR=0.59, 95% CI 0.43 to 0.81; and the addictive model: C/C vs T/C vs T/T: aOR=0.70, 95% CI 0.56 to 0.88) were significantly associated with lower risk of CHD [all P<0.05, false discovery rate P value (FDR_P)<0.1]. Besides, significant interaction between periconceptional folate supplements and rs2071010 G→A (aOR=0.59, 95% CI 0.41-0.86) and rs514933 T→C (aOR=0.52, 95% CI 0.37 to 0.74) on CHD risk were observed (all P<0.05, FDR_P<0.1).
Conclusion
Periconceptional folate supplements, polymorphisms of FOLR1 gene and FOLR2 gene and their interactions are significantly associated with risk of CHD. However, more studies in different ethnic populations with a larger sample and prospective designs are required to confirm our findings.
Keywords: congenital heart disease, FOLR1 gene, FOLR2 gene, interaction effects, case-control study
先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)是新生儿最常见的先天性疾病，我国CHD的发病率为9‰[1]，约占新生儿主要出生缺陷的三分之一[2]，是导致婴儿死亡率升高的第2大原因(仅次于传染病)[3]。CHD的病因机制复杂，目前研究[4]认为散发性CHD的发生与遗传和环境因素密切相关，且遗传和环境因素交互作用约占CHD所有病因的80%。在环境因素中，与CHD的发生关系最为密切的因素是围孕期叶酸(维生素B9)的服用[5]。叶酸是重要的一碳供体，用于核酸的嘌呤和胸苷的合成，并通过S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)间接地用于DNA、蛋白质和脂类的甲基化[6]。此外，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是叶酸重要的代谢产物，叶酸缺乏会使体内Hcy的水平升高。孕妇体内叶酸过低与出生缺陷的发生密切相关，围孕期补充叶酸可显著降低子代CHD的发生风险[5, 7-9]，尤其是室间隔缺损、圆锥动脉干畸形[10]，但是叶酸代谢通路影响胚胎心脏发育的机制尚不清楚。有学者[11]推测叶酸影响心脏发育机制可能是由于叶酸和Hcy代谢失衡影响心脏神经嵴细胞的发育及其向心脏流出道迁移的过程，进而使流出道隔心肌化过程异常。
叶酸向细胞内转运是其生物利用的基础，是维持细胞内叶酸浓度的重要方式。转运过程异常会造成叶酸利用障碍。叶酸受体1(folate receptor 1，FOLR1)和叶酸受体2(folate receptor 2，FOLR2)在介导细胞摄入叶酸的过程中发挥了重要作用。FOLR1和FOLR2是富含半胱氨酸的细胞表面糖蛋白，以极高的亲和力结合叶酸并通过胞吞作用介导细胞对叶酸的摄取[12]，在细胞内部，核内体的酸性环境促进叶酸通过质子偶联的叶酸转运体从受体中释放到细胞质中[13]。其中FOLR1在人体组织中表达最为广泛，且在胎盘组织、神经嵴中表达显著增加[12]，而FOLR2仅在胎盘组织和骨髓细胞中表达[14]。既往研究[15-16]表明母体和胚胎的FOLR基因表达均会影响胚胎的正常发育。动物实验观察到叶酸结合蛋白1(Folp1)基因(小鼠中FOLR1基因的同源基因)敲除的小鼠胚胎出现致死性畸变，表现为严重的心脏畸形且全部死于宫内[17-18]，但是通过增加怀孕母鼠的叶酸供给可以避免FOLR1基因敲除的小鼠胚胎的死亡，且叶酸供给量与小鼠胚胎的心血管畸形发生呈剂量反应关系[19]。这提示对母体进行额外的叶酸补充可以减少叶酸受体基因的异常表达。孕妇叶酸受体基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)也会影响胎盘叶酸的摄入，其通过直接改变宫内胚胎发育环境的叶酸浓度影响胚胎心脏的正常发育[20]。已有研究[21]表明FOLR1基因SNP rs35179028、FOLR2基因SNP rs35982790和SNP rs13908的多态性与神经管畸形(neural tube defects，NTD)相关，但母体FOLR1基因和FOLR2基因的SNPs与子代CHD的关系的研究尚未见报道。此外，母亲服用叶酸能够直接影响母体组织液中叶酸水平，而叶酸受体基因的表达也会影响宫内胚胎发育环境的叶酸浓度，因此我们提出两者可能存在交互作用，共同影响宫内胚胎的心脏发育的假设。基于以上背景，本研究采用病例对照研究，探讨母亲服用叶酸、FOLR1基因与FOLR2基因多态性及两者交互作用与子代CHD的关系，以期为叶酸代谢失衡影响胚胎心脏发育的机制研究提供新的线索。
1. 对象与方法
1.1. 对象
本研究以医院为现场开展病例对照研究。以2017年12月至2020年3月在湖南省儿童医院心胸外科经彩色多普勒超声和/或手术确诊患单纯性CHD的0~1岁患儿的母亲为病例组(n=569)；以同期在湖南省儿童医院儿保科就诊的0~1岁患儿的母亲为对照组 (n=652)，对照组患儿经临床诊断排除了先天性疾病。本研究所有研究对象均为汉族，所有患儿之间没有血缘关系，均为单胎的自然妊娠。参与本研究的研究对象均签署了知情同意书。本研究已获中南大学湘雅公共卫生学院伦理委员会审批(审批号：XYGW-2018-07)，并进行了临床试验注册(注册号：ChiCTR1800016635)。
1.2. 问卷调查
本研究使用统一的调查问卷，采用面对面访谈的方式行流行病学问卷调查。所有的调查员经过统一的培训。问卷内容包括：研究对象基本情况及围孕期叶酸服用情况。围孕期叶酸服用是指母亲在孕前3个月或孕早期服用过叶酸。研究对象的基本情况包括社会人口学特征(孕龄、居住地、孕妇文化程度、家庭年收入)，不良孕产史(不良妊娠结局史、孕母妊娠并发症史)，家族史(家族3代近亲婚配史、家族成员出生缺陷史)，孕妇孕前生活习惯(主动吸烟、二手烟暴露、饮酒、饮茶)，围孕期环境有害物质接触(化妆品使用频率、居住地附近环境有害污染物排放、染发、烫发)，配偶基本特征(年龄、吸烟史、饮酒史、文化程度)。
1.3. DNA提取和基因多态性检测
1.3.1. DNA提取
采用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝管收集所有研究对象3~5 mL外周静脉血。血样使用低速离心机在3 500 r/min下离心15 min，2等份分装分离后的血浆及血细胞，标记后保存于-80 ℃低温冰箱备用。使用QIAamp DNA Mini试剂盒(美国Qiagen)提取血细胞的DNA；使用NanoDrop2000仪器检测光密度值，1.25%琼脂糖凝胶电泳检测DNA，DNA质检合格后，转移至96孔板，储存于-20 ℃备用。
1.3.2. 基因多态性检测
FOLR1基因和FOLR2基因是本研究的候选基因，根据已发表的研究[18]选择相应的候选位点。应用MassARRAY飞行时间质谱对候选位点的SNPs进行检测，具体检测工作由博淼生物科技(北京)有限公司完成。本研究使用美国Applied Biosystems公司提供的SNPBrowser程序(3.0版)，通过该程序可以从HapMap数据库中选择SNPs标记。对于每个靶基因，基于r 2≥0.8选择标记SNPs。此外，我们还排除了最小等位基因频率少于10%的SNPs，最终选择FOLR1基因(rs2071010、rs11235462)和FOLR2基因(rs651646、rs2298444、rs514933)作为本研究的选择位点。
1.4. 统计学处理
采用EpiData 3.1软件建立数据库，SAS 9.1软件进行统计分析。计数资料采用例数或构成比或率表示。二分类变量采用χ2检验或Fisher精确概率检验，有序多分类变量采用Wilcoxon秩和检验。对照组人群进行Hardy-Weinberg平衡检验，P≥0.05则说明各基因位点达到遗传平衡。本研究位点的遗传模型包括显性模型(杂合子和突变型纯合子 vs 野生型纯合子)、隐性模型(突变型纯合子 vs 野生型纯合子和杂合子)和加性模型(野生型纯合子 vs 杂合子 vs 突变型纯合子)。采用单因素和多因素logistic回归分析，分别计算未调整的相对危险比(crude odds ratio，cOR)和调整的相对危险比(adjusted odds ratio，aOR)及95%可信区间(95% confidence interval，95% CI)，并控制潜在的混杂因素，以检验母亲服用叶酸、FOLR1和FOLR2基因多态性、FOLR1、FOLR2基因多态性和母亲服用叶酸相乘交互作用与CHD的关联强度。在基线资料的比较和探究母亲围孕期服用叶酸与子代CHD的关联时，P<0.05为差异具有统计学意义。此外，为控制假阳性率减少I类错误，在探究母亲FOLR1、FOLR2基因多态性，以及基因多态性与服用叶酸的交互作用与子代CHD的关联时，采用错误发现率P值(false discovery rate P value，FDR_P)作为校正后的P值，并且当FDR_P<0.1时认为差异有统计学意义。
2. 结 果
2.1. 基线资料的比较
病例组和对照组孕妇人口学特征(居住地、孕妇文化程度、家庭年收入)、不良孕产史(不良妊娠结局史、孕妇妊娠并发症史)、家族史(家族3代近亲结婚史、家族成员出生缺陷史)、孕前生活习惯(主动吸烟、二手烟暴露、饮酒、饮茶)、孕前3个月及孕早期环境有害物质接触(化妆品使用频率、居住地附近环境有害污染物排放、染发、烫发)、配偶基本特征(吸烟史、饮酒史、文化程度)比较，差异均有统计学意义(均P<0.05，表1)。
表1.
对照组和病例组的基线资料比较
Table 1 Comparison of baseline data in the case group and the control group
| 变量 | 对照组(n=652) | 病例组(n=569) | 统计量 | P |
|---|---|---|---|---|
| 人口学特征/例 | ||||
| 孕龄(<35岁/≥35岁) | 560/92 | 494/75 | χ2=0.222 | 0.637 |
| 居住地(农村/城镇) | 349/303 | 428/141 | χ2=61.784 | <0.001 |
| 母亲文化程度(小学及以下/初中/高中/大学及以上) | 9/127/210/306 | 85/231/162/91 | Z=-14.298 | <0.001 |
| 家庭年收入(≤5万元/6万~10万元/11万~15万元/≥16万元) | 187/275/59/131 | 463/77/11/18 | Z=-18.157 | <0.001 |
| 不良孕产史/例 | ||||
| 不良妊娠结局史(无/有) | 366/286 | 252/317 | χ2=17.060 | <0.001 |
| 母亲妊娠并发症史(无/有) | 589/63 | 403/166 | χ2=75.911 | <0.001 |
| 家族史/例 | ||||
| 家族3代近亲结婚史(无/有) | 650/2 | 545/24 | χ2=22.302 | <0.001 |
| 家族成员出生缺陷史(无/有) | 648/4 | 529/40 | χ2=36.010 | <0.001 |
| 变量 | 对照组(n=652) | 病例组(n=569) | 统计量 | P |
|---|---|---|---|---|
| 孕妇孕前生活习惯/例 | ||||
| 主动吸烟(无/有) | 640/12 | 523/46 | χ2=26.180 | <0.001 |
| 二手烟暴露(无/有) | 403/249 | 276/293 | χ2=21.785 | <0.001 |
| 饮酒(无/有) | 607/45 | 491/78 | χ2=15.538 | 0.003 |
| 饮茶(无/有) | 524/128 | 492/77 | χ2=8.091 | 0.004 |
| 孕前3个月及孕早期环境有害物质接触/例 | ||||
| 化妆品使用频率(从不/有时/经常/每天) | 409/160/37/46 | 418/66/36/49 | Z=-3.106 | 0.002 |
| 居住地附近环境有害污染物排放(无/有) | 610/42 | 450/119 | χ2=55.592 | <0.001 |
| 染发、烫发(无/有) | 610/42 | 499/70 | χ2=12.526 | <0.001 |
| 配偶基本特征/例 | ||||
| 年龄(<35岁/≥35岁) | 428/224 | 367/202 | χ2=0.175 | 0.718 |
| 吸烟史(无/有) | 274/378 | 188/381 | χ2=10.427 | <0.001 |
| 饮酒史(无/有) | 335/317 | 245/324 | χ2=8.439 | 0.002 |
| 文化程度(小学及以下/初中/高中/大学及以上) | 17/134/224/277 | 69/267/143/90 | Z=-13.415 | <0.001 |
2.2. 母亲服用叶酸与子代CHD的关联分析
单因素分析结果显示本次妊娠围孕期是否服用叶酸在病例组和对照组间差异有统计学意义(χ2=29.803，P<0.001)。调整表1中差异有统计学意义的基线资料(混杂因素)后，多因素logistic回归分析结果显示本次妊娠围孕期服用叶酸能够显著降低子代CHD发生风险(aOR=0.58，95% CI：0.35~0.95；表2)。
表2.
母亲围孕期叶酸服用情况与子代先天性心脏病的关联
Table 2 Association of periconceptional folate supplements with the risk of congenital heart disease in offspring
| 组别 | n | 围产期是否使用叶酸/例 | χ2 | P | cOR(95% CI) | aOR(95% CI)* | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 未服用 | 服用 | ||||||
| 对照组 | 652 | 44 | 608 | 1 | 1 | ||
| 病例组 | 569 | 95 | 474 | 29.803 | <0.001 | 0.36(0.25~0.53) | 0.58(0.35~0.95) |
cOR: Crude odds ratio; aOR: Adjusted odds ratio; CI: Confidence interval. *Adjusted for residence location, education level, family income, family consanguineous marriage history, family congenital malformation history, abnormal pregnancy history, history of pregnancy complication, active and passive smoking, drinking, drinking tea, exposure history of environmental hazardous substance, cosmetics use, and dyeing or perming hair experiences as well as spouse's education level, drinking, and smoking history.
2.3. FOLR1 和 FOLR2 基因位点Hardy-Weinberg
平衡检验及与子代CHD的关联
对照组FOLR1和FOLR2基因的5个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(均P>0.05，表3)。单因素分析结果显示孕妇FOLR2基因位点rs514933的基因型分布频率及其加性模型在病例组和对照组间差异均具有统计学意义(均FDR_P<0.1)。多因素分析结果显示：在调整表1中差异有统计学意义的基线资料(混杂因素)后，FOLR2基因位点rs514933的多态性(T/C vs T/T：aOR=0.60，95% CI：0.43~0.84；C/C vs T/T：aOR=0.55，95% CI：0.33~0.90)与子代CHD的发生风险显著相关，且在显性模型[(T/C+C/C) vs T/T：aOR=0.59，95% CI：0.43~0.81]和加性模型(C/C vs T/C vs T/T：aOR=0.70，95% CI：0.56~0.88)中均显著相关(均FDR_P<0.1)；母亲携带FOLR1基因位点rs2071010(G/A vs G/G：aOR=0.67，95% CI：0.47~0.96)与子代CHD的发生风险显著相关(FDR_P<0.1)。FOLR1基因位点rs11235462、FOLR2基因位点rs651646和rs2298444的基因型分布频率及其遗传模型在病例组和对照组间差异均没有统计学意义(均P>0.05，FDR_P>0.1，表4)。
表3.
对照组 FOLR1 和 FOLR2 基因型 Hardy-Weinberg平衡检验
Table 3 Hardy-Weinberg test for FOLR1 and FOLR2 genotype frequencies of the control group
| 位点 | 实际频数 | 理论频数 | χ2 | P | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| AA | BB | AB | AA | BB | AB | ||||
| FOLR1基因 | |||||||||
| rs2071010 | 445 | 190 | 17 | 447 | 186 | 19 | 0.380 | 0.538 | |
| rs11235462 | 202 | 340 | 110 | 212 | 320 | 120 | 2.682 | 0.102 | |
| FOLR2基因 | |||||||||
| rs651646 | 154 | 325 | 173 | 154 | 326 | 173 | 0.003 | 0.955 | |
| rs2298444 | 235 | 311 | 106 | 234 | 313 | 105 | 0.033 | 0.855 | |
| rs514933 | 259 | 286 | 107 | 248 | 308 | 96 | 3.406 | 0.065 | |
FOLR1: Folate receptor 1; FOLR2: Folate receptor 2; HWE: Hardy-Weinberg equilibrium; AA: Homozygous wild-type; AB: Heterozygous variant type; BB: Homozygous variant type.
表4.
母亲 FOLR1 和 FOLR2 基因型频率分布与子代先天性心脏病的关联
Table 4 Association of maternal FOLR1 and FOLR2 genetic frequencies with the risk of congenital heart disease in offspring
| 位点 | cOR(95% CI) | P | FDR_P | aOR(95% CI)* | P | FDR_P |
|---|---|---|---|---|---|---|
| rs2071010 | ||||||
| G/G | 1.00(reference) | 1.00(reference) | ||||
| G/A | 0.91(0.71~1.17) | 0.444 | 0.684 | 0.67(0.47~0.96) | 0.027 | 0.090 |
| A/A | 0.65(0.29~1.44) | 0.286 | 0.684 | 1.05(0.39~2.87) | 0.922 | 0.922 |
| 显性模型† | 0.89(0.69~1.13) | 0.330 | 0.649 | 0.69(0.49~0.98) | 0.039 | 0.195 |
| 隐性模型‡ | 0.67(0.30~1.47) | 0.317 | 0.649 | 1.19(0.44~3.24) | 0.734 | 0.857 |
| 加性模型§ | 0.88(0.71~1.09) | 0.246 | 0.649 | 0.76(0.56~1.04) | 0.083 | 0.311 |
| rs11235462 | ||||||
| T/T | 1.00(reference) | 1.00(reference) | ||||
| T/A | 0.93(0.72~1.20) | 0.561 | 0.701 | 1.06(0.75~1.49) | 0.747 | 0.922 |
| A/A | 0.88(0.63~1.25) | 0.479 | 0.684 | 0.73(0.45~1.20) | 0.215 | 0.436 |
| 显性模型† | 0.92(0.72~1.17) | 0.481 | 0.665 | 0.98(0.70~1.36) | 0.894 | 0.894 |
| 隐性模型‡ | 0.93(0.68~1.26) | 0.620 | 0.737 | 0.71(0.46~1.10) | 0.125 | 0.365 |
| 加性模型§ | 0.94(0.79~1.11) | 0.450 | 0.665 | 0.90(0.71~1.13) | 0.360 | 0.600 |
| rs651646 | ||||||
| T/T | 1.00(reference) | 1.00(reference) | ||||
| T/A | 1.00(0.75~1.31) | 0.972 | 0.972 | 0.95(0.64~1.39) | 0.784 | 0.922 |
| A/A | 0.86(0.62~1.18) | 0.351 | 0.684 | 0.75(0.48~1.18) | 0.218 | 0.436 |
| 显性模型† | 0.95(0.73~1.23) | 0.688 | 0.737 | 0.88(0.61~1.28) | 0.507 | 0.761 |
| 隐性模型‡ | 0.86(0.66~1.12) | 0.260 | 0.649 | 0.78(0.54~1.13) | 0.185 | 0.396 |
| 加性模型§ | 0.93(0.79~1.09) | 0.346 | 0.649 | 0.87(0.69~1.09) | 0.217 | 0.407 |
2.4. 母亲服用叶酸与 FOLR1 和 FOLR2 基因多态性对子代 CHD的交互作用
多因素分析结果显示：在调整表1中差异有统计学意义的基线资料(混杂因素)后，携带FOLR1基因rs2071010位点G/A或A/A基因型的母亲，如果在围孕期服用叶酸(A/A+G/A vs GG：aOR=0.80，95% CI：0.67~0.94)可以显著降低子代CHD的发生风险；携带FOLR2基因rs514933位点T/C或C/C基因型的母亲，如果在围孕期服用叶酸(C/C+T/C vs TT：aOR=0.75，95% CI：0.64~0.87)也可以显著降低子代CHD的发生风险(表5)。在未服用叶酸的分层中，2组母亲FOLR1基因rs2071010位点和FOLR2基因rs514933位点在显性模型下与子代CHD的发生风险差异均无统计学意义(均P>0.05)。在服用叶酸的分层中，与携带FOLR1基因rs2071010位点GG基因型的母亲相比，携带G/A或A/A基因型的母亲的子代患有CHD的风险显著降低[(A/A+G/A) vs GG：aOR=0.59，95% CI：0.41~0.86，FDR_P<0.1]；与携带FOLR2基因rs514933位点TT基因型的母亲相比，携带T/C或C/C基因型的母亲的子代患有CHD的风险显著降低 [(C/C+T/C) vs TT：aOR=0.52，95% CI：0.37~0.74，FDR_P<0.1；表6]。
表5.
母亲 FOLR1 和 FOLR2 基因多态性与服用叶酸对子代先天性心脏病发生的交互作用
Table 5 Interaction between maternal FOLR1 and FOLR2 gene ploymorphism and periconceptional folate supplements for the risk of congenital heart disease in offspring
| 位点 | cOR(95% CI) | P | FDR_P | aOR(95% CI)§ | P | FDR_P |
|---|---|---|---|---|---|---|
| rs2298444 | ||||||
| T/T | 1.00(reference) | 1.00(reference) | ||||
| T/C | 0.91(0.71~1.16) | 0.435 | 0.684 | 0.89(0.63~1.25) | 0.501 | 0.835 |
| C/C | 0.97(0.69~1.35) | 0.833 | 0.926 | 0.97(0.61~1.53) | 0.891 | 0.922 |
| 显性模型† | 0.92(0.73~1.16) | 0.488 | 0.665 | 0.91(0.66~1.25) | 0.562 | 0.766 |
| 隐性模型‡ | 1.02(0.75~1.38) | 0.902 | 0.902 | 1.03(0.68~1.57) | 0.890 | 0.894 |
| 加性模型§ | 0.97(0.82~1.14) | 0.680 | 0.737 | 0.96(0.77~1.20) | 0.743 | 0.857 |
| rs514933 | ||||||
| T/T | 1.00(reference) | 1.00(reference) | ||||
| T/C | 0.72(0.57~0.92) | 0.009 | 0.045 | 0.60(0.43~0.84) | 0.003 | 0.030 |
| C/C | 0.55(0.39~0.78) | 0.001 | 0.010 | 0.55(0.33~0.90) | 0.018 | 0.090 |
| 显性模型† | 0.68(0.54~0.85) | 0.001 | 0.008 | 0.59(0.43~0.81) | 0.001 | 0.015 |
| 隐性模型‡ | 0.65(0.46~0.90) | 0.010 | 0.050 | 0.71(0.44~1.13) | 0.146 | 0.365 |
| 加性模型§ | 0.74(0.63~0.87) | <0.001 | <0.001 | 0.70(0.56~0.88) | 0.002 | 0.015 |
FOLR1: Folate receptor 1; FOLR2: Folate receptor 2; cOR: Crude odds ratio; aOR: Adjusted odds ratio; CI: Confidence interval; FDR_P: False discovery rate P value. *Adjusted for residence location, education level, family income, family consanguineous marriage history, family congenital malformation history, abnormal pregnancy history, history of pregnancy complication, active and passive smoking, drinking, drinking tea, exposure history of environmental hazardous substance, cosmetics use, and dyeing or perming hair experiences as well as spouse's education level, drinking and smoking history; †Dominant model means heterozygote and mutant type homozygote vs wild type homozygote; ‡Recessive model means mutant type homozygote vs heterozygote and wild type homozygote; §Addictive model means mutant type homozygote vs heterozygote vs mutant type homozygote.
表6.
母亲 FOLR1 和 FOLR2 基因型在不同叶酸服用情况下对子代先天性心脏病发生的作用
Table 6 Maternal FOLR1 and FOLR2 genotypes by stratification of periconceptional folate supplements for the risk of congenital heart disease in offspring
| FOLR1、FOLR2基因型和叶酸服用 | 对照组/ [例(%)] | 病例组/ [例(%)] | 单因素回归分析 | 多因素回归分析* | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| cOR(95% CI) | P | aOR(95% CI) | P | FDR_P | |||
| 未服用叶酸的母亲 | |||||||
| rs2071010 | |||||||
| 野生型(G/G) | 35(79.5) | 56(58.9) | 1.00(reference) | 1.00(reference) | |||
| 突变型(G/A+A/A) | 9(20.5) | 39(41.1) | 2.71(1.17~6.27) | 0.020 | 1.70(0.50~5.73) | 0.504 | 0.504 |
| rs514933 | |||||||
| 野生型(T/T) | 9(20.5) | 39(41.1) | 1.00 (reference) | 1.00(reference) | |||
| 突变型(T/C+C/C) | 35(79.5) | 56(58.9) | 0.37(0.16~0.85) | 0.020 | 0.54(0.16~1.84) | 0.157 | 0.209 |
| 服用叶酸的母亲 | |||||||
| rs2071010 | |||||||
| 野生型(G/G) | 410(67.4) | 347(73.2) | 1.00(reference) | 1.00(reference) | |||
| 突变型(G/A+A/A) | 198(32.6) | 127(26.8) | 0.76(0.58~0.99) | 0.040 | 0.59(0.41~0.86) | 0.006 | 0.012 |
| rs514933 | |||||||
| 野生型(T/T) | 250(41.1) | 242(51.1) | 1.00(reference) | 1.00(reference) | |||
| 突变型(T/C+C/C) | 358(58.9) | 232(48.9) | 0.67(0.53~0.85) | 0.001 | 0.52(0.37~0.74) | <0.001 | <0.001 |
FOLR1: Folate receptor 1; FOLR2: Folate receptor 2; aOR: Adjusted odds ratio; CI: Confidence interval; FDR_P: False discovery rate P value. *Adjusted for residence location, education level, family income, family consanguineous marriage history, family congenital malformation history, abnormal pregnancy history, history of pregnancy complication, active and passive smoking, drinking, drinking tea, exposure history of environmental hazardous substance, cosmetics use, and dyeing or perming hair experiences as well as spouse's education level, drinking, and smoking history.
表5.
母亲FOLR1和FOLR2基因多态性与服用叶酸对子代先天性心脏病发生的交互作用
Table 5 Interaction between maternal FOLR1 and FOLR2 gene ploymorphism and periconceptional folate supplements for the risk of congenital heart disease in offspring
| SNP | 与服用叶酸的交互作用 | ||
|---|---|---|---|
| aOR(95% CI)* | P | FDR_P | |
| rs2071010† | 0.80(0.67~0.94) | 0.006 | 0.015 |
| rs11235462 | 0.93(0.80~1.07) | 0.304 | 0.304 |
| rs651646 | 0.89(0.76~1.04) | 0.155 | 0.250 |
| rs2298444 | 0.91(0.79~1.05) | 0.200 | 0.250 |
| rs514933 | 0.75(0.64~0.87) | <0.001 | <0.001 |
FOLR1: Folate receptor 1; FOLR2: Folate receptor 2; aOR: Adjusted odds ratio; CI: Confidence interval; FDR_P: False discovery rate P value; SNPs: Single nucleotide polymorphisms. *Adjusted for residence location, education level, family income, family consanguineous marriage history, family congenital malformation history, abnormal pregnancy history, history of pregnancy complication, active and passive smoking, drinking, drinking tea, exposure history of environmental hazardous substance, cosmetics use, and dyeing or perming hair experiences as well as spouse's education level, drinking, and smoking history; †aOR was calculated for CHD risk based on the dominant model.
3. 讨 论
叶酸是人体细胞及组织正常代谢不可或缺的营养物质，由于人体自身无法合成叶酸，维持生命活动所需的叶酸均需从外界摄入。已有大量病例对照研究[22-24]、队列研究[25]以及随机对照试验[26]证实母亲围孕期服用叶酸增补剂可以降低子代发生CHD的风险。本研究的结果与既往研究[22-24]结果一致，显示围孕期服用叶酸可显著降低子代CHD的发生(OR=0.58，95% CI：0.35~0.95)，且与2015年发表的一篇荟萃分析[27]的结果(RR=0.72，95% CI：0.63~0.82)很接近。有关叶酸补充对心脏形态发育影响的相关机制尚不清楚，大部分与叶酸缺乏相关的心脏发育缺陷表现为心脏流出道畸形[28]。已发表的研究证据显示：高水平的Hcy通过增加氧化应激、干扰DNA甲基化、使重要蛋白质Hcy化以及与天冬氨酸受体结合[11]等途径影响心脏神经嵴细胞的发育[29]；叶酸缺乏能够影响胚胎细胞的DNA合成以及有丝分裂，致使对叶酸敏感的组织发育异常。在动物实验中，Tang等[17]观察到细胞叶酸转运功能异常的小鼠心脏室间隔和动脉干出现了广泛的细胞凋亡，Holmes等[30]发现叶酸可以影响动脉干的形成以及动脉干分化成主动脉和肺动脉。这进一步提示叶酸与心脏流出道发育异常以及圆锥动脉干缺陷的形成密切相关。
FOLR1和FOLR2位于细胞膜表面，通过胞吞的方式介导叶酸转运至细胞内，对维持细胞内叶酸池浓度以及叶酸代谢起至关重要的作用。Folp1基因敲除的小鼠胚胎全部出现致死性畸变，表现为严重的心脏畸形，这提示FOLR1基因和FOLR2基因对心脏发育起重要作用，然而尚无FOLR1基因和FOLR2基因多态性与CHD的关联研究。本研究纳入的5个SNPs分别是FOLR1基因的rs2071010 G→A和rs11235462 T→A以及FOLR2基因的rs651646 T→A、rs2298444 T→C和rs514933 T→C。查询美国国家生物技术信息中心的SNPs数据库可知SNP 11235462、SNP rs651646、SNP rs2298444、SNP rs514933均位于内含子，SNP rs2071010位于5'非编码区(5'-untranslated region，5'-UTR)，其中SNP rs2071010与SNP rs514933是目前FOLR1基因和FOLR2基因多态性与出生缺陷关联研究中最热门的SNPs。本研究观察到与携带rs2071010基因型GG的母亲相比，携带基因型G/A(aOR=0.67，95% CI：0.47~0.96)的母亲其子代CHD的发生风险显著降低；与携带rs514933基因型TT的母亲相比，携带基因型T/C(aOR=0.60，95% CI：0.43~0.84)和CC(aOR=0.55，95% CI：0.33~0.90)的母亲其子代CHD的发生风险也显著降低。由于目前尚无其他关于FOLR1基因和FOLR2基因多态性与CHD关联的研究，既往研究更多地关注了FOLR1基因与FOLR2基因多态性与NTD的关联，这也为本研究中关注的位点对CHD的流行病学意义提供了参考。Shaw等[31]在一项基于473病例(包括259例NTD和214例圆锥动脉干畸形)和359对照的病例对照研究中发现SNP rs2071010及SNP rs514933与混合病例出生缺陷的发生风险无关。O'Byrne等[21]在探究FOLR1基因和FOLR2基因多态性与脊髓脊膜突出(NTD的一种亚型)的关联中，观察到SNP rs2071010、SNP rs514933与脊髓脊膜突出发生无关；同样地，Boyles等[32]在美国白种人群中未发现SNP rs2071010与NTD存在关联，O'Leary等[14]在爱尔兰人群中也未发现SNP rs651646与NTD相关。本研究未发现SNP rs651646与CHD有显著关联，此外，本研究未纳入的位点如FOLR1基因SNP rs35179028、FOLR2基因SNP rs35982790和SNP rs13908均被观察到与NTD存在关联[5]。尽管尚有一些FOLR1基因和FOLR2基因多态性与NTD的研究，但仍缺少与CHD关联研究的证据，还需要涉及不同种族人群、更多样本量的研究提供证据。在本研究观察到的与CHD有关联的SNPs中，SNP rs2071010位于5'-UTR，可能通过影响转录过程改变FOLR1的活性[14]；SNP rs514933是同义SNPs且位于内含子，不能直接造成FOLR2的功能变化，可能与FOLR2基因的其他未知功能性非同义SNPs处于连锁不平衡[14]，因此在完全清楚FOLR2基因的全部SNPs与CHD的关联前，rs514933是适合的候选位点。
本研究还观察到SNP rs2071010和SNP rs514933与围孕期服用叶酸存在交互作用，在服用叶酸的母亲中，携带rs2071010的突变型(G/A+A/A)或者携带rs514933的突变型(T/C+C/C)，能够分别减少41%和48%的子代CHD发生的风险。既往研究[33]表明：孕期母体胎盘组织为了满足胚胎发育需要的叶酸，合体滋养层细胞表面FOLR1和FOLR2的表达量远高于人体其他组织，且叶酸受体在细胞表面的表达量呈叶酸浓度依赖性，即随着母体组织液中叶酸浓度升高，FOLR1和FOLR2在胎盘组织中的表达也相应增加。这能够部分解释FOLR1基因和FOLR2基因多态性与围孕期服用叶酸的交互作用降低CHD发生风险的机制，但更深入的代谢机制有待探究。
本研究的局限性：1)是以医院为基础的病例对照研究，通过访谈回顾性收集母亲围孕期相关暴露因素，存在回忆偏倚。为了尽量减少回忆偏倚，招募的人群皆选择0~1岁婴幼儿的母亲作为研究对象。2)由于样本量的限制，未评估围孕期服用叶酸及FOLR1和FOLR2基因多态性与CHD亚型的关系，需要扩大样本量进一步研究。
本研究首次探究母亲FOLR1和FOLR2基因多态性与子代CHD发生风险的关联，观察到母亲携带FOLR1基因rs2071010 G→A和FOLR2基因rs514933 T→C的突变型能够降低子代CHD的发生风险，并且围孕期补充叶酸和这两个位点在CHD的发生中存在交互作用。分层分析结果显示：围孕期母亲服用叶酸可以强化SNP rs2071010和SNP rs514933对子代CHD发生的保护作用。这些结果为叶酸代谢失衡影响胚胎心脏发育的病因研究提供了新线索，相关机制有待进一步深入研究。
| 英文缩写 | 中文名称 | 英文缩写 | 中文名称 | 英文缩写 | 中文名称 |
|---|---|---|---|---|---|
| 5-FU | 5-氟尿嘧啶 | FDA | 美国食品药品管理局 | PaCO2 | 动脉血二氧化碳分压 |
| 5-HT | 5-羟色胺 | GFP | 绿色荧光蛋白 | PaO2 | 动脉血氧分压 |
| ABC法 | 抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法 | GSH | 谷胱甘肽 | PBS | 磷酸盐缓冲液 |
| ACh | 乙酰胆碱 | HAV | 甲型肝炎病毒 | PCR | 聚合酶链反应 |
| AIDS | 获得性免疫缺陷综合征 | Hb | 血红蛋白 | PET/CT | 正电子发射计算机体层显像仪 |
| ALT | 谷丙转氨酶 | HBV | 乙型肝炎病毒 | PI | 碘化丙啶 |
| AngII | 血管紧张素II | HCG | 人绒毛膜促性腺激素 | PI3K | 磷脂酰肌醇3激酶 |
| Annexin V-FITC | 膜联蛋V标记的异硫氰酸荧光素 | HDL-C | 高密度脂蛋白胆固醇 | PLT | 血小板 |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | HE | 苏木精-伊红染色 | PT | 凝血酶原时间 |
| AST | 谷草转氨酶 | HGF | 肝细胞生长因子 | PVDF | 聚偏氟乙烯 |
| ATP | 三磷酸腺苷 | HIV | 人类免疫缺陷病毒 | RBC | 红细胞 |
| BCA | 二辛可宁酸 | HPF | 高倍视野 | real-time PCR | 实时聚合酶链反应 |
| BMI | 体重指数 | HR | 心率 | real-time RT-PCR | 实时反转录聚合酶链反应 |
| BP | 血压 | HRP | 辣根过氧化物酶 | RIPA | 放射免疫沉淀法 |
| BSA | 牛血清白蛋白 | HSP | 热激蛋白 | RNA | 核糖核酸 |
| BUN | 尿素氮 | IC50 | 半数抑制浓度 | ROS | 活性氧 |
| CCK-8 | 细胞计数试剂盒-8 | ICU | 重症监护病房 | RT-PCR | 反转录聚合酶链反应 |
| COX-2 | 环氧合酶-2 | IFN | 干扰素 | SABC | 链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法 |
| Cr | 肌酐 | IL | 白细胞介素 | SCr | 血肌酐 |
| CRP | C反应蛋白 | iNOS | 诱导型一氧化氮合酶 | SDS-PAGE | SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| CT | 计算机体层摄影 | IPG | 固相pH梯度 | SO2 | 血氧饱和度 |
| CV | 变异系数 | JNK | 氨基末端激酶 | SOD | 超氧化物歧化酶 |
| DAB | 二氨基联苯胺 | LDL-C | 低密度脂蛋白胆固醇 | SPF | 无特定病原体 |
| ddH2O | 双蒸水 | LPS | 内毒素/脂多糖 | SP法 | 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法 |
| DMEM | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | MAP | 平均动脉压 | STAT | 信号转导及转录激活因子 |
| DMSO | 二甲基亚砜 | MAPK | 丝裂原激活的蛋白激酶 | TBIL | 总胆红素 |
| DNA | 脱氧核糖核酸 | MDA | 丙二醛 | TBST | Tris-盐酸洗膜缓冲液 |
| ECG | 心电图 | miRNA | 微RNA | TC | 总胆固醇 |
| ECL | 增强化学发光法 | MMP | 基质金属蛋白酶 | TG | 三酰甘油 |
| ECM | 细胞外基质 | MRI | 磁共振成像 | TGF | 转化生长因子 |
| EDTA | 乙二胺四乙酸 | mTOR | 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 | Th | 辅助性T细胞 |
| EEG | 脑电图 | MTT | 四甲基偶氮唑盐微量酶反应 | TLR | Toll样受体 |
| EGF | 表皮生长因子 | NADPH | 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 | TNF | 肿瘤坏死因子 |
| ELISA | 酶联免疫吸附测定 | NF-κB | 核因子-κB | TUNEL | 原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法 |
| eNOS | 内皮型一氧化氮合酶 | NK细胞 | 自然杀伤细胞 | VEGF | 血管内皮生长因子 |
| ERK | 细胞外调节蛋白激酶 | NO | 一氧化氮 | VLDL-C | 极低密度脂蛋白胆固醇 |
| ESR | 红细胞沉降率 | NOS | 一氧化氮合酶 | WBC | 白细胞 |
| FBS | 胎牛血清 | NS | 生理氯化钠溶液 | WHO | 世界卫生组织 |
本刊对部分常用词汇允许直接使用缩写，即首次出现时可不标注中文。
基金资助
国家自然科学基金(82073653，81803313)；湖南省科技人才托举工程项目(2020TJ-N07)；国家卫生健康委员会出生缺陷研究与预防重点实验室(湖南省妇幼保健院)开放课题(KF2020006)；湖南省重点研发计划项目(2018SK2063)；中国博士后科学基金(2020M682644)。
This work was supported by the National Natural Science Foundation (82073653, 81803313), Hunan Provincial Science and Technology Talent Support Project (2020TJ-N07), Open Project from NHC Key Laboratory of Birth Defect for Research and Prevention (KF2020006), Hunan Provincial Key Research and Development Program (2018SK2063), and Postdoctoral Science Foundation (2020M682644), China.
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
作者贡献
宋欣俐，秦家碧 论文构思、撰写和修订，数据采集和统计分析。王婷婷，黄鹏 项目构建，数据采集，论文指导和修订。陈乐陶，张森茂 数据采集，数据分析和制表。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/20220152.pdf
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Associated Data
This section collects any data citations, data availability statements, or supplementary materials included in this article.
Supplementary Materials
| 英文缩写 | 中文名称 | 英文缩写 | 中文名称 | 英文缩写 | 中文名称 |
|---|---|---|---|---|---|
| 5-FU | 5-氟尿嘧啶 | FDA | 美国食品药品管理局 | PaCO2 | 动脉血二氧化碳分压 |
| 5-HT | 5-羟色胺 | GFP | 绿色荧光蛋白 | PaO2 | 动脉血氧分压 |
| ABC法 | 抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法 | GSH | 谷胱甘肽 | PBS | 磷酸盐缓冲液 |
| ACh | 乙酰胆碱 | HAV | 甲型肝炎病毒 | PCR | 聚合酶链反应 |
| AIDS | 获得性免疫缺陷综合征 | Hb | 血红蛋白 | PET/CT | 正电子发射计算机体层显像仪 |
| ALT | 谷丙转氨酶 | HBV | 乙型肝炎病毒 | PI | 碘化丙啶 |
| AngII | 血管紧张素II | HCG | 人绒毛膜促性腺激素 | PI3K | 磷脂酰肌醇3激酶 |
| Annexin V-FITC | 膜联蛋V标记的异硫氰酸荧光素 | HDL-C | 高密度脂蛋白胆固醇 | PLT | 血小板 |
| APTT | 活化部分凝血活酶时间 | HE | 苏木精-伊红染色 | PT | 凝血酶原时间 |
| AST | 谷草转氨酶 | HGF | 肝细胞生长因子 | PVDF | 聚偏氟乙烯 |
| ATP | 三磷酸腺苷 | HIV | 人类免疫缺陷病毒 | RBC | 红细胞 |
| BCA | 二辛可宁酸 | HPF | 高倍视野 | real-time PCR | 实时聚合酶链反应 |
| BMI | 体重指数 | HR | 心率 | real-time RT-PCR | 实时反转录聚合酶链反应 |
| BP | 血压 | HRP | 辣根过氧化物酶 | RIPA | 放射免疫沉淀法 |
| BSA | 牛血清白蛋白 | HSP | 热激蛋白 | RNA | 核糖核酸 |
| BUN | 尿素氮 | IC50 | 半数抑制浓度 | ROS | 活性氧 |
| CCK-8 | 细胞计数试剂盒-8 | ICU | 重症监护病房 | RT-PCR | 反转录聚合酶链反应 |
| COX-2 | 环氧合酶-2 | IFN | 干扰素 | SABC | 链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法 |
| Cr | 肌酐 | IL | 白细胞介素 | SCr | 血肌酐 |
| CRP | C反应蛋白 | iNOS | 诱导型一氧化氮合酶 | SDS-PAGE | SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| CT | 计算机体层摄影 | IPG | 固相pH梯度 | SO2 | 血氧饱和度 |
| CV | 变异系数 | JNK | 氨基末端激酶 | SOD | 超氧化物歧化酶 |
| DAB | 二氨基联苯胺 | LDL-C | 低密度脂蛋白胆固醇 | SPF | 无特定病原体 |
| ddH2O | 双蒸水 | LPS | 内毒素/脂多糖 | SP法 | 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法 |
| DMEM | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | MAP | 平均动脉压 | STAT | 信号转导及转录激活因子 |
| DMSO | 二甲基亚砜 | MAPK | 丝裂原激活的蛋白激酶 | TBIL | 总胆红素 |
| DNA | 脱氧核糖核酸 | MDA | 丙二醛 | TBST | Tris-盐酸洗膜缓冲液 |
| ECG | 心电图 | miRNA | 微RNA | TC | 总胆固醇 |
| ECL | 增强化学发光法 | MMP | 基质金属蛋白酶 | TG | 三酰甘油 |
| ECM | 细胞外基质 | MRI | 磁共振成像 | TGF | 转化生长因子 |
| EDTA | 乙二胺四乙酸 | mTOR | 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 | Th | 辅助性T细胞 |
| EEG | 脑电图 | MTT | 四甲基偶氮唑盐微量酶反应 | TLR | Toll样受体 |
| EGF | 表皮生长因子 | NADPH | 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 | TNF | 肿瘤坏死因子 |
| ELISA | 酶联免疫吸附测定 | NF-κB | 核因子-κB | TUNEL | 原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法 |
| eNOS | 内皮型一氧化氮合酶 | NK细胞 | 自然杀伤细胞 | VEGF | 血管内皮生长因子 |
| ERK | 细胞外调节蛋白激酶 | NO | 一氧化氮 | VLDL-C | 极低密度脂蛋白胆固醇 |
| ESR | 红细胞沉降率 | NOS | 一氧化氮合酶 | WBC | 白细胞 |
| FBS | 胎牛血清 | NS | 生理氯化钠溶液 | WHO | 世界卫生组织 |
本刊对部分常用词汇允许直接使用缩写，即首次出现时可不标注中文。