Abstract
目的
肾病综合征是一种常见的泌尿系统疾病。本研究拟探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)通过调控微RNA(miR)-16/NF-κB轴，对阿霉素肾病(adriamycin nephropathy，AN)大鼠多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1，MDR1)及其表达产物P-糖蛋白170(P-glycoprotein 170，P-gp170)的影响。
方法
将72只Wistar雄性大鼠分成对照组、模型组、APS低剂量组、APS高剂量组、APS+miR-16拮抗剂组和APS+miR-16拮抗剂对照组，每组12只。使用尿液分析仪检测各组大鼠的尿液中尿蛋白(urine protein，UP)含量；全自动生化分析仪检测血清中胆固醇(cholesterol，CHOL)、白蛋白(albumin，ALB)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine，SCr)水平；ELISA试剂盒检测血清白介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)水平；HE染色试剂盒观察肾组织的形态学变化；real-time RT-PCR检测肾组织中miR-16和MDR1 mRNA水平；蛋白质印迹法检测肾组织中NF-κB p65、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)p65和P-gp170蛋白表达水平；双荧光素酶验证miR-16与NF-κB的靶向关系。
结果
对照组大鼠肾组织结构正常，无炎性细胞浸润；模型组大鼠肾组织中肾小球轻度充血，毛细血管狭窄或闭塞，炎性细胞浸润明显；APS低剂量组和高剂量组大鼠肾小球无明显充血，系膜细胞增殖明显减少，炎性细胞减少；与APS高剂量组和APS+miR-16拮抗剂对照组相比，APS+miR-16拮抗剂组大鼠肾组织结构损伤较为严重。与对照组相比，模型组大鼠UP、CHOL、BUN、SCr、IL-6、IL-1β、TNF-α水平及MDR1 mRNA、p-NF-κB p65、P-gp170蛋白质水平均明显升高(均P<0.05)，ALB和miR-16水平均显著降低(均P<0.05)。与模型组相比，APS低剂量组和高剂量组大鼠UP、CHOL、BUN、SCr、IL-6、IL-1β、TNF-α水平及MDR1 mRNA、p-NF-κB p65、P-gp170蛋白质水平均明显降低(均P<0.05)，ALB和miR-16水平均显著升高(均P<0.05)。与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，APS+miR-16 拮抗剂组大鼠UP、CHOL、BUN、SCr、IL-6、IL-1β、TNF-α水平及MDR1 mRNA、p-NF-κB p65、P-gp170蛋白质水平均明显升高(均P<0.05)，ALB和miR-16水平均显著降低(均P<0.05)。MiR-16与NF-κB具有靶向调节关系。
结论
APS可调节miR-16/NF-κB信号通路，影响MDR1、P-gp170水平，从而可减轻AN大鼠肾组织的炎症反应。
Keywords: 黄芪多糖, 阿霉素肾病, 微RNA-16, 核因子κB, 多药耐药基因
Abstract
Objective
Nephrotic syndrome is a common disease of the urinary system. The aim of this study is to explore the effect of astragalus polysaccharides (APS) on multidrug resistance gene 1 (MDR1) and P-glycoprotein 170 (P-gp170) in adriamycin nephropathy rats and the underlying mechanisms.
Methods
A total of 72 male Wistar rats were divided into a control group, a model group, an APS low-dose group, an APS high-dose group, an APS+micro RNA (miR)-16 antagomir group and an APS+miR-16 antagomir control group, with 12 rats in each group. Urine protein (UP) was detected by urine analyzer, and serum cholesterol (CHOL), albumin (ALB), blood urea nitrogen (BUN), and creatinine (SCr) were detected by automatic biochemical analyzer; serum interleukin-6 (IL-6), IL-1β, tumor necrosis factor α (TNF-α) levels were detected by ELISA kit; the morphological changes of kidney tissues were observed by HE staining; the levels of miR-16 and MDR1 mRNA in kidney tissues were detected by real-time RT-PCR; the expression levels of NF-κB p65, p-NF-κB p65, and P-gp170 protein in kidney tissues were detected by Western blotting; and dual luciferase was used to verify the relationship between miR-16 and NF-κB.
Results
The renal tissue structure of rats in the control group was normal without inflammatory cell infiltration. The renal glomeruli of rats in the model group were mildly congested, capillary stenosis or occlusion, and inflammatory cell infiltration was obvious. The rats in the low-dose and high-dose APS groups had no obvious glomerular congestion, the proliferation of mesangial cells was significantly reduced, and the inflammatory cells were reduced. Compared with the high-dose APS group and the APS+miR-16 antagomir control group, there were more severe renal tissue structure damages in the APS + miR-16 antagomir group. Compared with the control group, the levels of UP, CHOL, BUN, SCr, IL-6, IL-1β, TNF-α, and MDR1 mRNA, and the protein levels of p-NF-κB p65 and P-gp170 in the model group were significantly increased (all P<0.05); the levels of ALB and miR-16 were significantly decreased (both P<0.05). Compared with the model group, the levels of UP, CHOL, BUN, SCr, IL-6, IL-1β, TNF-α, and MDR1 mRNA, and the protein levels of pNF-κB p65 and P-gp170 in the low-dose and high-dose APS groups were significant decreased (all P<0.05); and the levels of ALB and miR-16 were significantly increased (both P<0.05). Compared with APS+miR-16 antagomir control group, the UP, CHOL, BUN, SCr, IL-6, IL-1β, and TNF-α levels, MDR1 mRNA, and the protein levels of p-NF-κB p65 and P-gp170 were significantly increased (all P<0.05). The levels of ALB and miR-16 were significantly decreased in the APS+miR-16 antagomir group compared with the APS+miR-16 antagomir control group (both P<0.05).
Conclusion
APS can regulate the miR-16/NF-κB signaling pathway, thereby affecting the levels of MDR1 and P-gp170, and reducing the inflammation in the kidney tissues in the adriamycin nephropathy rats.
Keywords: astragalus polysaccharide, adriamycin nephropathy, microRNA-16, nuclear factor kappa B, multidrug resistance gene
原发性肾病综合征是一种常见的严重影响人们健康的泌尿系统疾病。微小病变疾病是儿童肾病综合征最常见的原因，成人患者占15%~20%[1-2]。MCD的临床特征为大量蛋白尿和低白蛋白血症，可导致水肿和高胆固醇血症。然而，该疾病的发病机制至今仍未完全阐明。目前的治疗仅限于激素和其他免疫抑制剂的应用，其疗效不稳定，可能有不良反应和耐药性[3]。因此，迫切需要发现不良反应更少、能降低耐药性的新疗法。P-糖蛋白(P-glycoprotein170，P-gP170)是多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1，MDR1)的表达产物，具有ATP依赖性跨膜转运活性，可以将药物转运到细胞并诱导耐药性[4]。NF-κB在免疫反应、细胞分化、细胞凋亡和肿瘤生长抑制中参与信息传递[5]。研究[6]发现微RNA(microRNAs，miR)可通过NF-κB途径调节MDR1的表达。通过分析microRNA.Org数据库中miR-16与NF-κB mRNA序列，结果发现其中有15个核苷酸是互补的，NF-κB为miR-16的靶基因，因此miR-16可能通过抑制NF-κB表达而调节MDR1的表达。
黄芪是一种传统中药，已被广泛用于治疗多种疾病，包括肾疾病。黄芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)是黄芪的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化等作用。有研究[7]发现APS对阿霉素诱导的肾小球细胞损伤具有保护作用。APS可上调种公鸡肝、脾中miR-16的表达，进而调节相关基因的表达，发挥其生物学调控效应来维持机体健康状态[8]。然而，目前关于APS对肾病耐药性作用机制的研究鲜见报道。据Wang等[9]报道阿霉素诱导的大鼠肾病类似于肾小球疾病中的微小病变疾病和局灶节段性肾小球硬化，是肾病的经典实验模型。因此，本研究通过构建阿霉素肾病(adriamycin nephropathy，AN)大鼠模型，以miR-16/NF-κB轴为切入点，探究APS对AN大鼠肾病的作用机制，为肾病的临床治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1. 材料
Wistar雄性大鼠，8周龄，体重为220~250 g，尿蛋白检测为阴性，购自山西医科大学[许可证号为SCXK(晋)2019-0004]。将大鼠安置在(25±2) ℃的空调房间中，湿度为65%，明暗周期为12 h。实验过程遵循“3R”实验动物伦理法则[“3R”分别是指replacement(替代)、reduction(减少)、refinement(优化)]。本研究符合安阳职业技术学院动物伦理委员会要求且被审核通过(审批号：20200012)。
大鼠肾足细胞购自中国科学院细胞库；阿霉素标准品(纯度≥98%)、APS标准品(纯度≥90%)均购自北京索莱宝生物科技有限公司；miR-16拮抗剂或miR-16拮抗剂阴性对照合成于广州市锐博生物科技有限公司；白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；NF-κB p65一抗、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)p65一抗均购自美国Sigma Aldrich公司；P-gp170一抗及羊抗兔HRP二抗均购自美国Abcam公司；miR-16模拟物的质粒载体及其空质粒载体购自上海吉玛制药技术有限公司。
Urtest-500B型尿液分析仪购自桂林优利特医疗电子销售有限公司；HCC400型全自动生化分析仪购自山东国康生物科技有限公司；光学显微镜购自日本Nikon公司；real-time RT-PCR仪、电泳仪、转膜仪均购自美国Bio-Rad公司。
1.2. 方法
1.2.1. 动物模型的制备
构建AN大鼠模型[10]，将需造模大鼠尾静脉缓慢注射阿霉素(7.5 mg/kg)，对照组注射生理盐水。注射1周后，将大鼠放入代谢笼中，收集24 h尿液，若大鼠蛋白尿水平≥50 mg/kg，则表明AN模型构建成功。
1.2.2. 动物分组及样本采集
将造模成功的60只大鼠随机分成模型组、APS低剂量组、APS高剂量组、APS+miR-16拮抗剂组和APS+miR-16拮抗剂对照组，每组12只。APS低剂量组和APS高剂量组大鼠分别以200和400 mg/kg APS[11]灌胃，每天1次；APS+miR-16拮抗剂组和APS+miR-16拮抗剂对照组大鼠在给予400 mg/kg APS灌胃的基础上，再于尾静脉注射5 mL/kg miR-16拮抗剂或miR-16拮抗剂阴性对照，每周2次。对照组和模型组灌胃及尾静脉注射等量生理盐水，连续4周。
在药物治疗结束时收集24 h尿液，使用尿液分析仪对各组大鼠尿液中的尿蛋白(urine protein，UP)含量进行检测。将大鼠麻醉，腹主动脉取血，离心取上清，置于-20 ℃冰箱中保存备用。处死大鼠，解剖取出肾，左肾置于甲醛中固定，右肾用液氮速冻后，置于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.2.3. 血生物化学指标的检测
使用全自动生化分析仪对各组大鼠血清中胆固醇(cholesterol，CHOL)、白蛋白(albumin，ALB)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(serum creatinine，SCr)水平进行检测。
1.2.4. 血清炎性因子含量的检测
使用ELISA试剂盒对血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平进行检测。
1.2.5. 肾组织学分析
取出用甲醛固定的左肾，脱水透明，以石蜡包埋，切成4 μm厚度的切片，使用HE染色试剂盒进行染色，于光学显微镜下观察肾组织的形态学变化。
1.2.6. Real-time RT-PCR检测肾组织中miR-16、MDR1 mRNA的水平
取出在-80 ℃冰箱保存的右肾组织，用液氮研磨，加入裂解液，制成匀浆，使用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒合成cDNA。使用real-time RT-PCR技术分析miR-16、MDR1 mRNA的水平变化。根据基因数据库中基因序列的公开数据设计引物，序列见表1。
表1.
引物序列
Table 1 Primer sequences
| 基因 | 正向(5'-3') | 反向(5'-3') |
|---|---|---|
| miR-16 | TAGCAGCACGTAAATATTGGCG | TGCGTGTCGTGGAGTC |
| MDR1 | CTCTCGCTGCTATCATCCACGGAACC | ACTGCTGTCGTGACGGTCTGTGTA |
| β-actin | GAAGATCAAGATCATTGCTCCT | TACTCCTGCTTGCTGATCCA |
| U6 | CTCGCTTCGGCAGCACA | AACGCTTCAC GAATTTGCGT |
1.2.7. 蛋白质印迹法检测NF-κB p65、p-NF-κB p65、P-gp170的蛋白质表达
取右肾组织匀浆液，使用蛋白质提取试剂盒提取总蛋白质，并检测蛋白质含量。采用SDS-PAGE电泳分离肾组织的蛋白质，转膜，孵一抗(NF-κB p65、p-NF-κB p65、P-gp170，稀释倍数均为1꞉1 000)，在4 ℃条件下过夜，洗膜孵二抗，置于37 ℃恒温培养箱中孵育40 min，洗膜，曝光显色，使用凝胶成像系统分析各蛋白质的相对表达量，以β-actin为内参蛋白质。
1.2.8. 荧光素酶报告分析
取培养至生长对数期的大鼠肾足细胞接种于24孔板中，将细胞分为miR-16模拟物+NF-κB野生株(wild type，WT)组、miR-16阴性对照+NF-κB WT组、miR-16模拟物+NF-κB突变株(mutant type，MUT)组和miR-16阴性对照+NF-κB MUT组，每组设3个复孔，使用转染试剂盒进行细胞共转染。48 h后，使用双荧光素酶报告分析试剂盒检测荧光素酶信号强度。
1.3. 统计学处理
本研究所得数据均采用SPSS 22.0软件进行统计，计量资料以均数±标准差( ±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步的两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结 果
2.1. APS对AN大鼠尿蛋白含量的影响
对照组大鼠的尿蛋白含量为(0.07±0.02) g/L，模型组大鼠尿蛋白含量为(3.29±0.21) g/L，两组差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，APS低剂量组、高剂量组大鼠尿蛋白含量均明显降低[分别为(2.65±0.16)和(2.34±0.18) g/L]，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，APS+miR-16拮抗剂组大鼠尿蛋白含量明显升高[(3.19±0.20) g/L]，差异有统计学意义(P<0.05)。APS高剂量组与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2. APS对AN大鼠血生物化学指标的影响
与对照组相比，模型组大鼠CHOL、BUN、SCr含量均显著升高，ALB显著降低(均P<0.05)；与模型组相比，APS低剂量组、高剂量组大鼠CHOL、BUN、SCr含量均显著降低，ALB显著升高(均P<0.05)；与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，APS+miR-16拮抗剂组大鼠CHOL、BUN、SCr含量均显著升高，ALB显著降低(均P<0.05)。APS高剂量组与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。
表2.
APS对AN大鼠血生化指标的影响(n=12， ±s)
Table 2 Effects of APS on blood biochemical indexes in AN rats (n=12, ±s)
| 组别 | CHOL/(mmol·L-1) | ALB/(g·L-1) | BUN/(mmol·L-1) | SCr/(mmol·L-1) |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 2.34±0.45 | 25.43±4.37 | 7.32±0.72 | 40.94±5.86 |
| 模型组 | 13.15±3.27* | 12.32±1.74* | 13.29±3.05* | 79.64±9.97* |
| APS低剂量组 | 8.74±1.86† | 17.69±2.25† | 10.12±2.41† | 67.34±12.82† |
| APS高剂量组 | 5.25±1.31† | 21.06±3.56† | 8.77±3.23† | 58.39±11.30† |
| APS+miR-16拮抗剂组 | 12.58±2.59‡ | 11.97±2.08‡ | 13.17±3.51‡ | 80.06±10.67‡ |
| APS+miR-16拮抗剂对照组 | 5.07±1.76 | 21.62±3.14 | 8.20±3.08 | 58.28±12.39 |
APS：黄芪多糖；AN：阿霉素肾病；CHOL：胆固醇；ALB：白蛋白；BUN：血尿素氮；SCr：肌酐。与对照组相比， *P<0.05；与模型组相比，†P<0.05；与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，‡P<0.05。
2.3. APS对AN大鼠血清中炎性因子的影响
与对照组相比，模型组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平均显著升高(均P<0.05)；与模型组相比，APS低剂量组、高剂量组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平均显著降低(均P<0.05)；与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，APS+miR-16拮抗剂组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著升高(均P<0.05)。APS高剂量组与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05，表3)。
表3.
APS对AN大鼠血清中炎性因子的影响(n=12， ±s ，pg/mL)
Table 3 Effects of APS on serum inflammatory factors in AN rats (n=12, ±s, pg/mL)
| 组别 | IL-6 | IL-1β | TNF-α |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 4.86±0.72 | 83.48±3.97 | 42.19±3.04 |
| 模型组 | 28.57±1.59* | 171.95±21.53* | 72.54±5.18* |
| APS低剂量组 | 17.83±1.13† | 140.41±15.28† | 63.82±5.54† |
| APS高剂量组 | 10.18±0.94† | 93.17±11.15† | 51.43±3.27† |
| APS+miR-16拮抗剂组 | 25.97±2.15‡ | 169.33±18.37‡ | 74.06±4.48‡ |
| APS+miR-16拮抗剂对照组 | 10.42±1.23 | 94.58±16.82 | 52.06±4.06 |
APS：黄芪多糖；AN：阿霉素肾病；IL：白细胞介素；TNF-α：肿瘤坏死因子-α。与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，†P<0.05；与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，‡P<0.05。
2.4. APS对AN大鼠肾组织形态学的影响
对照组大鼠肾组织结构正常、无炎性细胞浸润；模型组大鼠肾组织中的肾小球轻度充血，伴有肾小球系膜细胞轻度增生，毛细血管狭窄或闭塞，炎性细胞浸润明显；APS低剂量组、高剂量组大鼠肾组织中的肾小球无明显充血，系膜细胞增殖明显减少；与APS高剂量组和APS+miR-16拮抗剂对照组相比，APS+miR-16拮抗剂组大鼠肾组织结构损伤较为严重(图1)。
图1.
各组大鼠肾组织HE染色
Figure 1 HE staining of rat renal tissues in each group
A: Control group; B: Model group; C: Low-dose APS group; D: High-dose APS group; E: APS + miR-16 antagomir group; F: APS+ miR-16 antagomir control group.
2.5. APS对AN大鼠肾组织 miR-16 和 MDR1 mRNA水平的影响
与正常对照组相比，模型组miR-16 mRNA水平显著降低，MDR1 mRNA水平显著升高(均P<0.05)；与模型组相比，APS低剂量组、高剂量组miR-16 mRNA水平显著升高，MDR1 mRNA水平显著降低(均P<0.05)；与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，APS+miR-16拮抗剂组大鼠miR-16 mRNA水平显著降低，MDR1 mRNA水平显著升高(均P<0.05)。APS高剂量组与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05，表4)。
表4.
APS对AN大鼠肾组织 miR-16 和 MDR1 mRNA水平的影响(n=12， ±s)
Table 4 Effects of APS on the mRNA levels of miR-16 and MDR1 in renal tissues in AN rats (n=12, ±s)
| 组别 | MiR-16 mRNA水平 | MDR1mRNA水平 |
|---|---|---|
| 对照组 | 1.00±0.05 | 1.00±0.08 |
| 模型组 | 0.43±0.08* | 2.01±0.25* |
| APS低剂量组 | 0.76±0.15† | 1.64±0.14† |
| APS高剂量组 | 0.91±0.11† | 1.13±0.12† |
| APS+miR-16拮抗剂组 | 0.48±0.14‡ | 1.98±0.19‡ |
| APS+miR-16拮抗剂对照组 | 0.89±0.12 | 1.15±0.18 |
APS：黄芪多糖；MDR1：多药耐药基因。与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，†P<0.05；与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，‡P<0.05。
2.6. APS对肾组织NF-κB p65、p-NF-κB p65、P-gp170蛋白质表达的影响
在大鼠肾组织中，与对照组相比，模型组大鼠 p-NF-κB p65、P-gp170蛋白质水平显著升高(均P<0.05)；与模型组相比，APS低剂量组、高剂量组大鼠p-NF-κB p65、P-gp170蛋白质水平均显著降低(均P<0.05)；与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，APS+miR-16拮抗剂组大鼠p-NF-κB p65、P-gp170蛋白质水平均显著升高(均P<0.05)。APS高剂量组与APS+miR-16 拮抗剂对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05，图2、表5)。
图2.
各组大鼠肾组织蛋白质印迹法检测结果
Figure 2 Results of Western blotting detection in rat renal tissues in each group
A: Control group; B: Model group; C: Low-dose APS group; D: High-dose APS group; E: APS+miR-16 antagomir group; F: APS+miR-16 antagomir control group.
表5.
APS对肾组织NF-κB p65、MDR1、P-gp170蛋白质表达的影响(n=12， ±s)
Table 5 Effects of APS on the expressions of NF-κB p65, MDR1, and P-gp170 protein in renal tissues (n=12, ±s)
| 组别 | p-NF-κB p65/NF-κB p65 | P-gp170/β-actin |
|---|---|---|
| 对照组 | 0.31±0.08 | 0.26±0.07 |
| 模型组 | 1.21±0.23* | 1.01±0.15* |
| APS低剂量组 | 0.85±0.17† | 0.85±0.12† |
| APS高剂量组 | 0.33±0.10† | 0.31±0.09† |
| APS+miR-16拮抗剂组 | 1.14±0.13‡ | 0.97±0.10‡ |
| APS+miR-16拮抗剂对照组 | 0.31±0.10 | 0.34±0.09 |
APS：黄芪多糖；NF-κB：核因子-κB；MDR1：多药耐药基因。与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，†P<0.05；与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，‡P<0.05。
2.7. MiRNA-16与NF-κB靶向关系的预测与验证
通过分析显示：在microRNA.Org数据库中miR-16与NF-κB mRNA序列之间存在互补(图3)。与miR-16阴性对照+NF-κB WT组(1.17±0.13)相比，miR-16模拟物+NF-κB WT组荧光素酶活性(0.56±0.08)显著降低(P<0.05)，miR-16模拟物+NF-κB MUT组(1.03±0.07)与miR-16阴性对照+NF-κB MUT组(1.10±0.12)荧光素酶活性之间，差异无统计学意义(P>0.05)。
图3.
生物信息学预测 miR-16 与 NF-κB 3' UTR结合位点
Figure 3 Bioinformatics prediction of binding sites of miR-16 and NF-κB 3'UTR
WT: Wild type; MUT: Mutant; UTR: Untranslated region.
3. 讨 论
蒽环类抗生素阿霉素是一种广谱抗肿瘤药物，已被广泛用于治疗各种癌症[12]。蒽环类药物引起的慢性肾损伤早在1970年就有报道，此后阿霉素引起的肾损伤动物模型得到广泛建立。阿霉素诱导的经典肾毒性模型与人类进行性慢性肾病非常相似，因此本研究通过阿霉素诱导构建AN大鼠模型，结果发现模型组大鼠尿蛋白含量明显升高，血清中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平及CHOL、BUN、SCr含量明显升高，ALB明显降低；在显微镜下可见肾组织中肾小球轻度充血，伴有肾小球系膜细胞轻度增生，毛细血管狭窄或闭塞，炎性细胞浸润明显，表明AN大鼠模型构建成功。
APS是一种有效的传统药物，具有抗肾小球肾炎的活性，能够有效减轻炎症引起的组织损伤[13]。Cao等[14]研究发现APS可改善阿霉素诱导的心脏毒性，增强大鼠的心肌细胞功能。在本研究中，AN大鼠在APS的药效作用下，尿蛋白含量降低，血清中CHOL、BUN、SCr水平降低，ALB水平升高，肾小球无明显充血，系膜细胞增殖明显减少，表明APS可保护AN大鼠的肾组织结构，改善肾功能。APS还可下调IL-6、TNF-α炎性因子的表达，减轻骨关节炎损伤[15]。本研究中，APS低剂量组、高剂量组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著降低，结果与以往研究[15]结果一致，表明APS具有显著的抗炎作用。
MDR1是典型的多药耐药基因，最早是在多药耐药的肿瘤细胞中纯化得到，其蛋白质产物是跨膜糖蛋白P-gp170[16]。P-gp170属于三磷酸腺苷结合盒(ATP bindling cassette，ABC)转运体的关键成员，为一种能量依赖的外排泵[17]。体内和体外的研究[18]表明：P-gp170在多种药物的吸收、分布、代谢和排泄过程中起非常重要的作用，可降低细胞内药物浓度，增强耐药性。在AN大鼠肾组织中，MDR1 mRNA和P-gp170蛋白质水平升高，表明阿霉素可诱导大鼠MDR1和P-gp170的过度表达。Tian等[19]研究发现：APS可下调MDR1 mRNA和P-糖蛋白的表达，降低荷瘤小鼠的耐药性，发挥辅助抗癌的作用。在本研究中，AN大鼠在APS的药效作用下，MDR1 mRNA和P-gp170蛋白质水平显著降低，表明APS可下调MDR1 mRNA和P-gp170蛋白质水平，发挥药效作用。
NF-κB作为一种核转录因子，可调节大量基因的表达，这对于调节细胞凋亡、病毒复制、肿瘤发生、炎症和各种自身免疫性疾病的发生和发展至关重要。NF-κB的表达可诱导耐药相关基因MDR1过表达，发展出多种耐药性[20-21]。Assmann等[22]研究发现：在糖尿病肾疾病的患者中，miR-16-5p被显著下调。在本研究中，模型组大鼠肾组织miR-16水平降低，p-NF-κB p65蛋白质水平升高，与以往研究[22]结果一致。经APS处理后，大鼠肾组织miR-16水平升高，p-NF-κB p65蛋白质水平降低，表明APS可上调miR-16水平，降低NF-κB p65蛋白质的磷酸化水平，减轻炎症反应和多药耐药性。经过荧光素酶基因检测，miR-16与NF-κB具有靶向关系。在本研究中，与APS+miR-16拮抗剂对照组相比，APS+miR-16拮抗剂组的MDR1 mRNA和p-NF-κB p65、P-gp170蛋白水平显著升高，表明APS可通过调控miR-16/NF-κB轴，影响MDR1 mRNA和P-gp170蛋白质水平的表达。
综上所述，APS可上调肾组织中miR-16水平，降低NF-κB p65磷酸化水平和MDR1 mRNA、P-gp170蛋白水平，减轻AN大鼠肾组织炎症反应，从而发挥治疗的作用。然而原发性肾病综合征的发病机制十分复杂，APS对于肾病的治疗作用仍需进一步研究。
基金资助
河南省医学科技攻关计划(201602156)；河南省科技发展项目(172102310498)。
This work was supported by the Project of Henan Medical Science and Technology Key Research Plan (201602156) and the Henan Science and Technology Development Project (172102310498), China.
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
作者贡献
左晓利，曹宏敏 论文构想、实施研究，撰写和修订论文。曹宏敏 统计分析。毕凌云 论文指导及对文章进行审阅。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/20220126.pdf
参考文献
- 1. Vivarelli M, Massella L, Ruggiero B, et al. Minimal change disease[J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2017, 12(2): 332-345. 10.2215/CJN.05000516. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 2. Zhu H, Han Q, Zhang D, et al. A diagnostic model for minimal change disease based on biological parameters[J/OL]. Peer J, 2018. [2018-01-12]. 10.7717/peerj.4237. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3. Zhang Q, Zhang M, Sun C, et al. Soluble vascular cell adhesion molecule-1 is associated with disease activity in adult-onset minimal change disease[J]. Am J Med Sci, 2019, 357(4): 311-315. 10.1016/j.amjms.2019.01.017. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 4. Wegner MS, Gruber L, Mattjus P, et al. The UDP-glucose ceramide glycosyltransferase (UGCG) and the link to multidrug resistance protein 1 (MDR1)[J]. BMC Cancer, 2018, 18(1): 153. 10.1186/s12885-018-4084-4. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 5. Mussbacher M, Salzmann M, Brostjan C, et al. Cell type-specific roles of NF-κB linking inflammation and thrombosis[J]. Front Immunol, 2019, 10(1): 85. 10.3389/fimmu.2019.00085. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6. Requenez-Contreras JL, López-Castillejos ES, Hernández-Flores R, et al. MiR-138 indirectly regulates the MDR1 promoter by NF-κB/p65 silencing[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2017, 484(3): 648-655. 10.1016/j.bbrc.2017.01.168. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7. 王明娟. 黄芪多糖对小鼠肾小球足细胞Nephrin、Desmin表达的影响[J]. 中医学报, 2019, 34(12): 2621-2625. 10.16368/j.issn.1674-8999.2019.12.601. 30908095 [DOI] [Google Scholar]; WANG Mingjuan. Effect of astragalus polysaccharide on expression of nephrin and desmin in mouse glomerular podocytes[J]. China Journal of Chinese Medicine, 2019, 34(12): 2621-2625. 10.16368/j.issn.1674-8999.2019.12.601. [DOI] [Google Scholar]
- 8. 任小春, 李玉龙, 武圣儒, 等. 黄芪多糖对种公鸡不同组织miR-16表达的影响及其功能预测分析[J]. 动物营养学报, 2016, 28(6): 1887-1898. 10.3969/j.issn.1006-267x.2016.06.032. [DOI] [Google Scholar]; REN Xiaochun, LI Yulong, WU Shengru, et al. Effects and bioinformatic analysis of astragalus polysaccharide on miR-16 expression in different tissue of breeder cocks[J]. Chinese Journal Of Animal Nutrition, 2016, 28(6): 1887-1898. 10.3969/j.issn.1006-267x.2016.06.032. [DOI] [Google Scholar]
- 9. Wang C, Li Q, Zhen J, et al. Simvastatin ameliorates renal lipidosis through the suppression of renal CXCL16 expression in mice with adriamycin-induced nephropathy[J/OL]. Int J Clin Exp Pathol, 2015. [2015-12-01]. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4730052/. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 10. 陶磊, 李婷婷, 马旖旎, 等. 青蒿琥酯对阿霉素致大鼠肾损伤的保护作用[J]. 中国比较医学杂志, 2020, 30(11): 47-51. 10.3969/j.issn.1671-7856.2020.11.008. [DOI] [Google Scholar]; TAO Lei, LI Tingting, MA Yini, et al. Protective effect and mechanisms of artesunate on adriamycin-induced kidney injury in rats[J]. Chinese Journal of Comparative Medicine, 2020, 30(11): 47-51. 10.3969/j.issn.1671-7856.2020.11.008. [DOI] [Google Scholar]
- 11. 王虹, 尹显华, 胡水清. 黄芪多糖对大鼠缺血再灌注急性肾损伤的保护作用及机制研究[J]. 中国免疫学杂志, 2019, 35(16): 1966-1969. 10.3969/j.issn.1000-484X.2019.16.008. 30346488 [DOI] [Google Scholar]; WANG Hong, YIN Xianhua, HU Shuiqing. Protective effect and its mechanism of astragalus polysaccharide on acute renal injury induced by ischemia-reperfusion in rats[J]. Chinese Journal of Immunology, 2019, 35(16): 1966-1969. 10.3969/j.issn.1000-484X.2019.16.008. [DOI] [Google Scholar]
- 12. Chen C, Lu L, Yan S, et al. Autophagy and doxorubicin resistance in cancer[J]. Anticancer Drugs, 2018, 29(1): 1-9. 10.1097/CAD.0000000000000572. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13. Cao Y, Ruan Y, Shen T, et al. Astragalus polysaccharide suppresses doxorubicin-induced cardiotoxicity by regulating the PI3k/Akt and p38MAPK pathways[J]. Oxid Med Cell Longev, 2014, 14(1): 674219. 10.1155/2014/674219. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 14. Cao Y, Shen T, Huang X, et al. Astragalus polysaccharide restores autophagic flux and improves cardiomyocyte function in doxorubicin-induced cardiotoxicity[J]. Oncotarget, 2017, 8(3): 4837-4848. 10.1016/j.biopha.2017.109180. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 15. Fan L, Li M, Cao FY, et al. Astragalus polysaccharide ameliorates lipopolysaccharide-induced cell injury in ATDC5 cells via miR-92a/KLF4 mediation[J]. Biomed Pharmacother, 2019, 118(1): 109180. 10.1016/j.biopha.2019.109180. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16. Chen CJ, Chin JE, Ueda K, et al. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells[J]. Cell, 1986, 47(3): 381-389. 10.1016/0092-8674(86)90595-7. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 17. Robey RW, Pluchino KM, Hall MD, et al. Revisiting the role of ABC transporters in multidrug-resistant cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2018, 18(7): 452-464. 10.1038/s41568-018-0005-8. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 18. Zubiaur P, Saiz-Rodríguez M, Koller D, et al. How to make P-glycoprotein (ABCB1, MDR1) harbor mutations and measure its expression and activity in cell cultures?[J]. Pharma-cogenomics, 2018, 19(16): 1285-1297. 10.2217/pgs-2018-0101. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 19. Tian QE, Li HD, Yan M, et al. Astragalus polysaccharides can regulate cytokine and P-glycoprotein expression in H22 tumor-bearing mice[J]. World J Gastroenterol, 2012, 18(47): 7079-7086. 10.3748/wjg.v18.i47.7079. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 20. Yuan Z, Liang X, Zhan Y, et al. Targeting CD133 reverses drug-resistance via the AKT/NF-κB/MDR1 pathway in colorectal cancer[J]. Br J Cancer, 2020, 122(9): 1342-1353. 10.1038/s41416-020-0783-0. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 21. Kong FB, Deng QM, Deng HQ, et al. Siva1 regulates multidrug resistance of gastric cancer by targeting MDR1 and MRP1 via the NF-κB pathway[J]. Mol Med Rep, 2020, 22(2): 1558-1566. 10.3892/mmr.2020.11211. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 22. Assmann TS, Recamonde-Mendoza M, Costa AR, et al. Circulating miRNAs in diabetic kidney disease: case-control study and in silico analyses[J]. Acta Diabetol, 2019, 56(1): 55-65. 10.1007/s00592-018-1216-x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]