Abstract
目的
宫腔液RNA可用作检测子宫内膜容受性，但目前仍没有无创取样方法。聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)缩甲醛吸水海绵作为一种医用生物吸水海绵，具有良好的吸水性和亲生物性，可用于开发新型无创宫腔液取样器。本研究旨在探讨PVA缩甲醛吸水海绵对子宫内膜上皮细胞的毒性及对宫腔液RNA测序(RNA sequencing, RNA-Seq)的影响。
方法
使用PVA缩甲醛吸水海绵的细胞为实验组，包括0.005%、0.01%及0.02%(w/v)的悬液组以及0.01%、0.05%及0.1%(v/v)的浸提液组，对照组仅添加完全培养基，空白组无添加。采用体外细胞毒性实验测量每组细胞的存活率。招募2019年11月至2020年1月在中南大学湘雅医院生殖医学中心进行体外受精术的8例患者，采集患者的宫腔液，实验组将宫腔液用无菌PVA缩甲醛吸水海绵吸入后再置入RNA-later保存液中，对照组直接放入等量RNA-later保存液中，随后进行RNA-Seq及数据分析。
结果
体外细胞毒性实验结果显示：0.005%浓度悬液组各培养时间的细胞存活率差异无统计学意义(P=0.255)；0.01%和0.02%浓度悬液组在12 h内各培养时间的细胞存活率差异无统计学意义(均P>0.05)，24 h与0 h相比细胞存活率下降(分别P<0.01，P<0.05)。在同一培养时间下，3个浓度梯度的悬液组细胞存活率均比对照组低(均P<0.05)，其中0.005%浓度悬液组培养至24 h时细胞存活率下降幅度小于30%，0.01%浓度悬液组在12 h时细胞存活率下降幅度大于30%，0.02%浓度悬液组在0 h时下降幅度大于30%。0.01%浓度浸提液组在6 h内各培养时间的细胞存活率差异无统计学意义(均P>0.05)，12 h、24 h与0 h组相比细胞存活率下降(均P<0.01)；0.05%浓度浸提液组在12 h内各培养时间的细胞存活率差异无统计学意义(均P>0.05)，24 h与0 h相比存活率下降(P<0.05)；0.1%浓度浸提液组中各培养时间的细胞存活率差异无统计学意义(P=0.082)。在同一培养时间下，0.01%浓度浸提液组在0，3及24 h与对照组细胞存活率的差异均无统计学意义(均P>0.05)；除了3 h之外，0.05%组与0.1%组的细胞存活率均较对照组下降(均P<0.05)，下降幅度均小于30%。宫腔液RNA-Seq结果显示：实验组与对照组RNA的外显子率、基因检测数量、转录本检测数量差异均无统计学意义(均P>0.05)。
结论
PVA缩甲醛吸水海绵对人子宫内膜上皮细胞的毒性作用符合国家要求的医用材料细胞毒性标准，用其进行宫腔液取样行RNA-Seq，不影响测序结果，表明PVA缩甲醛吸水海绵应用于无创宫腔液取样及RNA检测安全可行。
Keywords: PVA缩甲醛吸水海绵, 宫腔液, 无创取样, RNA测序
Abstract
Objective
Uterine fluid RNA can be used as a test for endometrial receptivity, but there is still no noninvasive sampling method available. The polyvinyl alcohol (PVA) formaldehyde absorbent sponge, a medical bio-absorbent sponge with good water absorption and biophilic properties, can be used to develop a new noninvasive endometrial fluid sampler. This study aims to investigate the toxicity of PVA acetal absorbent sponges on endometrial epithelial cells and its effect on RNA sequencing (RNA-Seq).
Methods
The experimental group using PVA formaldehyde absorbent sponge was prepared into 0.005%, 0.01% and 0.02% (w/v) suspension, and 0.01%, 0.05% and 0.1% (v/v) extract groups. The control group was only the complete culture medium. Nothing was added to the blank group. In vitro cytotoxicity assay was used to evaluate the survival rate of cells. Eight patients underwent in vitro fertilization treatment in the Reproductive Center of Xiangya Hospital, Central South University from November 2019 to January 2020. The uterine fluid of each patient was aspirated. The experimental group was inhaled with sterile PVA formaldehyde absorbent sponge and then immersed RNA-later solution. The control group was directly injected into the same amount of RNA-later solution. RNA-seq and data analysis was performed later.
Results
The vitro cytotoxicity assay showed that in suspension groups, there was no significance difference in cell survival between different co-culture time in 0.005% group (P=0.255). In the 0.01% and 0.02% group, there was no difference at each incubation time within 12 h (all P>0.05), but the cell survival rate was decreased at 24 h compared with 0 h (P<0.01, P<0.05). At the same co-culture time, the cell survival of the 3 concentration gradient groups were significantly lower than that of the control group (all P<0.05). The cell viability of the 0.005% concentration group was decreased less than 30% at 24 h, the 0.01% concentration group decreased more than 30% at 12 h, and the 0.02% concentration group was decreased more than 30% at 0 h. For extract groups, there was no significant difference in the survival rate within 6 h in 0.01% concentration group (all P>0.05), and the survival rate of 12 h and 24 h was lower than that of 0 h group (both P<0.01). In 0.05% group, there was no significant difference at each incubation time within 12 h (all P>0.05), but the survival rate at 24 h was lower than that at 0 h (P<0.05). There was no significant difference in survival rate at different culture time in 0.1% concentration group (P=0.082). At the same culture time, there was no significant difference in survival rate between 0.01% group and control group at 0, 3 and 24 h (all P>0.05). Except for 3 h, the survival rate of 0.05% and 0.1% groups was lower than that of control group (all P<0.05), and the decrease was all less than 30%. Uterine fluid RNA-seq showed that there was no significance difference in exonic rate, the detected genes and transcripts of RNA between the experiment groups and the control group (all P>0.05).
Conclusion
The in vitro cytotoxic of PVA formaldehyde absorbent sponge on human endometrial epithelial cell meet the national standard of the cytotoxic of medical materials. Sampling the uterine fluid with this material does not affect the RNA-Seq results. PVA formaldehyde absorbent sponge is safe and feasible when appling to the noninvasive uterine fluid sampling and RNA sequencing.
Keywords: PVA formaldehyde absorbent sponge, uterine fluid, noninvasive sampling, RNA sequencing
宫腔液是母体子宫与胚胎进行信息交流的液体媒介，由子宫内膜分泌物、血浆渗透液和输卵管液的混合物组成，其内所含的遗传物质、生物活性因子、调节蛋白质等都在胚胎的宫内运输、发育和着床方面发挥着重要的作用[1]。在辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)的临床应用中，宫腔液作为研究胚胎植入分子机制及开发基于RNA测序(RNA sequencing，RNA-Seq)的无创子宫内膜容受性检测方法的重要载体而倍受关注[2]。然而既往在对宫腔液进行取样检测的过程中，只能采用胚胎移植管接无菌注射器进行抽吸，仍然存在内膜出血及损伤的风险，既达不到无创，取样和检测失败率也较高。因此如何利用无创的取样器材及方法对微量的宫腔液进行收集且不影响RNA-Seq的结果是目前亟待解决的问题。
聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)缩甲醛吸水海绵作为一种医用生物吸水材料[3]，具有良好的吸水性、保水性、耐化学药品性和亲生物性，可用于研制新型无创的宫腔液取样器。本研究对PVA缩甲醛吸水海绵进行体外细胞毒性试验及吸取宫腔液后的RNA-Seq分析，旨在探讨PVA缩甲醛吸水海绵在无创宫腔取样及RNA检测中的安全性和可行性。
1. 材料与方法
1.1. 试验材料
1.1.1. Ishikawa细胞
子宫内膜上皮细胞系Ishikawa购自中国国家生物医学实验细胞库。
1.1.2. 试剂及仪器
1.1.2.1. 细胞毒性试验所用试剂及仪器
高糖DMEM培养基及PBS购自以色列Biological Industries生物公司；胎牛血清购自澳大利亚Bovogen公司；0.25%胰酶购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自北京同仁堂有限责任公司。酶联免疫检测仪购自美国BioTek公司。
1.1.2.2. RNA-Seq所用试剂及仪器
微量RNA提取试剂盒购自美国Qiagen公司；RNA定量试剂盒和高灵敏度荧光定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；MALBAC®白金单细胞RNA扩增试剂盒和酶切建库试剂盒购自广西亿康药业有限公司；DNA纯化试剂盒购自美国Zymo公司；RNA LabChip购自美国Agilent公司。HiSeq 2500测序仪购自美国Illumina公司；Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析仪购自美国Agilent公司；Qubit 3.0核酸蛋白质定量仪购自美国Thermo Fisher公司；胚胎移植导管购自美国Cook Medical公司。
1.2. 样本来源
招募2019年11月至2020年1月在中南大学湘雅医院(以下简称我院)生殖医学中心进行体外受精术的8例患者。纳入标准：1)年龄为20~39岁者；2)体重指数(BMI)为18~25 kg/m2者；3)拟在我院行子宫内膜容受性检测者。排除标准：1)有子宫内膜病变(包括宫腔粘连、子宫内膜息肉、子宫内膜炎、子宫内膜结核、子宫内膜增生和薄型子宫内膜等)者；2)有输卵管积水且未行输卵管近端结扎者；3)有黏膜下子宫肌瘤或突向宫腔的肌壁间子宫肌瘤或腺肌瘤患者；4)子宫内膜异位症(III~IV期)患者；5)子宫畸形者；6)有其他内、外科合并症的患者。所征集的8例患者年龄23~39 (30.00±4.75)岁，BMI 19.4~24.5 (21.80±1.85) kg/m2。本研究已获得湘雅医院生殖医学伦理委员会批准(审批号：2017002)。所有患者均在样本采集前签署书面知情同意书。
1.3. 方法
1.3.1. 细胞毒性试验方法
将试验材料PVA缩甲醛吸水海绵经高温高压烘干后进行后续试验。
1.3.1.1. 细胞培养及分组
向DMEM培养基中加入10%胎牛血清及1 mL双抗溶液配置成完全培养基。将处于对数生长期的Ishikawa细胞按照每孔0.8×104个接种于96孔板中，置于细胞培养箱37 ℃、5% CO2过夜，培养贴壁后进行后续实验。使用PVA缩甲醛吸水海绵的细胞为实验组，设有悬液组和浸提液组，分别设置3个浓度梯度：0.005%、0.01%、0.02%(w/v)以及0.01%、0.05%、0.1%(v/v)。对照组仅添加完全培养基，空白组不添加任何物质。
1.3.1.2. 悬液组制备
将2 mg材料置于离心管中，用封口膜包封避免污染，置于低温组织研磨仪中以8 ℃、70 Hz研磨 10 min。研磨后加入1 mL完全培养基，置于细胞培养箱中过夜等待材料吸水饱和。而后用完全培养基配制成0.005%、0.01%及0.02%(w/v)材料悬液。
1.3.1.3. 浸提液组制备
将30 mg材料浸没于完全培养基中，置于细胞培养箱中过夜等待材料吸水饱和后，反复大力挤压，将材料内液体充分挤出，与完全培养基配置成0.01%、0.05%及0.1%(v/v)浸提液。
1.3.1.4. 细胞毒性实验
细胞贴壁后，吸走原培养基，将上述梯度浓度悬液以及浸提液按每孔100 μL量加入，每组设置3个平行孔，试验重复3次。共培养0、3、6、12及24 h后每孔吸走原培养基，加入100 μL完全培养基及 10 μL细胞活性检测试剂(CCK-8)，于培养箱培养 90 min，采用酶标仪检测450 nm光密度(OD)值。按照以下公式计算细胞存活率：细胞存活率=[(实验孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)]×100%。
1.3.2. RNA-Seq方法
1.3.2.1. 宫腔液样本的采集及处理
对于自然周期采样的受试者，从月经第10天开始，用B超监测排卵，当优势卵泡直径达14 mm时开始每日动态监测血黄体生成素(luteinizing hormone，LH)水平，同时用B超继续监测直到确定卵泡排出。LH峰日记为 LH+0，分别在血LH峰后第7、9天(LH+7、LH+9)采集宫腔液。对于激素替代周期采样的受试者，从月经周期的第3天开始服用雌激素，服用雌激素至少12 d后，B超提示子宫内膜厚度≥7 mm且内源性血清孕酮水平接近于零，则开始补充孕激素，加用孕酮的当天设为P+0，分别在加用孕酮后的第5、7天(P+5、P+7)进行宫腔液的采集。
样本采集步骤及处理如下：患者取膀胱截石位，常规消毒铺巾，行双合诊了解子宫位置，以扩阴器暴露宫颈，宫颈钳钳夹固定宫颈，取样前用生理盐水清洗宫颈，插入胚胎移植外管约4 cm至宫颈内口处，沿外管插入内导管至宫腔，距宫底1~2 cm处，接2.5 mL注射器，抽吸出5~10 μL的宫腔液，取出内管，再拔出外管，结束操作。实验组将在LH+7/P+5时抽吸的每个受试者的宫腔液立即用米粒大小(重量约1 mg)的无菌PVA缩甲醛吸水海绵吸入后再置入30 μL RNA-later保存液中；而对照组将在间隔48 h的LH+9/P+7时抽吸的宫腔液直接放入30 μL RNA-later保存液中。将样本离心、封管，于-20 ℃冷冻保存，取样后7 d内送亿康基因公司进行测序分析。
1.3.2.2. 宫腔液RNA的提取、文库构建和测序
按照试剂盒的说明书，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，再用RNA定量试剂盒定量，最后使用RNA LabChip和Aligent 2100生物分析仪对提取的总RNA进行完整性检测。RNA完整性指数(RNA integrity number，RIN)>7的样本被认为合格，可以用于后续检测。
按照试剂盒的说明书，使用MALBAC®白金单细胞RNA扩增试剂盒进行RNA反转录。阳性和阴性对照分别为500 ng高质量的人总RNA和超纯水。反转录完成后，取1 μL cDNA进行10倍稀释，用安捷伦2100生物分析仪进行检测。cDNA大小为1 000~10 000 bp，符合质量控制要求。
按照试剂盒的说明书，使用基因测序和文库制备试剂盒构建文库。纯化后，用Qubit-dsDNA-HS试剂盒对文库进行定量。根据Qubit定量结果，每个文库取10 ng，等比例混合。混合文库再次进行Qubit定量检测。然后，在HiSeq 2500测序平台上根据相关参数进行单端测序。测序读长设置为140 bp。原始数据量约为5 M。
1.4. 统计学处理
采用SPSS 26.0统计软件对数据进行分析。服从正态分布的计量资料用均数±标准差( ±s)表示，比较多组间的差异时釆用单因素方差分析(one way ANOVA)或重复测量方差分析，而比较两组配对样本间的差异时采用配对样本t检验；对于偏态分布的计量资料用中位数(第1四分位数，第3四分位数) [M(P 25, P 75)]表示，并采用Wilcoxon秩和检验进行比较。以α=0.05(双侧)为检测标准，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结 果
2.1. 细胞毒性试验结果
2.1.1. 悬液组细胞存活率
0.005%浓度组各培养时间的细胞存活率差异无统计学意义(P=0.255)；0.01%和0.02%浓度组在12 h内的各培养时间细胞存活率差异无统计学意义(均P>0.05)，24 h与0 h相比细胞存活率下降(分别P<0.01，P<0.05)。在同一培养时间下，3个浓度梯度组细胞存活率均比对照组低(均P<0.05)，其中0.005%浓度组培养至24 h细胞存活率下降幅度小于30%，0.01%浓度组在12 h细胞存活率下降幅度大于30%，0.02%浓度组0 h下降幅度即大于30%(表1)。
表1.
PVA缩甲醛吸水海绵悬液与Ishikawa共培养后细胞存活率( ±s)
Table 1 Cell survival rate after co-culture of PVA formaldehyde absorbent sponge suspension with Ishikawa ( ±s)
|
悬液浓度 (w/v) |
共培养时间 | F | P | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 h | 3 h | 6 h | 12 h | 24 h | |||
| 0（对照组） | 0.94±0.01 | 0.96±0.05 | 0.97±0.03 | 0.95±0.01 | 0.95±0.01 | 0.535 | 0.560 |
| 0.005% | 0.79±0.01* | 0.72±0.05* | 0.73±0.04* | 0.70±0.02* | 0.72±0.05* | 2.135 | 0.255 |
| 0.01% | 0.76±0.10* | 0.76±0.02* | 0.70±0.06* | 0.67±0.04* | 0.48±0.12*†§§ | 9.812 | 0.004 |
| 0.02% | 0.60±0.09*†‡ | 0.65±0.00*†‡ | 0.61±0.11* | 0.51±0.10*†‡ | 0.42±0.05*†§ | 6.001 | 0.016 |
| F | 13.006 | 39.913 | 15.816 | 35.967 | 41.308 | ||
| P | 0.002 | <0.001 | 0.001 | <0.001 | <0.001 | ||
同一培养时间下与对照组比较，*P<0.05；同一培养时间下与0.005%浓度组比较，†P<0.05；同一培养时间下与0.01%组比较，‡P<0.05；同一浓度中与0 h比较，§P<0.05，§§P<0.01。
2.1.2. 浸提液组细胞存活率
0.01%浓度组在6 h内各培养时间细胞存活率差异无统计学意义(均P>0.05)，12 h、24 h与0 h组相比存活率下降(均P<0.01)；0.05%浓度组培养在12 h内细胞存活率差异无统计学意义(均P>0.05)，24 h与 0 h相比细胞存活率下降(P<0.05)；0.1%浓度组中各培养时间细胞存活率差异无统计学意义(P=0.082)。同一培养时间下，0.01%浓度组在0，3及24 h与对照组细胞存活率差异无统计学意义(均P>0.05)；除了3 h之外，0.05%与0.1%浓度组的细胞存活率均较对照组下降(均P<0.05)，下降幅度均小于30%(表2)。
表2.
PVA缩甲醛吸水海绵浸提液与Ishikawa共培养后细胞存活率( ±s)
Table 2 Cell survival rate after co-culture of PVA formaldehyde absorbent sponge extract with Ishikawa ( ±s)
| 浸提液浓度 | 共培养时间 | F | P | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (v/v) | 0 h | 3 h | 6 h | 12 h | 24 h | ||
| 0（对照组） | 1.07±0.08 | 1.01±0.11 | 1.05±0.02 | 1.06±0.07 | 0.98±0.15 | 0.408 | 0.799 |
| 0.01% | 0.94±0.03 | 0.86±0.01 | 0.88±0.04* | 0.82±0.06*‡‡ | 0.80±0.04‡‡ | 4.779 | 0.029 |
| 0.05% | 0.86±0.06*† | 0.89±0.06 | 0.79±0.05* | 0.85±0.03* | 0.77±0.03*†‡ | 4.246 | 0.039 |
| 0.1% | 0.88±0.10*† | 0.89±0.02 | 0.83±0.04* | 0.80±0.10* | 0.70±0.07*† | 3.086 | 0.082 |
| F | 5.034 | 3.518 | 26.112 | 9.421 | 6.007 | ||
| P | 0.03 | 0.07 | <0.01 | 0.01 | 0.02 | ||
同一培养时间下与对照组比较，*P<0.05；同一培养时间下与0.01%浓度组比较，†P<0.05；与同一浓度0 h比较，‡P<0.05，‡‡P<0.01。
2.2. RNA-Seq结果
宫腔液RNA-Seq结果显示：实验组(使用PVA缩甲醛吸水海绵)与对照组(未使用PVA缩甲醛吸水海绵)RNA的外显子率、基因检测数量、转录本检测数量差异均无统计学意义(均P>0.05，表3)。
表3.
实验组与对照组宫腔液RNA-Seq结果比较(n=8)
Table 3 Comparison of uterine cavity fluid RNA-Seq between the experimental group and the control group (n=8)
| 组别 | 外显子率*/% | 基因检测数量† | 转录本检测数量† |
|---|---|---|---|
| 实验组 | 79.46(75.24，85.77) | 16 215.38±984.92 | 99 428.25±7 209.50 |
| 对照组 | 81.03(64.41，85.04) | 13 208.63±5 952.76 | 78 157.50±37 507.77 |
| Z/t | 0.420 | 1.454 | 1.633 |
| P | 0.674 | 0.189 | 0.146 |
*为中位数(第1四分位数，第3四分位数)；†为 ±s。
3. 讨 论
在ART中，除了优质胚胎之外，准确地预测子宫内膜容受性(endometrial receptivity, ER)是提高ART妊娠率的重要手段之一[4-5]。本研究团队的既往研究[6]已研发基于RNA-Seq的子宫内膜容受性转录组学检测方法，能正确指导胚胎移植，从而明显改善反复种植失败患者的妊娠结局。然而目前国内外关于子宫内膜容受性转录组学的检测方法均需进行侵入性的子宫内膜活检取样[7-9]，对内膜存在损伤，不能在取样检测的周期进行胚胎移植[10]。因此，开发一种能保护子宫内膜的无创性ER预测工具至关重要。
正常母体子宫内含有微量的宫腔液，其内含细胞外囊泡、RNA、DNA、调节蛋白、离子、脂质和其他生物活性因子，宫腔液内分子水平的变化可反映子宫内膜容受状态的变化[11]，通过对宫腔液进行高通量测序有助于为寻找ER的无创性生物标志物，宫腔液是开发无创ER检测工具的重要载体[1]。研究[12]显示在胚胎移植前抽吸宫腔液进行基因和蛋白质表达谱的分析，不影响胚胎种植率。然而传统使用的宫腔液抽吸方法需要接注射器进行负压抽吸，仍然存在内膜出血及损伤的风险，为了改进目前抽吸宫腔液的取样方法，达到无创取样，保护子宫内膜，需要寻找一种无毒有效的生物吸水材料，用以制造无创宫腔液取样器。
PVA是一种具有良好成膜性、耐油性、耐溶剂性、黏接性和水溶性的高分子聚合物，被广泛用于纺织、食品、医药、农业、印刷等行业。由PVA缩甲醛后得到的吸水海绵为多孔的网络结构，具有良好的吸水性、保水性、耐磨性、耐化学药品性和亲生物性，可用作功能医用材料，如代替传统医用纱布用来擦拭伤口，填充手术后残留的创口[13]、关节软骨表面修复支架等[14]。PVA缩甲醛吸水海绵可用于研制无创宫腔液取样器，本研究团队已申报授权相关专利[15]。将PVA缩甲醛吸水海绵制成的宫腔液取样器置入宫腔，可无创、有效地吸取微量的宫腔液，而不损伤子宫内膜，有望为生殖临床提供无创取样及ER检测的方法。
由于PVA缩甲醛吸水海绵进入宫腔后会接触子宫内膜上皮细胞，因此本研究首先用悬液与子宫内膜上皮细胞Ishikawa共培养模拟直接接触进行相关体外毒性试验。结果显示：PVA缩甲醛吸水海绵悬液组0.005%浓度与Ishikawa细胞共培养至24 h，细胞存活率无明显下降，0.01%及0.02%浓度培养至12 h细胞存活率无明显下降，培养至24 h时出现明显下降。但0.02%浓度组在0 h时细胞存活率下降幅度达40%，0.01%浓度组培养至12 h存活率下降幅度达33%，不符合《医疗器械生物学评价：体外细胞毒性试验GB/T 16886.5-2017》[16]对医疗器械体外细胞毒性小于30%的要求。并且，0.01%及0.02%浓度组培养至12 h可以观察到细胞生长明显受阻。笔者认为这可能是因为本材料韧性高不易被研磨破坏，进行体外细胞实验时无法避免材料对细胞所造成的机械性损伤，因此进一步测试材料浸提液对Ishikawa细胞的毒性影响。浸提液整体的细胞存活率较悬液组有所提高，0.01%浓度组培养至12 h、0.05%浓度组培养至24 h后出现细胞存活率下降，但同一时间下相较于对照组，细胞存活率下降幅度小于30%，符合国家标准。在同一培养时间下，除了3 h之外，其他不同浓度组的细胞存活率较对照组下降幅度均小于30%，符合国家要求。另外，在浸提液最高浓度0.1%浓度组培养至24 h，相较于0 h没有出现明显的细胞生长受限。因此，高浓度PVA缩甲醛吸水海绵悬液可能会通过机械作用影响Ishikawa细胞生长，而浸提液产生的毒性作用符合国家标准。
事实上，在实际临床取样中，吸水材料接触患者子宫内膜的时间仅3~5 min，且材料本身韧性大，保水性强，操作过程中不存在脱落残留及所吸宫腔液被挤压反流回宫腔的可能。因此，吸水材料与患者子宫内膜接触的时间较短，在局部宫腔液中释放的浓度低，不会对子宫内膜上皮细胞产生明显的毒性作用，可以安全地应用于无创宫腔液取样。但考虑本研究采用的悬液直接接触法无法避免材料对细胞造成的机械性损伤，在临床操作过程中，仍需规避及减少吸水海绵对子宫内膜造成机械性的损伤。本研究团队的无创宫腔液取样器专利[15]，外管直径设计为3 mm，进入宫腔的吸水海绵直径约2 mm，且表面光滑有弹性，医师在临床操作过程中，需先将外管插入宫颈内口，再将吸水海绵沿外管置入宫腔后短暂停留，待其自行吸收宫腔液后取出，无负压抽吸，也不需要反复进出宫腔，无残渣脱落风险，尽可能减少吸水海绵对子宫内膜造成机械性损伤的可能性，从而达到无创取样的目的。在专利产品进行市场转化时仍需进一步研究以明确在直接接触情况下材料的生物毒性的时间和浓度阈值。
为了研究PVA缩甲醛吸水海绵是否影响取样后的宫腔液RNA-Seq，本研究用PVA缩甲醛吸水海绵吸取8例受试者在LH+7/P+5时抽吸的宫腔液，并与间隔48 h(LH+9/P+7)所取宫腔液的RNA-Seq结果进行对比分析，结果显示实验组与对照组RNA的外显子率、基因检测数量、转录本检测数量差异均无统计学意义。可见PVA缩甲醛吸水海绵不影响RNA-Seq结果，其网孔结构能吸取并释放宫腔液中的RNA，而不影响RNA的提取和测序，可为ER转录组学分析提供良好的样本来源，在开发无创的ER预测工具及研究胚胎植入分子机制方面具有重要的应用价值。
除此之外，由PVA缩甲醛吸水海绵制成的宫腔液取样器还有望衍生应用于宫腔积液的清除。在辅助生殖治疗的过程中，常见的宫腔粘连、慢性子宫内膜炎及超生理量的激素水平往往导致异常的宫腔积液，因影响了子宫内膜容受性及正常的母胎信息交流而使妊娠率明显下降，利用PVA缩甲醛吸水海绵对宫腔积液进行无创、有效的清除后行胚胎移植，将降低因宫腔积液所致的胚胎种植失败率。
本研究存在不足之处：从理论上来说，如果能对同一患者不同周期的相同时间点采用不同的方法取样，对样本测序结果进行分析比较，能更好地说明新型吸水材料对测序结果的影响。然而，在实际临床操作中将面临患者接受度低，受试者招募周期长以及伦理审查中患者受益等问题。因此，本研究采用的是同一患者同一周期不同时间点取样进行比较。后续本课题组会在受试者不同周期的同一时期分别使用两种方法取样进行RNA-Seq，比较测序结果，为本吸水材料进行转化应用提供更有力的实验支持。
综上所述，PVA缩甲醛吸水海绵对人子宫内膜上皮细胞的毒性作用符合国家要求的医用材料细胞毒性标准，用其进行宫腔液取样行RNA-Seq，不影响测序结果，表明PVA缩甲醛吸水海绵应用于无创宫腔液取样及RNA检测安全可行。
基金资助
国家自然科学基金(8187061497)。
This work was supported by the Natural Science Foundation of China (8187061497).
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
作者贡献
黄曦 细胞实验，论文撰写和修改；李艳萍 数据采集和临床采样；李丽娅 吸水海绵材料制备；何爱桦 研究设计，论文撰写。所有作者阅读并同意最终的文本。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2022111504.pdf
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