Abstract
目的
碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE)的流行已成为临床抗感染治疗的巨大挑战。本研究探讨本地区CRE耐药情况及分子流行病学特征，并评估碳青霉烯酶抑制剂增强试验在临床实验室的应用价值，旨在为临床合理使用抗菌药物提供依据。
方法
收集中南大学湘雅医院临床标本中分离的非重复性CRE，最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)联合纸片扩散法(Kirby-Bauer，KB)检测菌株的药物敏感性，PCR方法检测13种碳青霉烯酶基因。使用碳青霉烯酶抑制剂增强试验对126株经PCR确定为产碳青霉烯酶的菌株进行表型检测，了解该方法与金标准PCR结果的符合程度。
结果
704株CRE呈现出高度耐药的情况，经检测，501株为产碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌(carbapenemase producing Enterobacterales，CPE)；CPE菌株以肺炎克雷伯菌为主，其次为阴沟肠杆菌和大肠埃希菌；碳青霉烯酶有9种，包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)、新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)、维罗纳整合子金属酶β-内酰胺酶(Verona integronencoded metallo-β-lactamases，VIM)、亚胺培南酶(imipenemase，IMP)、苯唑西林酶48型(oxacillinase-48，OXA-48)以及罕见的亚胺培南水解β-内酰胺酶(imipenem-hydrolyzing β-lactamase，IMI)、阿德莱德亚胺培南酶(adelaide imipenemase，AIM)、圭亚那超广谱β-内酰胺酶(guiana extended-spectrum β-lactamase，GES)和Bicêtre碳青霉烯酶(bicêtre carbapenemase，BIC)，KPC型丝氨酸酶检出率最高，为61.7%(309/501)；碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测单产A类丝氨酸碳青霉烯酶、单产B类金属酶以及同时产A类和B类酶菌株的符合率均为100%。
结论
湖南省长沙市CRE菌株分布非常广泛，产碳青霉烯酶(特别是KPC型丝氨酸酶)是这类细菌对碳青霉烯类药物耐药的主要机制。在湖南省长沙市首次检出了肠杆菌目细菌携带GES、IMI型基因。碳青霉烯酶抑制剂增强试验结果显示该方法能准确检测产A类丝氨酸酶和B类金属酶的CRE，且操作简单、结果容易判读，能满足临床微生物实验室丝氨酸碳青霉烯酶和/或金属酶检测的需求，为临床精准用药提供依据。
Keywords: 碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌, 碳青霉烯酶, 产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌, 碳青霉烯酶抑制剂增强试验
Abstract
Objective
The prevalence of carbapenem-resistant Enterobacterales (CRE) presents a significant challenge in clinical anti-infective treatment. This study aims to investigate drug resistance and the molecular epidemiological characteristics of CRE in our area. Additionally, we seek to evaluate practicality of utilizing carbapenemase inhibitor enhancement test in clinical laboratory.
Methods
Non-repeated CREs isolated from clinical specimens at Xiangya Hospital, Central South University, were collected. Minimum inhibitory concentration (MIC) combined with Kirby-Bauer (KB) assay was used to detect the drug susceptibility of the strains, and 13 carbapenemase-producing genes were detected by PCR. The phenotype of 126 strains of carbapenemase-producing Enterobacterales identified by PCR was detected by the carbapenemase inhibitor enhancement test to understand the agreement between the method and the gold standard PCR results.
Results
Among 704 CRE strains examined, we observed significant drug resistance in 501 strains dentified as carbapenemase-producing Enterobacterales (CPE). Klebsiella pneumoniae was the predominant CPE strain, followed by Enterobacter cloacae and Escherichia coli. A total of 9 carbapenemase types were detected, including Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), New Delhi metallo-β-lactamase (NDM), Verona integron- encoded metallo-β-lactamases (VIM), imipenemase (IMP), oxacillinase-48 (OXA-48), and rare imipenem-hydrolyzing β-lactamase (IMI), adelaide imipenemase (AIM), Bicêtre carbapenemase (BIC), and guiana extended-spectrum β-lactamase (GES). The detection rate of KPC serine carbapenemase was 61.7% (309/501). The carbapenemase inhibitor enhancement test exhibited a 100% consistency rate for the strains producing Class A serine carbapenemase and/or Class B metallo-β-lactamases.
Conclusion
CRE strains in Changsha, Hunan, China, are wide distribution and exhibit carbapenemase production. The main mechanism of carbapenem resistance in these bacterias is predominatly attributed to the production of KPC serine carbapenemase. The presence of GES and IMI genes carried by Enterobacterales has been detected for the first time in this region. The carbapenemase inhibitor enhancement test has been proven to be an accurate method for detecting CRE producing Class A serine carbapenemase and/or Class B metallo-β-lactamases. This method offers simpicity of operation and ease of results interpretation, making it weel-suited meeting the clinical microbiology laboratory’s reguirements for the detection of serine carbapenemase and metallo-β-lactamases.
Keywords: carbapenem-resistant Enterobacterales, carbapenemase, carbapenemase producing Enterobacterales, carbapenemase inhibition enhancement test
最新的中国细菌耐药监测数据[1]显示，多重耐药肠杆菌目细菌的检出呈现增长趋势。而碳青霉烯类抗菌药物通常被认为是治疗多重耐药肠杆菌目细菌所致感染的最后一道防线[2]。目前肠杆菌目细菌虽然对3种碳青霉烯类药物的耐药率仍较低[1]，但令人担忧的是碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE)通常会表现出广泛耐药甚至全耐药的特性，使临床抗感染治疗变得相当棘手，导致感染患者的病死率增高[3]。CRE的出现最常见的机制可能是碳青霉烯酶的产生[4]。我国临床分离CRE菌株以产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)和新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)型碳青霉烯酶为主[5-6]，而不同的碳青霉烯酶抑制剂，对产不同种类的碳青霉烯酶的抑制能力不同，因此，《肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识(第二版)》[7](以下简称《专家共识》)中高度推荐使用碳青霉烯酶抑制剂增强试验对CRE菌株耐药表型进行常规检测，为临床抗感染方案的选择提供依据。本研究对本地区临床分离CRE菌株的耐药情况及碳青霉烯酶的分子流行病学进行分析，并选取经PCR确定为产碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌(carbapenemase producing Enterobacterales，CPE)进行碳青霉烯酶抑制剂增强试验，以评估该方法在临床微生物实验室中的应用价值，为临床抗感染治疗的精准用药和医院感染预防和控制提供实验室依据。
1. 材料与方法
1.1. 菌株来源
收集中南大学湘雅医院临床微生物实验室于2016年1月至2020年9月期间，临床送检的各类标本中分离的非重复CRE菌株704株。质控菌株：大肠埃希菌ATCC-25922。
1.2. 方法
1.2.1. 菌株鉴定及药物敏感性试验
所有实验菌株均使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS，德国Bruker公司)进行鉴定。采用全自动微生物药敏分析系统(VITEK-2 Compact，法国Bio Mérieux公司)联合KB纸片法进行药物敏感性试验，结果用美国临床与标准化协会CLSI 2020版M-100标准进行判断[8]。
1.2.2. 碳青霉烯酶基因检测
采用煮沸法提取细菌的总DNA，PCR方法检测13种碳青霉烯酶基因。采用多重PCR的方法[9]检测3组碳青霉烯酶基因：A组为bla SPM、bla IMP及bla VIM，B组为bla NDM、bla KPC、bla BIC及bla OXA-48like，C组为bla AIM、bla GIM、bla SIM及bla DIM；另外再分别检测bla GES、bla IMI基因。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.3. 碳青霉烯酶抑制剂增强试验
选择经PCR及DNA测序确定的126株CPE，包括60株产A类酶菌株(52株KPC、2株AIM、2株IMI、2株AIM+KPC、1株GES以及1株GES+KPC基因阳性菌株)，60株产B类酶菌株(包括24株NDM、20株VIM、7株IMP、6株NDM+VIM、3株VIM+IMP基因阳性菌株)，6株同时产A、B两类碳青霉烯酶的菌株(3株NDM+KPC、3株VIM+KPC)。参照《专家共识》附件1——《表型检测A类丝氨酸碳青霉烯酶和B类金属β内酰胺酶》，进行实验的具体操作和结果判读。
2. 结 果
2.1. CRE菌株分布及药物敏感性
704株CRE以肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和大肠埃希菌为主，同时包括临床较少分离的变栖克雷伯菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、非脱羧勒克菌等共15种肠杆菌目细菌(表1)。药物敏感性试验结果显示CRE对头孢菌素类、头霉素类、阿莫西林/克拉维酸钾、氨曲南等药物高度耐药(耐药率均超过90.0%)，对厄他培南的耐药率(96.4%)高于亚胺培南(88.1%)和美罗培南(86.9%)。对替加环素、阿米卡星、庆大霉素和复方新诺明的敏感率分别为90.1%、54.1%、35.3%和48.2%。
表1.
704株CRE及501株CPE菌种分布情况
Table 1 Distribution of 704 strains of CRE and 501 strains of CPE
| 菌种 |
肺炎克 雷伯菌/株 |
阴沟肠 杆菌/株 |
大肠埃 希菌/株 |
产气克 雷伯菌/株 |
黏质沙 雷菌/株 |
产酸克 雷伯菌/株 |
弗氏柠檬酸杆菌/株 |
阿氏肠 杆菌/株 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CRE | 406 | 114 | 101 | 22 | 14 | 11 | 11 | 11 |
| CPE | 314 | 94 | 58 | 7 | 1 | 9 | 6 | 8 |
| 菌种 |
奇异变形 杆菌/株 |
雷极普罗威登斯菌/株 |
克氏柠檬酸 杆菌/株 |
非脱羧勒克菌/株 |
解鸟氨酸拉 乌尔菌/株 |
变栖克雷伯菌/株 |
布氏柠檬酸 杆菌/株 |
合计/株 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CRE | 6 | 2 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 704 |
| CPE | 1 | 1 | 1 | 1 | — | — | — | 501 |
CRE：碳青霉烯酶耐药肠杆菌目细菌；CPE：产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌。
2.2. CPE菌株分布情况
碳青霉烯酶基因检测结果确定产碳青霉烯酶菌株共501株(表1)，仍以肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和大肠埃希菌为主；其中阴沟肠杆菌CPE/CRE的比值最高，达82.46%(94/114)，肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的CPE/CRE比值分别为77.34%(314/406)、57.42%(58/101)。CRE及CPE菌株的5种主要标本来源分别为痰液、血液、尿液、创面分泌物和腹腔引流液，其中腹腔引流液分离的CRE菌株产酶比例最高，为70.18%(40/57)。CPE菌株占比前3位的病房分别为ICU病房(24.95%，125/501)、普通外科(10.38%，52/501)、呼吸内科(8.18%，41/501)，其中呼吸内科CRE菌株中产酶菌株占比最高(78.85%，41/52)。
2.3. 碳青霉烯酶基因检测结果
共检测出9种碳青霉烯酶基因，以bla KPC基因为主(61.7%，309/501)，首次在本地区检出bla GES和bla IMI。41株菌同时携带2种碳青霉烯酶基因，1株阴沟肠杆菌的bla NDM、bla GES和bla VIM基因检测都阳性，此外有11株CRE携带bla OXA-48基因。肺炎克雷伯菌的主要碳青霉烯酶类型是KPC酶，而阴沟肠杆菌以金属酶为主，并且产酶种类更为丰富，携带2种或以上酶型的菌株主要为阴沟肠杆菌。同时，携带OXA-48型碳青霉烯酶的菌株主要来自阴沟肠杆菌复合群(包括阴沟肠杆菌和阿氏肠杆菌)。大肠埃希菌最主要的酶型为NDM，占82.76%(48/58)。具体碳青霉烯酶基因检出情况见表2。
表2.
501株CPE碳青霉烯酶基因检出情况
Table 2 Carbapenemase gene detection of 501 CPE strains
| 基因型 | 肺炎克雷伯菌/株 | 阴沟肠杆菌/株 | 大肠埃希菌/株 | 产酸克雷伯菌/株 | 阿氏肠杆菌/株 | 产气克雷伯菌/株 | 弗氏柠檬酸杆菌/株 | 黏质沙雷菌/株 | 奇异变形杆菌/株 | 雷极普罗威登斯菌/株 | 克氏柠檬酸杆菌/株 | 非脱羧勒克菌/株 | 合计/株 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 合计 | 314 | 94 | 58 | 9 | 8 | 7 | 6 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 501 |
| KPC | 286 | 9 | 2 | 1 | — | 1 | — | — | — | — | — | — | 299 |
| NDM | 13 | 7 | 48 | 7 | 2 | 5 | 5 | — | — | 1 | — | 1 | 89 |
| VIM | 1 | 46 | 1 | — | 1 | 1 | — | — | — | — | — | — | 50 |
| IMP | 6 | 1 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 7 |
| OXA-48 | 1 | 5 | — | — | 1 | — | — | — | — | — | — | — | 7 |
| IMI | — | — | 1 | — | — | — | 1 | — | — | — | — | — | 2 |
| AIM | — | 1 | 1 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 2 |
| BIC | 2 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 2 |
| GES | — | — | — | — | — | — | — | 1 | — | — | — | — | 1 |
| NDM+VIM | — | 14 | — | — | 2 | — | — | — | 1 | — | 1 | — | 18 |
| VIM+OXA48 | — | 4 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 4 |
| VIM+KPC | — | 2 | — | — | 2 | — | — | — | — | — | — | — | 4 |
| VIM+IMP | — | 3 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 3 |
| NDM+KPC | 2 | — | — | 1 | — | — | — | — | — | — | — | — | 3 |
| AIM+KPC | — | — | 2 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 2 |
| NDM+IMP | — | 1 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 1 |
| NDM+BIC | 1 | — | 1 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 2 |
| AIM+NDM | — | — | 1 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 1 |
| AIM+BIC | — | — | 1 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 1 |
| BIC+IMP | 1 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 1 |
| GES+KPC | 1 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 1 |
| NDM+VIM+GES | — | 1 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 1 |
CPE：产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌；KPC：肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶；NDM：新德里金属β-内酰胺酶；VIM：维罗纳整合子金属酶β-内酰胺酶；IMP：亚胺培南酶；OXA-48：苯唑西林酶48型；IMI：亚胺培南水解β-内酰胺酶；AIM：阿德莱德亚胺培南酶；GES：圭亚那超广谱β-内酰胺酶；BIC：Bicêtre碳青霉烯酶。
2.4. 碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测结果
碳青霉烯酶抑制剂增强试验结果(图1)显示：初始发现4株CRE的表型检测结果与基因检测结果不符，追溯原因发现其中3株细菌对厄他培南(ertapenem，ETP)耐药，而对亚胺培南(imipenem,IPM)敏感；另1株阴沟肠杆菌对美罗培南(meropenem，MEM)耐药而对IPM敏感。因初始试验统一采用IPM纸片，无法判读试验结果，将这4株细菌分别改用ETP和MEM再次进行试验后得到与基因检测一致的结果。如图2所示，编号为302的大肠埃希菌，PCR检测为携带A类酶基因bla IMI，用IPM未检测出耐药表型(图2A)，改用ETP检测为A类酶(图2B)。最终126株产丝氨酸碳青霉烯酶和/或金属酶菌株的碳青霉烯酶抑制剂增强试验结果与基因检测结果完全一致。
图1.
碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测CRE
Figure 1 Carbapenemase inhibitor enhancement test for detection of CRE A: No.693 strain producing KPC type carbapenemase (Class A β-lactamase); B: No.50 strain producing metallo-β-lactamase; C: No.75 strain producing both metallo-β-lactamase and KPC type carbapenemase. CRE: Carbapenem-resistant Enterobacterales; IPM: Imipenem; EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid; APB: 3-Aminophenylboronic acid hydrochloride.
图2.
1株IPM敏感而ETP耐药的大肠埃希菌的碳青霉烯酶抑制剂增强试验结果对比
Figure 2 Comparison of carbapenemase inhibitor enhancement test results for an IPM sensitive but ETP resistant Escherichia coli strain
A: Escherichia coli is sensitive to IPM and the test is ineffective; B: After IPM was changed, the strain produces serine enzyme. IPM: Imipenem; ETP: Ertapenem; EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid; APB: 3-Aminophenylboronic acid hydrochloride.
3. 讨 论
本研究连续收集了一所综合性三甲医院临床各类标本分离的CRE共704株，菌种分布显示以肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和大肠埃希菌为主，这与胡付品等[10]对CHINET三级医院细菌耐药监测数据的分析结果相符，即在国内主要地区36所三级医院的12 712株CRE菌株中，排名前3的是肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌。所分离的CRE涉及15种肠杆菌目细菌，包括临床少见的变栖克雷伯菌、解鸟氨酸拉乌尔菌及非脱羧勒克菌等，菌种分布非常广泛，应引起临床的高度重视。在本研究结果中，肺炎克雷伯菌为主要的CRE菌种、临床分离CRE菌株的标本来源以呼吸道为主、病房分离率最高的为ICU病房等流行病学特征与我国其他地区的研究结果相一致[11-13]。肺炎克雷伯菌感染对ICU患者构成严重威胁，因为病原体能够污染医院病房的环境表面，增加患者、ICU工作人员和环境之间传播的可能性[14]。细菌体外药敏试验结果显示：CRE对多种抗菌药物高度耐药，导致治疗感染方案的选择十分有限，因此应采取有效的控制感染措施以限制CRE的传播，如积极对患者特别是入住ICU的患者进行肠道CRE定植的筛查、执行接触隔离等。
本研究对所有CRE菌株进行了包括A类丝氨酸酶、B类金属β内酰胺酶和D类OXA-48型酶共13种碳青霉烯酶基因型的检测，在本地区首次检出了肠杆菌目细菌携带GES、IMI型丝氨酸碳青霉烯酶基因。值得关注的是，虽然肺炎克雷伯菌是最主要的CRE菌种，但是本研究数据显示阴沟肠杆菌的CPE/CRE比值却是最高的，达到82.46%(94/114)。基因检测结果显示：阴沟肠杆菌产碳青霉烯酶的种类更为多样化，且同时携带2种或以上的碳青霉烯酶基因菌株也多来源于阴沟肠杆菌及其复合群。因此，临床和实验室应加强对临床分离阴沟肠杆菌的重视，笔者后续会对阴沟肠杆菌碳青霉烯酶的传播机制进行深入研究。
国内多项研究[15-17]证实碳青霉烯酶抑制剂增强试验在检测A类丝氨酸酶、B类金属酶以及复合酶方面都具有较高的特异性和敏感性。本研究初始结果显示有4株表型检测失败，寻找原因发现这4株菌为非IPM耐药菌株，改用耐药的ETP或MEM再次进行检测得到准确结果，最终126株CRE的表型验证试验结果与基因检测结果完全一致。在中国，产丝氨酸碳青霉烯酶和金属酶是CRE菌株对碳青酶烯类药物耐药的主要机制[6,18-19]，因此碳青霉烯酶抑制剂增强试验在极大程度上能满足临床CRE菌株耐药表型的检测，为临床医师合理选择抗生素提供有效信息。值得注意的是，如果实验室常规采用IPM进行表型检测，可能会无法正确判读IPM敏感而ETP或MEM耐药的CRE菌株的表型；并且CRE药敏情况表明，用ETP检测CRE比其他2种碳青霉烯类药物更为敏感，特别是在阴沟肠杆菌中，绝大部分仅对ETP耐药而对IPM和MEM敏感的菌株被检出碳青霉烯酶耐药基因(主要为bla NDM)。因此，本研究结果给临床微生物实验室一个非常重要的提示：在进行碳青霉烯酶抑制剂增强试验时，需根据具体耐药情况选择合适的碳青霉烯类药物纸片。本地区以bla KPC和bla NDM为主要的碳青霉烯酶耐药基因，但是本研究纳入了检出较少的bla IMP、bla VIM，检出极少的bla AIM和首次在本地区检出的bla IMI、bla GES，具有较好的代表性。本研究也存在不足，如同时携带2种酶型的细菌只有6株，后续将收集更多同时产多种碳青霉烯酶的菌株进行相关验证试验。
综上所述，CRE菌种分布非常广泛，涉及15种临床分离的肠杆菌目细菌，产A类丝氨酸碳青霉烯酶和B类金属酶是肠杆菌目细菌对碳青霉烯类药物耐药的主要机制。无论是CRE还是CPE，肺炎克雷伯菌都为最主要的菌种，值得注意的是阴沟肠杆菌产酶比例最高，且携带复合酶的概率更大。碳青霉烯酶抑制剂增强试验对临床常见A类丝氨酸酶和B类金属酶具有较高的检出符合率，操作简单，结果容易判读，可为临床抗感染治疗的精准用药提供依据。但不能用于检测D类OXA-48型碳青霉烯酶。对未能检测出酶型的菌株，需借助其他检测方法，如酶免疫层析技术、分子生物学方法等。
基金资助
湖南省自然科学基金(2022JJ40847)；湖南省科技创新项目投资计划(湘发改投资〔2014〕658号)。
This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province (2022JJ40847) and Hunan Provincial Science and Technology Innovation Project Investment Plan (2014-658), China.
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
作者贡献
李虹玲 研究实施，数据采集与分析、论文撰写与修改；钟一鸣 数据采集，论文修改和研究经费的支持；晏群 数据分析，论文指导及修改；刘文恩 实验设计，论文审阅和指导；梁湘辉 实验构思和实施，数据统计与分析，论文修改。所有作者阅读并同意最终的文本。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2023081210.pdf
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