静电纺纳米纤维PLCL/纤维蛋白原人工韧带的生物相容性评价

Abstract

The study aimed to evaluate the safety and function of poly(lactic-acid-co-ε-caprolactone) (PLCL)/fibrinogen nanofibers (P/F-Ns), and provide theoretical basis for the clinical application. The surface morphology, mechanical properties, the hydrophilicity and the fibrinogen content of P/F-Ns were tested by scanning electron microscope, the material testing machine, the contact angle meter and the microplate reader, respectively. The cell adhesion, proliferation and ligament remodeling genes expression of Hig-82 cells on P/F-Ns were conducted through cell counting kit-8 (CCK-8) and real-time quantitative PCR analyses, respectively. The results showed that with the increase of the fibrinogen content, the pore sizes and hydrophilicity of three P/F-Ns increased, but the mechanical properties decreased. Cell adhesion and proliferation tests showed that P/F-N-2 held the best ability to promote cell adhesion and proliferation. The ligament remodeling genes expressions of Hig-82 cells on P/F-N-1, P/F-N-2 and P/F-N-3 were all up-regulated compared to P/F-N-0 on days 3 and 7. All the three P/F-Ns containing fibrinogen (P/F-N-1, P/F-N-2 and P/F-N-3) had better biocompatibility compared to P/F-N-0, and could be efficiently applied to the reconstruction of anterior cruciate ligament.

引言

前交叉韧带是膝关节内一种致密的结缔组织，主要由胶原（Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和Ⅴ型胶原）、弹性蛋白、糖基质蛋白及蛋白聚糖组成，在维持膝关节稳定性和功能运动中起重要的作用^[1]。然而，在频繁的膝关节运动中，前交叉韧带的生物力学性能极易受损。文献研究表明，前交叉韧带损伤发生率为35/100 000人，其中女性运动员的发生率是男性运动员的2～8倍^[2-3]。仅仅在美国，每年将发生100 000～200 000韧带损伤案例^[4-5]。大部分韧带损伤患者还伴随患有关节炎和滑膜炎等，这将严重影响其正常生活，降低其生活质量。

由于韧带的有限自我再生能力，前交叉韧带修复在临床医疗上面临巨大的挑战。目前韧带修复的手术治疗方法为前交叉韧带重建术，使用自体移植物^[6]、同种异体移植物、异种移植物或人工韧带移植物等。自体韧带移植物是目前临床疗效理想的替代物，但是存在增加供体部位发病率、损坏自身健康组织的风险。同种异体和异种移植物也会带来一系列的免疫排斥反应，加剧患者的损伤情况和增加患者康复周期^[7-8]。因此，人工韧带移植物在临床医疗应用中受到关注。

人工韧带移植物材料包括合成聚合物高分子、天然高分子以及复合材料等。合成聚合物高分子一般认为具有良好的力学性能，但生物相容性不足，可能产生骨关节炎和滑膜炎等^[9-14]，目前上市的产品包括Gore-Tex十字交叉韧带、Stryker Dacrone韧带和3M Kennedy LADTM韧带增强器^[15-20]。天然高分子材料包括胶原、蚕丝蛋白、纤维蛋白原、明胶及壳聚糖等，生物相容性优于合成聚合物，但通常不能提供足够的力学支撑。由两者构成的复合材料被认为将具有合适的力学性能和生物相容性，因此在韧带修复的研究中获得了越来越多的应用。

本研究中人工韧带是由聚乳酸-己内酯［poly（lactic-acid-co-ε-caprolactone），PLCL］和猪源的纤维蛋白原按照不同比例混合经静电纺丝技术制成的前交叉韧带修复材料，其中的纤维蛋白原被认为具有改善材料亲水性、赋予修复材料良好细胞相容性的作用，因此本课题主要对韧带修复材料的理化性能（包括表面形貌、力学性能、亲水性和纤维蛋白原含量）和细胞相容性（细胞黏附增殖、基因表达）进行研究，为开展动物体内韧带修复实验提供依据。

1. 材料与仪器

Hig-82滑膜细胞（ATCC^® CRL-1832^TM）购买于美国ATCC公司，人工韧带是由上海松力生物技术有限公司按课题组要求以不同比例的PLCL和纤维蛋白原为原料通过静电纺丝技术制成的PLCL/纤维蛋白原纳米纤维膜（PLCL/fibrinogen nanofibers，P/F-Ns），其中纤维蛋白原含量分别为0 mg/g（P/F-N-0）、70 mg/g（P/F-N-1）、140 mg/g（P/F-N-2）和180 mg/g（P/F-N-3）。

主要试剂有：硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾、氢氧化钠（阿拉丁公司，中国），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、青链霉素混合液、CCK-8（Solarbio公司，中国），胎牛血清、Ham's F-12培养液（Gibco公司，美国），PBS（Hyclone公司，美国），RNeasy Plus Mini Kit、QuantiTect Reverse Transcription Kit（Qiagen，德国），TB Green Premix Ex Taq II（TAKARA，日本），ddH₂O（生工生物工程公司，中国）。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

主要仪器有：SU8010 Scanning Electron Microscope（HITACHI公司，日本），OCA40接触角测量仪（Dataphysics公司，德国），XPE205电子天平（梅特勒公司，美国），JXFSTRRP-CL冷冻研磨机（上海净信公司，中国），H5K-S材料测试机（Hounsfield公司，英国），Spectramax M5酶标仪（Molecular Devices公司，美国），MJ-54A高压灭菌锅（上海施都凯公司，中国），BAO-80A干燥箱（上海施都凯公司，中国），MQT-60R恒温摇床（上海旻泉公司，中国），BB150 CO₂细胞培养箱（Thermo公司，美国），倒置荧光显微镜（奥林巴斯公司，日本），TD5台式低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司，中国），Veriti基因扩增仪（Life Techonology公司，美国），Lightcycler480Ⅱ实时定量PCR仪（Roche公司，瑞士）。

2. 实验方法

2.1. 表面形貌观察

将P/F-Ns剪成0.5 cm×0.5 cm的大小，用双面胶固定到载物台上，在真空状态下喷金2 min，然后在5 kV电压下进行表面形貌的拍摄。每种样品随机选取四张3 000倍扫描电镜图，并根据式(1)通过图像分析软件Image J（National Institutes of Health，美国）计算孔隙率。每种样品再随机选取100根纤维并通过Image J测量纤维直径。

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2.2. 力学性能测试

人工合成韧带必须具备一定的拉伸强度和应力-应变行为，在植入人体后才能发挥较好的替代作用，满足患者日常生活的需求。因此本实验拟借助H5K-S材料测试机研究不同P/F-Ns的力学性能。具体操作为：将4种P/F-Ns剪成1 cm × 5 cm的大小，用双面胶分别将材料的两端1 cm处固定在两块载玻片上，然后将两端的载玻片固定到H5K-S材料测试机的夹具上，在室温为20 ℃、相对湿度为60%的环境下，以10 mm/min的速度进行拉伸测试。应力、应变计算如下式：

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2.3. 亲疏水性测试

在测试样品上滴加3 µL水滴，通过接触角测量仪测量50 s内水滴在P/F-Ns上的角度变化并记录。每种样品测试三个平行样。

2.4. 纤维蛋白原含量测试

双缩脲试剂的制备：取硫酸铜1.5 g、酒石酸钾钠6.0 g和碘化钾5.0 g，加纯化水500 mL使其溶解，边搅拌边加10%的氢氧化钠溶液300 mL，纯水稀释至1 000 mL，混匀。以双缩脲试剂为溶剂，配制1 mL浓度分别为2、4、6、8、10 mg/mL的BSA标准品溶液，以双缩脲溶液为空白对照，每种浓度设置三个平行样。

分别称取质量约为50 mg的四种P/F-Ns样品并剪碎。向剪碎的P/F-Ns中加入1 mL双缩脲试剂，以65 Hz的频率冷冻研磨匀浆60 s后置于–20 ℃冰箱降温5 min。重复匀浆过程5次后，以4 000 r·min⁻¹的速度离心10 min。取500 µL上清液，加入500 µL双缩脲试剂并混匀作为测试样品溶液，每种P/F-Ns设置三个平行样。

以上各管均加入4 mL双缩脲试剂，混匀，室温放置30 min，在波长540 nm处测量吸光度。以BSA标准品的浓度为横坐标，以其相应的吸光度值为纵坐标求得线性回归方程。将测试样品吸光度值代入标准曲线方程得到相应的纤维蛋白原浓度，然后计算样品的纤维蛋白原含量。

2.5. 细胞黏附实验

使用荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（5，6-carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester，CFSE）标记Hig-82细胞，在不透光的P/F-Ns材料表面进行荧光标记细胞的观察，具体步骤为：在细胞悬液中加入50 µmol·L⁻¹的CFSE染液，混匀后置于37 ℃、含5% CO₂细胞培养箱中孵育15 min后，加入预冷的PBS终止反应。随后以1 000 r·min⁻¹的速度离心5 min，弃上清，用PBS反复冲洗3次，离心（条件同上），弃去上清，加入含10%胎牛血清的完全培养液制备成CFSE标记的细胞悬液。将P/F-Ns剪成直径为11 mm的圆片置于48孔板中，每种P/F-Ns分别设置三个平行样。每孔加入1 mL完全培养液润湿2 h，弃去培养液备用。P/F-Ns上每孔播种1×10⁵个细胞，37 ℃培养箱分别培养4、24 h后，在荧光显微镜下观察细胞数量及形态。

同时，另取未用CFSE标记的Hig-82细胞同法接种P/F-Ns膜，在放入37 ℃、含5% CO₂培养箱孵育4、24 h后，弃去细胞培养液，每孔加入500 µL完全培养液以及20 µL CCK-8溶液后，放入37 ℃、含5% CO₂培养箱孵育4 h。孵育完成后，每孔分别吸取100 µL培养液于450 nm下测量吸光度。

2.6. 细胞增殖实验

P/F-Ns处理同2.5。每种P/F-Ns分别设置三个平行样，P/F-Ns上每孔分别播种1×10⁴、4×10⁴个细胞，37 ℃培养箱分别培养1、3、5、7 d后，弃去细胞培养液，每孔加入500 µL完全培养液以及20 µL CCK-8，放入37 ℃、含5% CO₂培养箱孵育4 h。孵育完成后，每孔吸取100 µL培养液在450 nm下测量吸光度。

2.7. 韧带组织相关蛋白基因表达测试

P/F-Ns处理同2.5。每种P/F-Ns分别设置三个平行样，P/F-Ns上每孔播种4×10⁴个Hig-82滑膜细胞，分别培养3 d和7 d。在P/F-Ns上用0.25%的Trypsin-EDTA消化细胞，用RNeasy Plus Mini Kit提取RNA，并使用QuantiTect Reverse Transcription Kit逆转录成为cDNA。20 µL实时定量荧光PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）反应体系为：10 µL的TB Green Premix Ex Taq II，上游引物和下游引物（浓度为10 µmol·L⁻¹）各0.8 µL，2 µL的cDNA，6.4 µL的ddH₂O。RT-qPCR扩增程序为：95 ℃预变性30 s，40个循环的扩增：95 ℃变性10 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s。每组三个复孔。以GAPDH为内参引物，以P/F-N-0为对照，进行相对定量。相关基因引物如表1所示。

表 1. Genes primers related to ligament repair.

韧带修复相关基因引物

Gene	Forward primer sequences	Reverse primer sequences
GAPDH	5′-CCTGCCGCCTGGAGAAAGCT-3′	3′-ACGACCTGGTCCTCGGTGTAG-5′
COL1A1	5′-GCAGGGCTCCAATGATGT-3′	3′-CAAGGAAGGGCAAACGAG-5′
COL1A3	5′-TGGATCAGGCCAGTGGGAAT-3′	3′-AGCAGCCATCCTCCAGAACT-5′
BIGLYCAN	5′-GGATCTGCTCCGATACTCCAAGT-3′	3′-GCTCAGGCTCCCGTTCTCAA-5′
DECORIN	5′-TACCAACATAACCACCATCCC-3′	3′-CCCAACTTAGCCAAATTATTCA-5′

2.8. 统计学分析

所有数据均用SPSS 26.0软件进行统计分析，数据形式为均值±标准差。本文各实验组分别与对照组比较，采用t检验。所有的统计分析中，检验水准均为0.05。

3. 结果

3.1. 表面形貌观察

如图1所示，P/F-N-0表面致密，几乎未见孔隙。P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3表面呈网状结构，P/F-Ns的孔隙率随纤维蛋白原含量增加而逐渐增大。其中P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3的孔隙率分别为：（15.42 ± 1.31）%、（28.53 ± 1.70）%、（33.85 ± 1.12）%。P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3纤维直径分别为（603.92 ± 158.61）、（413.96 ± 187.02）、（244.54 ± 42.81）nm，表明随着纤维蛋白原含量的增加，P/F-Ns的纤维直径逐渐减小。

图 1.

The surface morphology of P/F-Ns (3 000 ×)

P/F-Ns的表观形貌图（3 000 ×）

3.2. 力学性能分析

如图2所示，P/F-N-0、P/F-N-1、P/F-N-2与P/F-N-3断裂时的应变分别为：（122.58 ± 0.18）%、（140.36 ± 0.21）%、（75.11 ± 3.13）%、（68.74 ± 0.11）%，断裂时的拉伸强度分别为（35.66 ± 0.32）、（12.24 ± 0.12）、（8.02 ± 0.54）、（7.25 ± 0.22）MPa。因此，P/F-N-0、P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3的断裂强度依次降低。上述实验现象表明未添加纤维蛋白原的P/F-N-0具有较好的力学性能，而纤维蛋白原的增加会降低P/F-Ns的力学性能。这是因为由无规则的纳米纤维堆积而成的静电纺纳米纤维膜的力学性能不仅与材料本身性能有关，还与纤维膜的结构（如纤维孔隙、纤维直径、纤维的长度和纤维直径的粘连程度）有关。由前文扫描电镜结果可知，P/F-N-0表面致密，几乎无孔隙，并且纳米纤维抱团缠绕在一起，不容易产生滑脱。随着纤维蛋白原含量增加，纤维直径逐渐减小，孔隙逐渐增大，膜变得较为松散，纤维之间的连接和缠绕较少，摩擦力也变小，在拉力的作用下极易从纳米纤维膜中抽离出来，最终断裂。

图 2.

The mechanical properties results of P/F-Ns

P/F-Ns的力学性能结果

3.3. 亲疏水性分析

在50 s内，P/F-N-0的接触角大小基本不变（74.32～71.51°），而P/F-N-1的接触角从75.21°减小到63.33°，P/F-N-2的接触角从72.53°减小到41.21°，P/F-N-3的接触角从70.65°减小到33.23°。如图3所示，当水滴接触30 s后，P/F-N-0、P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3的接触角分别为：（72.75 ± 1.26）°、（64.67 ± 1.16）°、（60.35 ± 4.24）°、（49.33 ± 3.51）°。与P/F-N-0相比，含有纤维蛋白原的P/F-Ns的接触角明显减小，且随着纤维蛋白原的增加接触角逐渐减小。

图 3.

The contact angle of P/F-Ns

P/F-Ns接触角

**：与P/F-N-0相比，P＜0.01

**: compared with P/F-N-0, P < 0.01

3.4. 纤维蛋白原含量

BSA定量标准曲线为Y = 0.048 03 X + 0.003 52，其中R² = 0.999 34。通过计算得出P/F-N-1纤维蛋白原含量为（67.81 ± 1.88）mg/g，P/F-N-2纤维蛋白原含量为（140.23 ± 3.25）mg/g，P/F-N-3纤维蛋白原含量为（151.33 ± 13.46）mg/g。

3.5. 黏附和增殖结果

如图4左图所示，当Hig-82细胞与P/F-Ns共培养4 h时，在P/F-Ns上的细胞数量较少，前三组几乎无差别，P/F-N-3上的细胞数最多。当Hig-82细胞与P/F-Ns共培养24 h时，各组荧光强度均增强，表明黏附在P/F-Ns上的细胞数量增多。其中黏附在P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3上的细胞数量较多，且在P/F-N-2上的部分细胞形态呈梭形。如图4右图所示，当Hig-82细胞与P/F-Ns共培养4 h时，细胞吸光度值较低。当Hig-82细胞与P/F-Ns共培养24 h时，P/F-Ns上的细胞吸光度值均有所增高，P/F-N-0与其他三组的吸光度值具有显著差异（P < 0.01）。其中P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3上的细胞吸光度值较高，表明添加纤维蛋白原的P/F-Ns更有利于细胞的黏附。

图 4.

Adhesion of CFSE-stained HIG-82 cells to P/ F-Ns

CFSE染色的Hig-82细胞在P/F-Ns上的黏附

**：与P/F-N-0相比，P < 0.01

**: Compared with P/F-N-0, P < 0.01

如图5a所示，当Hig-82细胞接种量为1 × 10⁴个时，在7天的培养过程中P/F-N-0的细胞吸光度值均未表现出明显的增加，表明细胞未明显增殖；而在含有纤维蛋白原的材料上，虽然在3天时细胞吸光度值未明显变化，但从第5天开始，P/F-N-2和P/F-N-3的细胞吸光度值均明显增加；在第7天时，P/F-N-1的细胞吸光度值也开始明显增加，P/F-N-2和P/F-N-3的细胞吸光度值进一步增加，表明P/F-Ns中含有的纤维蛋白原有促进细胞增殖的作用。

图 5.

Proliferation of Hig-82 synovial cells in P/F-Ns

Hig-82滑膜细胞在P/F-Ns上的增殖

a. 接种密度为1×10⁴个；b. 接种密度为4×10⁴个。*：与P/F-N-0相比，P＜0.05；**：与P/F-N-0相比，P＜0.01；N.S.：not significant

a. inoculation densities: 1×10⁴; b. inoculation densities: 4×10⁴. *: compared with P/F-N-0, P < 0.05; **: compared with P/F-N-0, P < 0.01; N.S.: not significant

当Hig-82细胞接种量增加为4×10⁴个时，如图5b所示，虽然P/F-N-0的细胞吸光度值在7天的培养过程中逐渐升高，表明细胞有增殖，但是在每一检测时间点，P/F-N-0的细胞吸光度值均明显低于含有纤维蛋白原的P/F-Ns，表明细胞在含有纤维蛋白原的材料上增殖更为明显。且随着细胞接种数量的增加，细胞在含有纤维蛋白原的P/F-Ns上接种后迅速出现明显增殖，第1天时，P/F-N-2和P/F-N-3的细胞吸光度值就明显增加，在第3天时，P/F-N-1的细胞吸光度值开始升高。7天的增殖实验结果显示，在含有纤维蛋白原的材料中， P/F-N-2上的细胞数量增加更为明显，表明该浓度的纤维蛋白原更有利于细胞在纳米纤维膜上的增殖。

3.6. 韧带组织相关蛋白基因表达结果

COAL1和COAL3是构成韧带组织的主要细胞外基质，其DECORIN和BIGLYCAN能够影响胶原纤维组装^[21]。如图6所示，3天和7天时，除个别组外，在含有纤维蛋白原的P/F-Ns上细胞的COAL1、COAL3、BIGLYCAN、DECORIN基因表达均明显高于P/F-N-0组。

图 6.

Gene expression of Hig-82 cells cultured on P/F-Ns for 3 d and 7 d, respectively

Hig-82细胞在P/F-Ns上培养3 d和7 d时，各基因在P/F-Ns的表达情况

a. P/F-N-0；b. P/F-N-1；c. P/F-N-2；d. P/F-N-3。*：与P/F-N-0相比，P＜0.05；**：与P/F-N-0相比，P＜0.01

a. P/F-N-0; b. P/F-N-1; c. P/F-N-2; d. P/F-N-3. *: compared with P/F-N-0, P < 0.05; **: compared with P/F-N-0, P < 0.01

4. 讨论

前交叉韧带连接着股骨下端和胫骨上端，在骨与骨之间传递能量以促进运动，对于维持膝关节内部的稳定性和正常的生命运动起着重要的作用。由于韧带不可再生，一旦损伤，只能通过前交叉韧带重建进行治疗。传统的用于韧带修复的材料各有缺点，如材料获取难、生物相容性差，因此在临床应用中十分受限。而人工合成韧带因材料来源简单得到了广泛的研究与应用。为了避免单一合成高分子材料生物相容性差以及天然高分子力学性能有限的缺点，本实验中的人工韧带是以PLCL和不同含量的纤维蛋白原为原料，通过静电纺丝技术制备的纳米纤维膜。

之前的研究表明亲水性对于细胞在材料表面的黏附是相当重要的，材料的接触角越小表明亲水性越强，更有利于细胞在材料表面的黏附^[22]。本研究中接触角测试结果表明，P/F-Ns中纤维蛋白原的添加可显著改变材料的亲水性，并且随着纤维蛋白原的增加，亲水性逐渐增强。同时，细胞黏附实验中纤维蛋白原的增加确实更利于细胞在材料上的黏附。

纳米纤维的孔径和孔隙率在支架的细胞培养过程中起着至关重要的作用，较大的孔径和较高的孔隙率可以为细胞提供营养物质和代谢物质输送的通道^[23]。在本研究中，扫描电镜测试结果显示，添加了纤维蛋白原的P/F-Ns具有较高的孔隙率，并且随着纤维蛋白原含量的增加，孔隙率逐渐增大，更有利于细胞在P/F-Ns上的生长和增殖。纤维蛋白原是一种天然高分子材料，具有良好的生物相容性，因此含纤维蛋白原材料中细胞的吸光度值高于未添加纤维蛋白原的材料；但随着P/F-Ns中纤维蛋白原含量的增加，其力学性能逐渐下降，孔隙率逐渐增加，且纤维直径逐渐降低，可能影响细胞的黏附与增殖^[23]。因此，增殖实验结果显示细胞吸光度值随纤维蛋白原含量增加呈先增加后降低的趋势，P/F-N-2的细胞吸光度值最高。

Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原是构成韧带组织的主要组分，DECORIN和BIGLYCAN可以调控纤维的形成和组装^[24]。因此，在人工韧带修复过程中，细胞在P/F-Ns上的韧带组织相关基因的表达会反映韧带组织修复情况。韧带修复相关基因表达结果显示，3天和7天时，以P/F-N-0为对照，除个别组外，在P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3上细胞的COL1A1、COL1A3、BIGLYCAN和DECORIN的表达量整体均发生上调，表明含有纤维蛋白原的P/F-Ns能促进细胞韧带组织相关基因的表达，有利于韧带组织修复。

5. 结论

与P/F-N-0相比，P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3具有更好的生物相容性，更有利于细胞在组织支架上的黏附、生长和增殖，更有利于韧带修复，因此为其临床应用^[25-32]提供了安全性和功能性的理论依据。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：郭佳花进行了实验设计和论文撰写，张羽和陈丽媛进行了数据分析和图片润色，徐丽明、莫秀梅和陈亮提出研究思路、指导实验并修订论文初稿。

Funding Statement

中国科技部重点项目研发计划（2018YFC1106200，2018YFC1106201）；中央高校基本业务费专项基金（2232019A3-07）；上海市科委2019年度生物医药领域科技支撑项目（19441902600）；国家自然科学基金（31771023）