三维生物打印技术在泌尿系组织工程中的研究进展

Abstract

For the damage and loss of tissues and organs caused by urinary system diseases, the current clinical treatment methods have limitations. Tissue engineering provides a therapeutic method that can replace or regenerate damaged tissues and organs through the research of cells, biological scaffolds and biologically related molecules. As an emerging manufacturing technology, three-dimensional (3D) bioprinting technology can accurately control the biological materials carrying cells, which further promotes the development of tissue engineering. This article reviews the research progress and application of 3D bioprinting technology in tissue engineering of kidney, ureter, bladder, and urethra. Finally, the main current challenges and future prospects are discussed.

引言

临床上许多泌尿系疾病，如恶性肿瘤、外伤、先天性畸形和退行性疾病所导致的泌尿系组织器官的损伤，常用自体组织进行修复，但手术难度大、自体组织取材范围有限以及术后并发症的发生，大大降低了手术成功率和患者术后的生存质量。尤其是针对终末期器官衰竭患者，全球范围内器官短缺的现状无法满足每个患者器官移植的需求。于是，科研人员通过组织工程研究给患者提供了一种新的替代治疗方法。

近年来，组织工程得到迅速发展，但仍存在重建组织器官生物学功能有限、血管化网络建立不完善等问题。三维（three-dimensional，3D）生物打印技术作为一种新兴的制造技术，已经广泛运用于皮肤科、骨科、口腔科等组织工程领域^[1-3]。该技术的发展也给泌尿系统组织工程带来了新的希望。本文就3D生物打印技术在泌尿系组织工程的最新进展进行综述，讨论了需要解决的主要挑战，并对未来的发展进行了展望。

1. 3D生物打印技术

3D生物打印技术是基于计算机电子模型，将细胞、生物材料和生长因子逐层融合或沉积，精确打印出模仿天然组织或器官结构解剖功能的支架结构。相较于最初的手工构建，它能更加精确地制造出和原生组织器官的空间分布和结构一致的复杂结构，有利于实现组织器官的功能化，并且具有可重复性，在未来有大规模生产的潜能。

3D生物打印技术的研究和发展包含三个方面：① 生物打印策略；② 3D构图；③ 生物墨水。其中生物打印策略和生物墨水是实现组织器官再生的关键。常见的打印方式包括挤出式打印、喷墨式打印和光基础打印^[4-6]。

挤出式打印是通过施加气动或机械压力于打印头沉积生物墨水完成支架构建，是目前组织工程领域运用最为广泛的打印技术，其最大的优势在于可沉积高黏度和高细胞浓度的材料，即可选用的打印生物材料范围广泛。但由于挤出时产生的压力和剪切应力，此项打印技术很难兼顾生物打印速度、打印分辨率和细胞存活率这三方面的问题^[7]。科研人员尝试进行了技术上的优化，如Serex等^[8]开发了基于微流体的打印头，能够实时调节细胞浓度，完成高细胞浓度下的生物打印。悬浮打印技术是基于挤出打印的一项前沿技术。Lee等^[9]利用自由形式可逆嵌入悬浮水凝胶（freeform reversible embedding of suspended hydrogels，FRESH）技术，即用悬浮水凝胶作为打印支撑体介质，高精度地打印出了工程化人类心脏。此项技术打印出的结构因有支撑介质的存在不易坍塌，并且在实现全方向打印的基础上大幅提升了打印速度，为软材料或者低黏度流体的打印提供了新的平台。

喷墨式打印是将生物墨水以水滴形式通过喷嘴溢出打印，具有成本低、速度快等优点。但它无法打印高黏度（打印黏度限制在3.5～12 mPa·s）和高细胞浓度的材料，这就导致打印出来的支架机械强度不够，细胞密度低。

常见的光基础打印包括激光辅助打印（laser-assisted bioprinting，LAB）和立体光刻（stereolithography，SLA）。其中LAB是通过激光撞击区域产生的高压气体诱导生物墨水进入打印床上构建支架，其最大的优点就是不需要打印机头，这样就可避免因压力和剪切应力对细胞活力和功能造成影响，所以细胞存活率极高。相较于喷墨式打印，LAB能打印更高黏性的生物墨水（1～300 mPa·s）。但商业化打印设备的缺乏、成本高是此项技术有待解决的问题。Grigoryan等^[10]利用SLA技术构建了复杂血管化网络，使用可光聚合水凝胶完成血管内和多血管设计并打印出了可通气氧合的类肺结构。

上述三种技术各有其独特优势和局限性，在不同的应用场景如何正确运用这些技术取决于不同的生物墨水的制备^[7]。理想的生物墨水必须满足以下特点：① 可打印性；② 生物相容性；③ 生物可降解性；④ 良好的机械强度。常用的生物墨水一般包含有天然衍生聚合物，如胶原蛋白、明胶、壳聚糖等^[11-12]，以及合成聚合物，如聚己内酯（poly(ε-caprolactone)，PCL）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚（乳酸-共己内酯）（poly(lactide-co-caprolactone)，PLCL）等。科研人员常将多种材料复合出新型生物墨水为细胞附着繁殖、组织发育、宿主整合和血管化提供框架。除了以上提到的常见生物墨水材料外，脱细胞基质生物墨水由于含有大量有利于细胞生长和分化的因子，也广受科研人员关注，并开始在尿道、膀胱和肾脏组织工程中开展应用^[13-15]。

2. 3D生物打印技术在泌尿系组织工程中的研究

2.1. 在肾脏组织工程中的研究

肾脏作为一个高度复杂的实质器官，有着独特的发育过程和微观的空间构造，由30多种不同类型的高度分化的细胞组成。想要实现新肾脏的构建是一件十分困难的事情，需要将特定细胞类型、微管结构、血管化和生物材料进行整合来改善肾脏细胞的分离、扩增和分化，最终形成仿生肾脏。

有研究证实，人类多功能干细胞包含多种谱系，能模拟人类肾脏的生成，并且此种细胞向肾脏类器官样细胞的定向分化是稳健的、可再生的，可以在干细胞系之间转移^[16-17]。所以，肾脏类器官的研究是十分有前景的。3D生物打印最开始用于生产制造肾近端小管，Homan等^[18]采用3D生物打印技术打印出的小管结构完全嵌入细胞外基质中，并最终在微流体芯片上形成了可灌注的肾近端小管结构。然而，该方法存在着体外模型应用的局限性。Singh等^[19]在此基础上改进了生物墨水的策略，将去细胞肾脏外基质与海藻酸钠混合出新的生物墨水，并运用3D同轴打印技术制造了可灌注的肾近端小管和血管结构，观察到肾近端管状上皮细胞和人脐静脉内皮细胞成熟表达。另一项研究研发了全细胞的近端肾小管体外模型，包括肾成纤维细胞、内皮细胞和肾近端小管上皮细胞^[20]。3D生物打印技术完成了特定结构的设计，并增强了细胞间的直接接触，使间质细胞的结构性作用得到发挥。但大多数类器官都在静态环境培养，存在着类器官无血管且细胞发育不成熟的问题。3D打印微流控芯片在体外形成了流动培养类器官的环境，最终构建了肾脏类器官可灌注内腔血管网络^[21]。在后续研究中，Lin等^[22]创建了更优化的3D血管化的近端小管模型，该模型由邻近的导管组成，导管内衬近端小管上皮和血管内皮细胞，嵌入可渗透的细胞外基质中，并独立使用闭环灌注系统来研究肾脏的再吸收。

随着技术的进步，Lawlor等^[23]基于挤出工艺的3D生物打印技术研制了具有快速和高通量优点的肾脏类器官，此款类器官具备组成肾脏结构和功能的基本单位。研究人员还利用它评估了氨基糖苷的相对毒性，证实此款类器官用于药物检测的优越性。基于挤出工艺的3D生物打印技术能通过调控精确生物物理性能（类器官大小、细胞数量和显微结构构象）显著提高每个起始细胞的肾单位产量，产生均匀分化的功能性的肾脏组织结构。

2.2. 在输尿管组织工程中的研究

输尿管属于中空管状器官，长25～30 cm，直径3~ 4 mm，由四层组织结构组成：① 尿路上皮层（即尿路上皮细胞）；② 固有层：由疏松结缔组织、血管、静脉及淋巴管组成；③ 肌肉层：内纵肌层和外圆肌层两层（输尿管下1/3段有第3层肌肉层）；④ 外膜层：包含有血管、淋巴管。

一个理想的再生输尿管需要满足以下条件^[24]：① 保证不泄漏，并且能抵抗有毒环境（即与尿液的接触）；② 能再生功能性尿路上皮和平滑肌层，使其能承受流体剪切应力和径向压力（最大应力在1～10 MPa，破裂压力在500～550 mm Hg）；③ 能恢复重建段的蠕动波（弹性模量在1～10 MPa，抗拉强度在4～9 MPa）；④ 实现平滑肌细胞层的血管化和神经再生。

由于输尿管损伤一般需要立即处理，该领域内大多数研究围绕现成移植物制备展开，如羊膜、颊黏膜、膀胱黏膜下层基质等^[25]。尽管科研人员做了许多研究，但实验中仍有纤维化、梗阻和肾积水等不良结局的发生，并且存在高免疫原性、力学性能不足等问题^[26]。为了解决以上问题，一些天然材料和合成高分子材料被制作或改良出来，De Jonge等^[27]开发了增强的管状胶原-Viciryl支架，显示出尿路上皮再生、平滑肌向内生长和新血管形成。该团队^[28]还通过将管状胶原-Viciryl支架预植入羊模型，得出支架预植入这一方法能很好地预防纤维化和炎症的结论。具有良好机械强度和可调生物降解性的丝素蛋白材料也被证实适用于输尿管支架的构建^[29]。

Versteegden等^[30]运用星形芯棒原位固定、3D打印技术、化学交联技术等制备了一种具有径向弹性的管状胶原支架。此研究解决了管状胶原支架缺乏放射状可逆扩张能力的问题，拓宽了构建符合动态运动的中空组织器官的道路。

总的来说，输尿管的再生因受到临床需求、大型动物模型需求和植入手术难度的限制，此领域发展相对缓慢。未来输尿管组织工程可通过3D生物打印技术，将载有细胞和生长因子的材料在不同的空间分布上精确打印，从形状结构的模拟进阶到生理功能的模拟。

2.3. 在膀胱组织工程中的研究

膀胱是腹膜外的中空非管状器官，膀胱壁由四层组成：① 尿路上皮层：是多层的特化上皮，包括基底细胞、中间细胞和伞状细胞；② 固有层：由纤维状或束状胶原和弹性蛋白纤维网络组成，是含有神经和血管的结缔组织层；③ 肌层：逼尿肌层由内、中、外三层组成，内层和外层的肌肉细胞主要是纵向的，而中间层的细胞为周向，给予膀胱结构支持，促进膀胱充盈和排空的生理功能；④ 浆膜层：覆盖在外表面。

基于生物工程膀胱扩大和重建的研究日益增多，但大多是围绕膀胱支架补片的构建展开^[31]。Xiao等^[14]采用双层丝素蛋白支架和包裹有脂肪源性干细胞的膀胱脱细胞基质水凝胶构建出膀胱支架补片，用于大鼠膀胱扩大术模型。结果显示该支架材料能促进膀胱壁和生理功能恢复。但对于更大膀胱补片或者完整膀胱的构建仍需进一步探索，笔者认为FRESH技术的出现可用于悬垂的中空非管状器官的构建^[9]。

另外，文献中也提及相较于二维结构，3D支架结构显示出明显优势。Imamura等^[32]运用3D生物打印技术在微针阵列上插入由骨髓来源细胞组成的球体，最终构成自组织结构，然后植入辐射损伤膀胱的大鼠模型中进行体内实验，观察到移植的自组织结构存活下来。这种采用微球进行组装的构建体加强了细胞间的相互作用和氧气营养物质的扩散，并且具有更高的生物相容性。Bouhout等^[33]用胶原蛋白作为生物材料构建了简易的球形膀胱模型，包埋在支架内的膀胱间充质细胞和种植在支架表面的尿路上皮细胞因受到与天然组织相似的张力，显示出高度成熟的尿路上皮组织，并且表达肌球蛋白的平滑肌细胞呈现出平行于管腔表面重新排列的趋势。随着3D生物打印技术快速发展，其特有的优势在膀胱的修复再生领域拥有着巨大的潜力。

2.4. 在尿道组织工程中的研究

人类男性尿道长18～23 cm，女性尿道长2.5～5 cm，主要由三种细胞组成，包括尿路上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞。其生理结构上与输尿管相似，同样分为四层：① 黏膜层；② 黏膜下层；③ 肌层：内纵肌层和外圆肌层；④ 外膜层：结缔组织。相似的组织结构使其在重建方法上与输尿管具有一定的可参照性。已有许多研究人员从支架材料、种子细胞、生长因子等方面进行了探索^[34]。

3D生物打印技术在尿道组织工程的首次可行性尝试是Zhang等^[35]在体外利用PCL/PLCL聚合物打印出螺旋式结构模拟兔的天然尿道，并将含有膀胱平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs）、尿路上皮细胞（urethral epithelial cells，UCs）的纤维蛋白水凝胶印刷在螺旋结构两侧，给细胞提供良好的生长微环境。结果显示制造的仿生尿道拥有与兔尿道相似的力学性能，并且在打印后7天膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞仍保持超过80%的高活力。之后，科研人员开发了更多优化生物墨水策略。例如，张楷乐等^[36]在海藻酸钠水凝胶基础上使用纤维蛋白原水凝胶3D生物打印出尿道补片；Findrik Balogová等^[37]尝试将PLA和聚β-羟基丁酸两种材料共混挤压打印出用作尿道置换的管状替代物，并探讨了印刷所选工艺和印刷参数对打印过程的影响。这些生物墨水的开发，是为了更好地模拟尿道支架的物理特性，即具有一定的弹性和柔韧性来协调完成排尿功能，但关于人类尿道组织学、组成结构和力学性质的数据仍甚少。Cunnane等^[38]通过收集9名男性患者的前尿道样本，首次表征了人类男性前尿道的基本力学特性，讨论了其与组织和大体形态之间的联系，结果显示尿道组织具有黏弹性力学特性，没有方向性或区域性的差异，且与弹性蛋白和胶原蛋白含量有关（胶原蛋白∶弹性蛋白 ≈ 0.3∶1）。这一研究极大地填补了尿道组织工程在仿生学上的空缺，对于之后重建尿道具有重要的指导性意义。

在3D生物打印技术策略层面，为更好地打印出尿道多层环状生理结构，Pi等^[39]研发出一种多通道同轴挤压系统（multichannel coaxial extrusion system，MCCES），运用3D生物打印技术打印出多层管状支架，该系统的独特之处在于它能够在单个步骤中制备出多层可灌注的中空套管，并且在不需要改变打印喷嘴的情况下，可以连续改变形状和尺寸。随后，科研人员使用该系统将人尿路上皮细胞和人膀胱平滑肌细胞封装在定制的生物墨水中打印出了双层仿生尿路上皮组织结构（内层：尿路上皮层；外层：平滑肌层）。MCCES技术能构建具有灌注培养能力的多尺寸流道，在尿道组织工程领域具有广阔的应用前景。

尿道组织工程研究者也在尝试突破材料支架对传统组织工程的限制，例如一种无固体支架、无喷嘴和无标记的快速生物制造技术已被研发出来^[40]。它是采用磁声悬浮生物组装的原理，即强磁场和声场的组合能够在介质中的低顺磁性试剂（钆盐）浓度下从组织球体快速悬浮构建生物组织。目前已实现由人膀胱平滑肌细胞肌球构建3D尿道组织。另外，海绵体作为包绕尿道的海绵状组织，为尿道提供机械和血管支持，海绵体异常的患者同样也需要修复重建。Oh等^[41]结合3D生物打印技术在阴茎海绵体组织工程领域进行了初步探索。该研究将人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells，haSMCs）和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）植入到挤出打印的PCL阴茎海绵体支架上共培养，实验结果显示PCL支架所具有的高度规则的孔隙结构为人主动脉平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞的附着、增殖和分化提供了良好的环境，这种高精确度且可重复的制造技术为海绵体再生提供了新的发展视角。

3. 面临的主要挑战

3.1. 3D生物打印策略问题

生物打印速度慢这一问题在很大程度上阻碍了临床应用，集成多种材料的SLA技术有可能实现速度的提升^[42]。相对于原生组织器官而言，生物打印组织器官的分辨率较低这一问题也阻碍了3D生物打印的发展，笔者认为可以对四维生物打印策略进行深入研究探索，有望完全模拟出高复杂性且功能性强的仿生组织器官^[43]。

3.2. 力学性能问题

对于泌尿系组织工程来说，构建出与天然组织器官具有相似生物力学性能的仿生支架尤为重要^[44]。笔者认为应从仿生学的角度出发，通过体外实验和体内实验对原生组织进行标准化测试分析，如尿动力学实验、离体单轴或多轴机械实验等，来指导再生支架的构建。结合3D生物打印技术，需要对生物墨水进行优化来模拟天然组织，最常用作生物墨水的水凝胶材料可以通过添加纳米黏土、纤维素纳米纤维或是构建双网络水凝胶等方式来提升生物墨水的力学性能^[45]。

3.3. 血管化网络问题

血管不仅能运输氧气和营养物质，还能清除代谢产物。血管化网络的快速形成关乎支架的存活，也进一步影响到重建组织器官结构和功能的恢复。研究人员曾尝试采取大网膜包裹孵育移植物^[14]、加入外源性血管生长因子、缺氧预处理^[46]等方法来促进支架血管化，这些研究都起到了积极影响。但是大型移植物的血液供应仍是一大挑战。笔者认为3D生物打印技术可以通过计算机建模，预留出相互交通的血管微通道网络，并整合上述研究方法构建出发展成熟和灌注良好的血管网络^[47]。

3.4. 神经化网络问题

人体的储尿和排尿需要通过肌壁的收缩舒张来完成。如何实现器官的高顺应性，取决于平滑肌和神经纤维网络的再生和协同调控。笔者认为3D生物打印技术可加入像碳纳米管、还原氧化石墨烯等导电材料赋予生物墨水导电性，联合神经细胞、平滑肌细胞一同打印，构建出理想的神经化网络促进成熟平滑肌层的再生，进一步实现功能的恢复^[48-49]。

4. 讨论与展望

3D生物打印技术能精确控制组织构建物的空间分布和结构，有望在实现结构再现的基础上制造出功能化的组织器官。不同的生物墨水、打印方法和打印设备都影响着移植替代物的制备^[50]。目前，大多数3D生物打印策略还存在以下问题：① 如何提升打印的分辨率、精度和速度，并提高细胞存活率；② 如何加强打印支架的力学性能；③ 如何构建血管化网络；④ 如何构建神经化网络。未来还需在生物墨水和打印技术上深入研究，并确定适配于不同组织器官的印刷工艺和参数，给打印制造过程提供一个稳定的条件，做到过程的标准化，以保证可重复且安全地应用于临床。

总的来说，3D生物打印技术在组织工程领域是一项很有前景的技术，在泌尿外科组织工程中的应用尚处于初步探索阶段，加强跨学科跨专业之间的合作成为必然趋势，只有将生物工程学、材料科学、生物学、医学等学科相结合，才能完善对细胞选择、细胞功能优化、材料研发、再生过程及相关机制等的理解，最终解决存在的技术挑战，生产出受损组织器官的全功能替代品，以提高患者的生存和生活质量。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：符舟洋为综述主要撰写人，完成相关文献资料的收集和分析及论文初稿的写作；肖树伟负责文献调研及写作指导；符伟军为论文的负责人及主要审核人。

Funding Statement

国家自然科学基金（81873600）；北京市自然科学基金（7182154）；海南省重点研发计划社会发展专项课题（ZDYF2016119）；海南省自然科学基金（20158299）；海南省医药卫生重点科研项目（14A110062）；教育部留学回国人员科研启动基金

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