主动靶向载药脂质体在肿瘤治疗中的研究进展

Abstract

Liposome is an ideal drug carrier with many advantages such as excellent biocompatibility, non-immunogenicity, and easy functionalization, and has been used for the clinical treatment of many diseases including tumors. For the treatment of tumors, liposome has some passive targeting capability, but the passive targeting effect alone is very limited in improving the drug enrichment in tumor tissues, and active targeting is an effective strategy to improve the drug enrichment. Therefore, active targeting liposome drug-carriers have been extensively studied for decades. In this paper, we review the research progresses on active targeting liposome drug-carriers based on the specific binding of the carriers to the surface of tumor cells, and summarize the opportunities, challenges and future prospects in this field.

引言

肿瘤是当今威胁人类健康的重大疾病之一。令人鼓舞的是，近年来肿瘤治疗取得了令人瞩目的进步^[1]。其中，纳米药物载体的迅速发展为肿瘤治疗提供了新的方法和希望^[2]。在众多的纳米药物载体中，脂质体因具有良好的生物相容性、无毒、无免疫原性、表面易修饰等优点已成为最有前景的药物递送系统之一^[3]。1995年，负载抗肿瘤药物阿霉素的聚乙二醇化脂质体（doxil）经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准，成为第一个上市的纳米药物。doxil可以延长阿霉素在体内的循环时间，明显降低阿霉素对心脏的毒性，提高患者的生存率^[4]。此后，FDA批准了多个脂质体药物的临床研究。我国也批准了多种脂质体药物制剂的生产，比如注射用紫杉醇脂质体、盐酸多柔比星脂质体、注射用两性霉素B脂质体等^[5]。

脂质体是迄今为止临床应用最成功的纳米药物载体。脂质体本身具有一定的基于高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention，EPR）的被动靶向能力，但仅依靠脂质体的EPR效应，药物在肿瘤部位的富集率还是较低。因此，研究者将目光转向主动靶向，即通过药物载体与肿瘤细胞表面特异性结合，或药物载体特异性响应肿瘤微环境，来增加药物在肿瘤组织中的富集^[6]。本文总结了基于“药物载体与肿瘤细胞表面特异性结合”这一原理的主动靶向载药脂质体在肿瘤治疗中的研究进展，讨论和分析了该领域存在的困难和挑战，并对未来的研究方向进行了展望，以期为相关领域的研究提供基础知识和数据以及研究建议。

1. 脂质体药物载体简介

1.1. 脂质体的制备与药物负载方法

1965年，Bangham等^[7]首次报道了脂质体结构。如图1所示，脂质体是由磷脂双层组成的类似球形的囊泡，可分为单层脂质体、多层脂质体和多囊脂质体。传统的脂质体制备方法有超声分散法、薄膜水化法和溶剂注入法等。近年，许多新型的脂质体制备技术如微流控、超临界逆相蒸发等也逐渐成熟^[8]。采用不同的制备方法可以制备出不同尺寸、不同脂质层数、不同类型（单囊、多囊）的脂质体。

图 1.

Schematic structures of double-layer phospholipid membrane and liposome

磷脂双分子层和脂质体的结构示意图

将药物负载到脂质体内部一般采用主动载药方法，如pH梯度法、胺（铵）离子梯度法和细胞离子载体法。其中，胺（铵）离子梯度法具有操作简单、条件可控等优点，是目前采用最多的主动载药方法。

1.2. 载药脂质体的肿瘤靶向方式

药物载体靶向肿瘤的方式可分为被动靶向和主动靶向，如图2所示。被动靶向主要依赖EPR效应。正常组织中的血管内皮间隙致密、结构完整，载药纳米粒子不易透过血管壁；但大多数肿瘤组织中血管丰富、血管内皮间隙较宽、结构完整性差、淋巴回流缺失，使一定尺寸范围内的载药纳米粒子更容易透过血管壁，渗透进入肿瘤组织；同时，相对于小分子，载药纳米粒子在肿瘤组织中的滞留时间更长，从而使药物在肿瘤组织中富集，由此产生EPR效应。据报道，具有EPR效应的载药纳米粒子（比如脂质体）的尺寸一般在50～200 nm范围内^[9]。

图 2.

Tumor-targeting drug delivery: passive targeting (the EPR effect) and active targeting (receptor-mediated)

靶向肿瘤药物递送：被动靶向（EPR效应）和主动靶向（受体介导）

但近期研究表明，EPR效应被过高估计了，EPR效应在肿瘤治疗中的作用非常有限^[10]。于是，研究者将目光集中在主动靶向上，主动靶向药物递送系统成为了研究热点。主动靶向策略主要有两种：一种是通过药物载体与肿瘤细胞表面特定蛋白或受体特异性结合，另一种是基于药物载体在肿瘤组织微环境（比如酸性、乏氧及还原性等特性）中的响应。载药脂质体最常用的主动靶向策略是在脂质体表面修饰合适的配体（比如小分子、核酸适配体、活性多肽、抗体或其片段），这些配体可以与肿瘤细胞表面过度表达的特定蛋白或受体特异性结合，介导脂质体通过不同的内吞途径进入肿瘤细胞^[11]。

2. 主动靶向载药脂质体

通过在脂质体表面修饰能够和肿瘤细胞特异性结合的各种配体分子，并在脂质体内部负载药物，就得到具有主动靶向能力的载药脂质体。修饰后的脂质体可与靶标细胞特异性结合，使药物在肿瘤处富集，从而提高治疗效果，同时降低药物的总剂量和对正常组织的毒副作用。如表1所示，列举了部分靶向典型的肿瘤相关特异性靶标的载药脂质体的研发实例。

表 1. Active tumor-targeting liposomes at different research and development stages.

处于不同研发阶段的主动靶向肿瘤的载药脂质体

类别	靶向配体	靶标	治疗剂	病症	研发阶段	文献
小分子	叶酸	叶酸受体	阿霉素	结肠癌和肺癌	实验室	[12]
	表皮生长因子	表皮生长因子受体	阿霉素	人皮肤鳞癌	实验室	[13]
	叶酸	叶酸受体	阿霉素	乳腺癌	实验室	[14]
核酸适配体	AS1411	核仁素	紫杉醇和siRNA	乳腺癌	实验室	[15]
	AS1411	核仁素	5-氟尿嘧啶	皮肤癌	实验室	[16]
	sgc8	酪氨酸蛋白激酶7	长春新碱	急性T淋巴细胞白血病	实验室	[17]
活性多肽	GE11肽	表皮生长因子受体	白藜芦醇	鳞状细胞癌	实验室	[18]
	RGD肽	αvβ3整合素	阿霉素	胰腺癌	实验室	[19]
	R8肽	细胞膜	阿霉素	神经胶质瘤	实验室	[20]
抗体或其片段	西妥昔单抗	表皮生长因子受体	阿霉素	乳腺癌	实验室	[21]
	利妥昔单抗	表皮生长因子受体	长春新碱，苯达莫司汀	惰性B细胞，淋巴瘤	临床一期	[22]
	卡瑞珠单抗	血管内皮细胞生长因子受体	阿帕替尼	晚期食管鳞状癌	临床二期	[23]
	阿特利珠单抗	程序性死亡-配体1	紫杉醇，卡铂	上皮性卵巢肿瘤	临床三期	[24]
	帕博利珠单抗	表皮生长因子受体	紫杉醇	晚期食道癌	临床三期	[25]

2.1. 小分子修饰的脂质体

常用来修饰脂质体以实现主动靶向目的的小分子包括叶酸、亲合体、糖类等。

肿瘤细胞为了高速生长，在其表面会过量表达许多受体。叶酸受体就是一种在肿瘤细胞表面过度表达的受体。Nwahara等^[26]对比叶酸修饰前后的脂质体，发现修饰后的脂质体在缺氧的肿瘤微环境下显示出更高的抗肿瘤能力。亲和体是以葡萄球菌蛋白A为基础改造的小分子蛋白。最近有研究报道，亲和体修饰的脂质体在乳腺癌肿瘤模型中表现出优异的抗肿瘤效果^[13]。唾液酸是一类天然存在的糖类，多作为糖鞘脂和糖蛋白中的聚糖，一般存在于细胞膜上。Ding等^[27]研究发现唾液酸-十八烷基胺修饰后的载药脂质体具有优异的抗肿瘤能力和较低的毒副作用。

需要注意的是，小分子的活性在其被修饰到脂质体上的过程中容易受到影响；另外，修饰的小分子易被脂质体表面修饰的大分子（比如聚乙二醇）遮挡而难以发挥作用。因此，目前通过小分子修饰来增强载药脂质体的主动靶向能力的研究主要处于实验室阶段。

2.2. 核酸适配体修饰的脂质体

核酸适配体，又被称为“化学抗体”，是人工合成的较短的单链DNA或RNA寡核苷酸（通常为25～90个核苷酸碱基），具有高亲和力和特异性结合靶标的能力。

近年来，研究者尝试将各种不同的核酸适配体修饰在脂质体表面，以提高其主动靶向能力^[28]。Kang等^[29]将核酸适配体修饰到脂质体上，并利用负载的异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖证明了该脂质体能够特异性地靶向目标细胞。Nsairat等^[30]将特异性结合核仁素的核酸适配体作为靶向配体修饰到脂质体上并在脂质体中负载小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）用于治疗三阴性乳腺癌，实现了较好的抗肿瘤效果。

但是核酸适配体存在开发难度高、缺乏稳定构象等缺点，目前用其修饰脂质体的研究也主要处于实验室阶段。

2.3. 活性多肽修饰的脂质体

活性多肽在修饰脂质体方面具有独特的优势，如分子量小（约1 kDa）、组织穿透能力强、无免疫原性，易于生产等。活性多肽可以通过肽键、二硫键、硫脂键、硫烷基键等与脂质体共价结合。例如，细胞靶向肽，是由3～10个氨基酸组成的可以靶向肿瘤细胞并增强细胞内吞作用的短肽。含有精氨酸（Arg，R）-甘氨酸（Gly，G）-天冬氨酸（Asp，D）序列的直线肽或环肽（RGD肽），是一类特异性靶向整合素（α_Vβ₃）的配体，是第一个被发现的肿瘤细胞靶向肽。Cao等^[31]发现RGD肽修饰的脂质体在整合素高表达的细胞中具有较高的细胞摄取量，显著提高了载药脂质体的肿瘤治疗效果。除了RGD肽，Huang等^[32]将特异性靶向表皮生长因子受体的多肽GE11耦联到脂质体表面，成功制备了具有较好治疗效果的主动靶向载药脂质体。Zhou等^[33]利用肿瘤细胞表面过表达的受体，筛选出了一系列具有选择性和高亲和力的活性多肽配体，用于主动靶向。

不过，尽管部分活性多肽多年来已被大量研究，至今尚未有活性多肽修饰的脂质体成功上市。

2.4. 抗体或其片段修饰的脂质体

随着各种靶向肿瘤细胞的抗体成功上市，抗体或其片段也被广泛用来修饰脂质体，以提高脂质体的主动靶向能力。

由于抗体具有极高的特异性识别能力，抗体修饰的脂质体是目前最有希望的主动靶向载药脂质体。为了降低成本，同时避免较大的抗体在功能化过程中失活，很多研究采用抗体的抗原结合片段或单链可变片段来修饰脂质体。Cheng等^[34]将抗甲氧基聚乙二醇抗体片段和抗表皮生长因子受体-2的抗体片段共同修饰在聚乙二醇化脂质体表面，修饰后的脂质体显著提高了药物在肿瘤部位的积累。还有研究者将西妥昔单抗和多肽GE11同时修饰在脂质体表面，制备出了抗表皮生长因子受体的多功能热敏脂质体^[35]。

虽然已有抗体或其片段修饰的载药脂质体进入临床三期，但是抗体的抗原结合片段或单链可变片段在修饰过程中易失活的问题仍未解决。显然，更稳定的抗体或其片段是这类修饰的载药脂质体在临床上实现良好药效的关键。Yan等^[36]发展了一种构象工程技术，成功地将天然抗体的抗原互补决定区嫁接到纳米粒子上，制备出一类具有优异稳定性的人工纳米抗体。结合蛋白质折叠和设计的理论^[37-38]，利用这种构象工程技术，使用更小的抗体（或其他蛋白质）片段修饰脂质体，可能成为一种极具潜力的实现主动靶向的研究方向。

3. 临床实现主动靶向的困难与挑战

统计分析发现，多年来纳米药物在动物的肿瘤组织中的平均富集率一直在0.7%左右的低水平徘徊^[10]。虽然研究者已经将目光投向主动靶向的载药脂质体，但目前主动靶向的载药脂质体也仅有部分进入不同阶段的临床试验。事实上，至今尚无主动靶向的载药脂质体被批准上市。因此，实现纳米药物的主动靶向仍然存在巨大困难和挑战。

首先，在修饰脂质体的过程中，很多靶向配体易变性失活，无法保证其靶向功能的稳定性。同时，脂质体修饰后，药物载体的大小和表面电荷等性质的改变可能使其易被网状内皮系统吞噬，难以到达肿瘤细胞。

其次，细胞实验、动物实验和临床试验的结果之间存在巨大差异也是临床应用受限的重要原因^[39]。与体外细胞实验不同，主动靶向的载药脂质体进入体内后需要克服免疫系统、血液加速清除、肿瘤微环境的干扰等多重障碍。近年来，研究如何克服或规避肿瘤微环境（酸性，还原性等）的干扰，以及设计响应肿瘤微环境释放药物的靶向药物载体已成为一个研究热点^[40-41]。但人体体内环境比小动物更加复杂，动物实验结果与临床试验结果之间的偏差仍不能避免。很多主动靶向的载药脂质体在细胞实验上已被证明具有主动靶向性，在动物模型上也表现出较好的实验结果，但在临床试验中却以失败告终。这可能是由于动物模型上的实验无法反映人体晚期或转移性肿瘤的治疗效果。选择合适的动物模型或使用多个模型可以提高预测临床结果的准确性，但这也会导致动物实验结果转化为临床应用的过程变得更为复杂和困难。

另外，成本效益也是脂质体制剂开发应用不可忽视的问题。长久以来，药物递送系统的研究成本与成果产出一直处于严重失衡的状态。不止如此，甚至如何控制好药物递送系统的功能需求和其生产成本之间的平衡也会是一个成熟的药物递送系统能否诞生的一大挑战。

4. 总结与展望

目前，肿瘤药物治疗的最大问题是药物对正常组织的毒副作用大。药物递送系统的最大（潜在）优势是靶向给药，可以减少药物在非肿瘤组织中的浓度，从而降低毒副作用。基于EPR效应的被动靶向受到多种因素影响，效果不尽如人意，所以提高药物递送系统靶向性的出路在于提高主动靶向性。

实现主动靶向性目前最有效的靶向基团是抗体和抗体片段。无论是从降低成本，还是从减少功能基团体积，以及降低网状内皮系统吞噬和免疫原性等角度来看，通过构象工程技术，利用更小的蛋白质片段实现脂质体主动靶向性将是一个十分具有前景的方向。

现阶段纳米药物在动物的肿瘤组织中的平均富集率低于1%，从另一个角度看，说明纳米药物在肿瘤组织中的富集率仍有巨大的提升空间。在此基础上，只要药物在肿瘤组织中的富集率提高1%，就意味着可以降低几乎一半的药物用量，和降低一半左右的药物对正常组织的毒副作用，这对肿瘤治疗来说无疑是巨大的进步。尽管现在还存在多种困难和挑战，相信通过不断地改进和优化，主动靶向载药脂质体有望在不远的将来取得重大突破，从而给肿瘤患者带来福音。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：张曼玉撰写论文初稿，楼晨曦参与修改论文，曹傲能指导、修改和审校论文。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目(22071145, 31871007)；国家重点研发计划纳米专项课题(2016YFA0201602)

National Natural Science Foundation of China; Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China