四川牦牛心包与澳洲黄牛心包对比研究

Abstract

牛心包作为人工心脏生物瓣关键原材料目前基本依靠进口，已然成为“卡脖子”难题，严重限制了国产生物瓣研发效率，因此牛心包国产化迫在眉睫。本文以四川牦牛心包为样本，在基础性能及抗钙化性能方面与澳洲黄牛心包进行了对比研究，结果表明牦牛心包在外观及厚度方面更优，热皱缩性能、力学性能及抗钙化性能不弱于澳洲心包。本研究初步验证了四川牦牛心包替代澳洲黄牛心包的可行性，为牛心包国产化的推进提供了有力的数据支撑。

引言

心脏瓣膜病是一种常见心脏病，指人体心脏四个瓣膜发生病变，影响血流的正常流动，从而造成心脏功能异常，最终导致心力衰竭^[1-2]。人工心脏瓣膜置换是根治心脏瓣膜病的方法之一，目前介入生物瓣凭借着手术切口小、复原过程较快且出血少等优点开始取代外科瓣^[3-7]。

生物瓣主要由瓣叶、支架和瓣裙三大部分组成，其中瓣叶作为阀门控制着血流流动，其功能性直接影响着生物瓣的寿命。早期生物瓣的瓣叶材料使用的是猪心包或者猪心瓣，但在并发症发生率、死亡率、功能状态和血流动力学功能等对比中，研究者发现牛心包的综合性能更优，因此牛心包已经成为当今瓣叶材料的主要来源选择^[8-11]。

目前国内的生物瓣研发公司使用的牛心包均是从国外进口，主要源自澳大利亚和新西兰，这种进口供应链存在诸多问题，如价格昂贵、运输时效不可控、受环境及政策影响大等，极大地降低了国内企业的产品研发效率，因此牛心包原材料已然成为“卡脖子”难题。国内牛源丰富，牛心包国产化能降低研发成本、提高研发效率，是促进国产生物瓣产业高速发展的突破点，因此牛心包国产化已迫在眉睫。

实现牛心包国产化的任务之一是评价国产牛心包替代进口牛心包的可行性。目前关于国产牛心包的研究主要来自乐以伦教授团队，其团队以四川西部红原大草原养殖的牦牛为样本，对其心包进行了生化组成^[12-13]、免疫原性及免疫反应性^[14]、基础力学性能^[15-16]、纤维组织形态^[17]、组织结构^[18]、超微结构^[19]、酶成分^[20]等基础分析，并初步进行了应用研究，评价了牦牛心包经工艺处理后的力学性能及抗钙化性能^[21-25]，测试了基于牦牛心包制备的心脏瓣膜的流体动力学性能^[26]。虽然该团队的研究工作初步证明了牦牛心包具备作为生物瓣瓣叶的潜力，但与进口心包的对比研究较少，国产心包是否可以完全替代进口心包尚需更深入及全面的对比分析。

鉴于此，本文以四川牦牛心包为样本，与澳洲黄牛心包在多个重要指标上进行对比研究，重要指标包括了外观、微观结构、厚度、热皱缩性能、力学性能及抗钙化性能，这些指标常用于心包的基础及应用研究^[27-31]，本文期望通过对比研究进一步评价国产心包替代进口心包的可行性。

1. 材料与方法

1.1. 主要材料及仪器

新鲜四川牦牛心包（采集自四川西部红原大草原3 ~ 5岁牦牛），新鲜澳洲黄牛心包（来源于澳洲供应商Maverick公司2 ~ 3岁黄牛），戊二醛溶液（国药集团化学试剂有限公司，中国），D-Hanks溶液（内部自行配置），生理盐水（0.9% NaCl溶液，内部自行配置），无水乙醇（成都科隆化学品有限公司，中国）；胶原热形变分析仪（陕西科技大学阳光电子研究所，TMA-YD4，中国），场发射扫描电镜（Hitachi，S-4800，日本），单轴拉伸机（Instron，34SC-2，美国），三丰测厚仪（三丰量具，C112EXBS，日本）。

1.2. 新鲜心包处理

获取新鲜心包之后，去除表面多余的脂肪及结缔组织，随后依次进行裁剪、精洗、脱细胞、固定（0.6%的戊二醛溶液中固定7天）、抗钙化处理，每个测试项目根据需求在不同处理阶段获取样本。

1.3. 外观观察

随机取10片新鲜心包（原始心包，未经过任何处理），展开后观察心包颜色、表面脂肪残留、增生、血管等，并对心包外观进行拍照记录。

1.4. 厚度检测

随机取10片新鲜心包（脱细胞处理后，固定前），对心包进行定点测厚，测厚仪压杆下压后开始计时，读取10 s后的数据为厚度值，每个心包测量9个点，9个点的平均值为心包厚度值；心包固定处理后，用同样方法再次测厚并做记录，测厚点位与固定前测厚点位保持一致。

1.5. 微观结构观察

随机从新鲜心包片（脱细胞处理后）和固定心包片上裁剪出尺寸为1 cm × 1 cm的样品，每片样品依次经过30%、50%、70%、87%、95%、100%的乙醇脱水处理，其中30%、50%浓度各处理30 min，其余浓度处理1 h，处理完后保存在100%乙醇中。对脱水后的心包进行冷冻干燥，在10 mA电流下喷金90 s镀膜，随后利用场发射扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）拍摄心包表面形貌。

1.6. 力学性能测试

随机选取多片新鲜心包片（脱细胞处理后）及固定心包片进行力学测试，其中，断裂伸长率、拉伸强度、弹性模量按照QBT 2710-2018进行测试，样品尺寸为2 cm × 9 cm，设置平行样10个；撕裂强度按照QBT 4198-2011中试样尺寸（小号）进行制样并测试，设置平行样10个。

1.7. 热皱缩温度测试

随机挑选10片新鲜心包片（脱细胞处理后）及10片固定心包片，使用热皱缩制样工装对每片心包片进行取样（每条样条尺寸为3 mm × 50 mm），随后进行热皱缩测试，记录收缩温度。

1.8. 抗钙化性能评价

利用大鼠背部皮下植入方式进行抗钙化性能评价。大鼠选用3周龄的雄性Wistar，于四川医疗器械生物材料和制品检验中心内饲养和实验，许可证号：SYXK（川）2018-017。随机裁剪出固定心包片10片为对照组、抗钙化处理心包片10片为实验组，每片样品尺寸为1 cm × 1 cm。植入大鼠背部30天后对大鼠进行无痛处死，取出样品，去除表面多余的结缔组织之后进行钙含量测试。

1.9. 数据统计

本研究中所有数据表现形式为均值±标准差。显著性检验采用t检验或者双因素方差分析进行检验，检验水准为0.05。

2. 结果与讨论

2.1. 外观

新鲜心包外观照片如图1所示。图1a为新鲜四川牦牛心包外观照片，新鲜心包呈浅黄色，表面有少量脂肪残留，肉眼观察无明显血管和增生（见图1e）。图1b为新鲜澳洲黄牛心包外观照片，新鲜心包呈浅黄色，表面有脂肪残留。该类心包表面存在肉眼可见的血管及明显增生，且出现比例较高。如图1f所示，在10个心包中，有8个观察到了血管、5个观察到了增生，血管和增生示意图如图1c ~ d所示。

图 1.

Images of fresh pericardium with vascular and hyperplasia

新鲜心包照片及血管和增生情况

a. 新鲜四川牦牛心包外观照片；b. 新鲜澳洲黄牛心包外观照片；c. 典型的新鲜澳洲黄牛心包的血管（红色箭头标注）；d. 典型的新鲜澳洲黄牛心包的增生（红色虚线圆圈内）；e. 新鲜四川牦牛心包血管和增生统计；f. 新鲜澳洲黄牛心包血管和增生统计

a. image of fresh pericardium from Sichuan yak; b. image of fresh pericardium from Australian cattle; c. typical vessel (marked by red arrows) in fresh pericardium of Australian cattle; d. typical hyperplasia (marked by red circles) in fresh pericardium of Australian cattle; e. statistics of vascular and hyperplasia in fresh pericardium of Sichuan yak; f. statistics of vascular and hyperplasia in fresh pericardium of Australian cattle

瓣叶挑选要求极高，若表面有血管和增生会影响瓣膜产品血流动力学等性能，因此心包上的血管和增生部位需要在处理阶段裁剪掉。血管和增生的存在会降低心包可用面积，大大降低最终成品率，提高产品成本，从上述数据可以得出四川牦牛心包较澳洲黄牛心包更有优势，利用率更高。

2.2. 厚度

如图2所示，新鲜和固定后的四川牦牛心包厚度值分别为（0.282 ± 0.048）mm和（0.289 ± 0.061）mm，经过固定处理后的心包厚度略微增加，但差异无统计学意义；新鲜和固定后的澳洲黄牛心包厚度值分别为（0.374 ± 0.050）mm和（0.447 ± 0.059）mm，固定后心包厚度显著增大（P < 0.05）。

图 2.

Thickness of pericardium from Sichuan yak (n = 10) and Australian cattle (n = 10) (* stands for P < 0.05)

四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黄牛心包（n = 10）的厚 度数据（*表示P < 0.05）

在进行瓣叶挑选和匹配时，厚度是关键筛选条件之一，因此牛心包的厚度及处理过程中厚度的变化会影响最终成品率。从上述数据可以看出，四川牦牛心包较澳洲黄牛心包薄，同时固定前后厚度变化小，因此在厚度上牦牛心包更具优势，利用率更高。

2.3. 微观结构

心包的SEM照片如图3所示。图3a为新鲜四川牦牛心包表面照片，可以看出心包为致密型纤维结构，电镜拍照区域内纤维走向比较统一，并可以明显地观察到纤维束结构，纤维束之间有一定的空间。对固定后牦牛心包表面结构进行观察发现，其纤维走向也比较统一，但未观察到明显纤维束结构（见图3b）。出现这种现象可能是胶原纤维之间的弹性纤维、糖胺聚糖等成分在固定过程中的流失造成的，同时这些成分的流失也可能会使心包力学性能下降。

图 3.

SEM images of pericardium

心包的扫描电镜图

a. 新鲜四川牦牛心包；b. 固定四川牦牛心包；c. 新鲜澳洲黄牛心包；d. 固定澳洲黄牛心包

a. fresh pericardium rom Sichuan yak; b. fixed pericardium from Sichuan yak; c. fresh pericardium from Australian cattle; d. fixed pericardium from Australian cattle

图3c为新鲜澳洲黄牛心包表面SEM照片，与牦牛心包相比，澳洲黄牛的心包纤维结构较为松散，经戊二醛固定后，纤维走向比较统一，可观察到明显的纤维束结构（见图3d），表明胶原纤维之间发生明显交联作用。

2.4. 力学性能

如图4所示，新鲜四川牦牛心包断裂伸长率、拉伸强度、弹性模量、撕裂强度分别为（65.83 ± 23.26）%、（18.91 ± 6.71）MPa、（110.99 ± 35.92）MPa、（46.41 ± 10.13）N/mm。固定后的四川牦牛心包断裂伸长率、拉伸强度、弹性模量、撕裂强度则分别为（58.15 ± 25.84）%、（15.64 ± 4.62）MPa、（106.45 ± 43.54）MPa、（44.82 ± 11.96）N/mm。心包固定后各项力学性能均值有下降趋势，但差异均无统计学意义。

图 4.

Mechanical properties of pericardium from yak (n = 10) and Australian cattle (n = 10)

四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黄牛心包（n = 10）力学性能

新鲜澳洲黄牛心包断裂伸长率、拉伸强度、弹性模量、撕裂强度分别为（48.69 ± 10.47）%、（16.90 ± 5.59）MPa、（84.93 ± 25.30）MPa、（52.42 ± 25.22）N/mm。固定澳洲黄牛心包断裂伸长率、拉伸强度、弹性模量、撕裂强度分别为（40.43 ± 4.89）%、（20.43 ± 2.71）MPa、（98.78 ± 14.58）MPa、（54.65 ± 17.62）N/mm。澳洲黄牛心包固定后，除断裂伸长率以外，其余力学性能均值有上升趋势，但差异也没有统计学意义。

四川牦牛心包在固定后力学性能参数平均值有所降低的原因可能是因牦牛生长缓慢，3 ~ 5周岁的成熟牦牛心包纤维结构本身较为致密，固定后弹性纤维、糖胺聚糖等成分的流失对心包结构产生了影响，使得心包在力学参数上发生一定变化。澳洲黄牛生长速度较快，来源于2 ~ 3周岁黄牛的心包纤维结构与牦牛心包相比较为松散（如图3所示），经戊二醛固定后，与弹性纤维、糖胺聚糖等成分的流失相比，胶原纤维之间的交联对心包力学性能影响更大，因此部分力学性能参数呈现出上升的趋势。值得注意的是，固定过程虽然交联了胶原纤维，但并没有显著改变其相关力学强度。

2.5. 热皱缩温度

如图5所示，新鲜四川牦牛心包的热皱缩温度为（66.64 ± 0.23）℃，固定后牦牛心包的热皱缩温度为（85.06 ± 0.16）℃，固定心包相对于新鲜心包热皱缩温度提高了约18.4 ℃（P < 0.05），表明戊二醛交联处理提高了心包的热稳定性。同样，固定后澳洲黄牛心包的热皱缩温度也从（66.96 ± 0.37）℃ 提升至（84.77 ± 0.11）℃，固定心包相对于新鲜心包热皱缩温度提高了约17.8 ℃（P < 0.05）。

图 5.

Shrinkage temperature of pericardium from Sichuan yak (n = 10) and Australian cattle (n = 10) (* stands for P < 0.05)

四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黄牛心包（n = 10）热 皱缩温度（*表示P < 0.05）

热皱缩温度是心包处理过程的重要评价指标之一，代表其主要成分胶原蛋白的热稳定性。新鲜心包在经过交联固定等处理之后，其内部胶原蛋白之间或者胶原蛋白与交联剂之间发生键合，因此交联固定后的心包热皱缩温度会升高，热稳定性显著增强。对于四川牦牛心包与澳洲黄牛心包，无论是新鲜心包之间还是固定心包之间，热皱缩温度均值都非常接近，差异没有统计学意义。

2.6. 抗钙化性能

钙化是影响生物瓣使用寿命的主要原因之一，因此抗钙化性能是评价牛心包材料功能性的重要指标。图6为抗钙化工艺处理后心包片（实验组）及固定后心包片（对照组）在大鼠皮下植入30天后的钙含量数据。固定四川牦牛心包钙含量为（34.196 ± 39.719）μg/mg，均值低于固定澳洲黄牛心包钙含量即（74.580 ± 50.311）μg/mg，但差异无统计学意义。经抗钙化工艺处理后，两种心包钙含量均显著降低，其中四川牦牛心包钙含量为（1.01 ± 0.47）μg/mg（与处理前比较，P < 0.05），澳洲黄牛心包钙含量为（0.90 ± 0.37）μg/mg（与处理前比较，P < 0.05），但两种心包之间的差异无统计学意义。从数据中可以初步看出，在相同处理工艺下，四川牦牛心包抗钙化性能不弱于澳洲黄牛心包。

图 6.

Calcium content of pericardium (Sichuan yak, n = 10; Australian cattle, n = 10) after 30 days’ subcutaneous implantation in rat (* stands for P < 0.05)

四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黄牛心包（n = 10）大 鼠皮下植入30天后钙含量（*表示P < 0.05）

3. 总结与展望

本文通过对比研究发现，四川牦牛心包在外观和厚度方面有显著优势，同时抗钙化能力也不弱于澳洲黄牛心包，初步验证了国产替代可行性。当然，要实现对进口心包的完全替代，还需要进一步对国产心包展开更加全面和系统的评价研究，并完善相关溯源体系。相信随着国内法律法规逐步完善和生物材料学科的发展，国产牛心包的供应链体系会被进一步地规范，相应风险管理措施及评价体系亦将愈发完善，临床应用的可行性及安全性将会得到更强有力的保障。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：左一聪负责实验设计以及文章撰写，康珂负责数据收集、整理分析以及文章修改，尚大鹏协助了实验设计和数据整理工作，杨夏燕指导了课题的设计，吴尧指导了数据处理和文章修改工作，虞奇峰和温贤涛一起指导了研究设计、文章撰写和修改工作。

伦理声明：本研究动物实验通过了四川医疗器械生物材料和制品检验中心动物实验伦理审查。

Funding Statement

浦东区科技发展基金（PKX2019-S14）

The Technological Development Foundation of Pudong District