纳米银-二氧化钛填充树脂力学及光控抗菌性能研究

Abstract

The poor mechanical property and vulnerability to bacterial infections are the main problems in clinic for dental restoration resins. Based on this problem, the purpose of this study is to synthesize silver-titanium dioxide (Ag-TiO₂) nanoparticles with good photocatalytic properties, and add them to the composite resin to improve the mechanical properties and photocatalytic antibacterial capability of the resin. The microstructure and chemical composition of Ag-TiO₂ nanoparticles and composite resins were characterized. The results indicated that Ag existed in both metallic and silver oxide state in the Ag-TiO₂, and Ag-TiO₂ nanoparticles were uniformly dispersed in the resins. The results of mechanical experiments suggested that the mechanical properties of the composite resin were significantly improved due to the incorporation of Ag-TiO₂ nanoparticles. The antibacterial results indicated that the Ag-TiO₂ nanoparticle-filled composite resins exhibited excellent antibacterial activities under 660 nm light irradiation for 10 min due to the photocatalysis, and the Ag-TiO₂ nanoparticle-filled composite resins could also exhibit excellent antibacterial activities after contact with bacteria for 24 h without light irradiation because of the release of Ag ions. In summary, this study provides a new antibacterial idea for the field of dental composite resins.

引言

随着人们生活水平的不断提高，对于口腔卫生以及牙齿的美观愈加重视。自从20世纪60年代光固化树脂应用于牙科领域以来，各类修复树脂材料得到了广泛而深入的研究^[1-2]。目前，复合树脂临床应用主要存在两个问题: 一是机械性能较差，在使用过程中容易折断；二是不具有抗菌性能，在口腔中长期使用易使其表面堆积菌斑形成生物膜，进而引发龋病^[3-4] 。因此，通过填充纳米颗粒改善树脂力学性能，并赋予其优良抗菌活性对修复树脂临床应用具有重要意义^[5-7]。

二氧化钛（titanium dioxide，TiO₂）作为光催化材料，由于其化学性质稳定、无毒、成本低，被广泛应用于有机污染物分解、空气净化、消毒抗菌等领域^[8-9]。然而，纯TiO₂能隙较宽，仅在紫外光照射下才具有催化杀菌效果^[10]。研究表明，在TiO₂中掺杂少量银（argentum，Ag）即可减小带隙宽度^[11-12]，使其在可见光下具有优良杀菌性能。这是因为Ag的掺杂形成了肖特基势垒，可以促进电子从TiO₂向Ag纳米颗粒的转移，导致电子空穴对的分离以及表面等离子体效应^[13-15]，有效提高了TiO₂在可见光照射下的催化活性。此外，有文献报道TiO₂还可以减缓Ag离子的释放，从而降低材料生理毒性^[16]。

本文首先通过化学还原法制备了掺杂Ag的TiO₂（Ag-TiO₂）纳米颗粒，然后将其分散在树脂浆液中，用蓝光进行光照使其完全固化，制备了具有光控抗菌能力的Ag-TiO₂纳米颗粒填充复合树脂。虽然已有关于光辅助抗菌树脂的文献报道^[17]，但对复合树脂结构、广谱抗菌性能、光辅助抗菌机制及力学性能未进行深入研究。本文对所合成的复合树脂微观结构进行了详细表征，研究了Ag-TiO₂纳米颗粒含量对复合树脂在660 nm 可见光照下抗菌能力及力学性能的影响，阐明了其抗菌机制。这种无需额外的药物治疗，只需通过可见光照射就可起到杀菌抗菌功效的作用机制，在抗菌牙科填充树脂领域中极具临床应用潜力。

1. 材料与方法

1.1. 主要试剂

硝酸银（AgNO₃）、无水葡萄糖、氨水、纳米TiO₂（粒径<100 nm）、琼脂、无水乙醇均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；十二烷基苯磺酸钠（sodium dodecyl benzene sulfonate，SDBS），购于临沂绿森化工有限公司；双酚A甘油二酸酯二甲基丙烯酸酯（bisphenol—a diglycidyl methacrylate，Bis-GMA）、三（乙二醇）二甲基丙烯酸酯（triethylene glycol dimethacrylate，TEGDMA）、樟脑醌（camphorquinon，CQ）、4-二甲基氨基苯甲酸乙酯（ethyl 4-dimethylaminobenzoate，4-EDMAB）、溴乙啡锭二聚体、钙黄绿素，购于阿拉丁试剂有限公司；金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus，S.aureus）、大肠杆菌（escherichia coli，E.coli）和变形链球菌（staphylococcus mutans，S. mutans）由北京疾病预防中心提供；实验用水为自制去离子水（deionized water，DI）。

1.2. Ag-TiO₂纳米颗粒的制备

将5 g纳米TiO₂分散在200 mL DI中，加入1 g SDBS形成TiO₂浓度为25 g/L的悬浮液。将0.039 g AgNO₃溶解到10 mL DI中，然后加入1 mL氨水，形成银氨溶液。将银氨溶液加入到TiO₂悬浮液中，加入2 g葡萄糖作为还原剂分散到悬浮液中。在35 ℃下搅拌24 h，得到Ag-TiO₂悬浮液。离心得到沉淀物，用DI洗涤3次，70 ℃干燥4 h，得到Ag质量百分比为0.5%的Ag-TiO₂纳米颗粒。

1.3. Ag-TiO₂纳米颗粒填充复合树脂的制备

复合树脂糊剂由树脂基质和Ag-TiO₂纳米颗粒填料组成。树脂基质由单体混合物 Bis-GMA/TEGDMA（质量比为1∶1）、引发剂CQ（质量百分比为0.2%）和4-EDMAB（质量百分比为0.8%）组成。将Ag-TiO₂纳米颗粒加入到树脂基质中，并充分搅拌使其均匀分散到基体中。对于不同的实验测试需求，将复合树脂浆液倒入尺寸不同的模具中用蓝光固化即可。根据Ag-TiO₂含量的不同，制备的复合树脂分别为：不添加Ag-TiO₂纳米颗粒的纯树脂（设为纯树脂组）、Ag-TiO₂质量百分比为5%的复合树脂（设为Ag-TiO₂ 5%组）、Ag-TiO₂质量百分比为10%的复合树脂（设为Ag-TiO₂ 10%组）、Ag-TiO₂质量百分比为15%的复合树脂（设为Ag-TiO₂ 15%组）和Ag-TiO₂质量百分比为30%的复合树脂（设为Ag-TiO₂ 30%组）。另外，TiO₂质量百分比为15%的复合树脂作为对照（设为TiO₂ 15%组）。

1.4. Ag-TiO₂纳米颗粒的表征

通过透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）（JEM-2010，日本电子，日本）观察并分析纳米颗粒的形貌及结构。利用X射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD）（DX-2700，丹东方圆，中国）分析Ag-TiO₂纳米颗粒的相组成，在室温下20°～80 °范围内采集衍射图。采用X射线光电子能谱仪（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）（ESCALAB Xi⁺，赛默飞世尔，英国）分析纳米颗粒中Ag元素的化学价态。采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）（JSM-7001F，日本电子，日本）观察长条复合树脂（25 mm × 2 mm × 2 mm）截面形貌，并利用其附带的X射线能谱仪（energy dispersive spectrometer，EDS），（QX200，Bruker，德国）分析元素组成和分布，截面是从万能力学实验机（RGM-6005，深圳瑞格尔，中国）在三点弯曲实验后断裂的试样中选取的较为平整的断面。所有样品测试前用DI洗涤后干燥即可，不需要进行打磨处理，以免破坏材料表面结构及元素分布。

1.5. 复合树脂力学性能测试

复合树脂的弯曲强度（flexure stress，FS）（符号设为FS）、弯曲模量（flexural modulus，FM）（符号设为FM）和抗压强度（compre-ssive strength，CS）（符号设为CS）通过万能力学实验机测试。根据行业标准《牙科学 聚合物基修复材料》（YY 1042-2011）^[18]，每组制备了6个矩形样品（25 mm × 2 mm × 2 mm，n = 6），并在测试前存储在37 °C的水中。通过三点弯曲实验在20 mm跨度和0.8 mm/min十字头速度下测试样品。FS和FM的计算如式(1)、式(2)所示：

1

2

其中，F是破坏载荷，L是跨度长度，b是试样宽度，h是试样高度，F₁是直线部分最大载荷，d是载荷F₁下的挠度。准备6个圆柱形样品（4 mm × 6 mm，n = 6），在0.8 mm/min十字头速度下测试样品抗压强度。为进行维克斯显微硬度（Vickers-hardness，VM）测试，将方形试样（7 mm × 7 mm × 2 mm，n = 3）用600、1 200、2 000、3 000粒度的砂纸打磨，并用丝布进行抛光处理。将锡膏（250 nm金刚石悬浮液）涂在自动抛光机上（P20903，广东和力实业有限公司，中国）。操作显微硬度测试仪（HMAS-D30，上海盐润轻工技术有限公司，中国）用50 g载荷在10 s内测试样品，每个样品表面随机选择6个点进行检测。

1.6. 复合树脂光催化性能及抗菌性能测试

活性氧（reactive oxygen species，ROS）包括羟基自由基（·OH）和单线态氧（¹O₂）等。甲基紫（methyl violet，MV）可与·OH反应，1, 3-二苯基异苯并呋喃（1, 3-diphenylisobenzofuran，DPBF）可与¹O₂反应，采用MV和DPBF作为指示剂，通过紫外—可见分光光度计（UV-1800PC，上海美谱达，中国）测量580 nm和420 nm处峰强，可间接评价树脂产生·OH和¹O₂的量。将待测正方形片状试样（7 mm × 7 mm × 2 mm）置于24孔板中，将各组样品分别浸泡在2 mL的MV和DPBF溶液中静置25 min用于达到吸附平衡，测量光照前的光密度值（optical density，OD）（符号设为OD）。然后用660 nm（0.6 W/cm²）激光器进行20 min光照，每5 min用移液枪吸取待测溶液转移至石英比色皿中，通过紫外—可见分光光度计检测其在5、10、15、20 min的OD值。降解率计算公式(3)如下：

3

其中，OD_原为光照前溶液峰值，OD_后为光照后溶液峰值。

通过平板涂布和荧光活/死染色法评价复合树脂对S.aureus、E.coli和S. mutans的光控抗菌性能。在抗菌实验中，将测试样品（7 mm × 7 mm × 2 mm）纯树脂组、TiO₂ 15%组和Ag-TiO₂ 15%组，用75%酒精消毒，并用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤3次。具体步骤如下: 将所有样品分别置于24孔板中，每孔加入1 mL浓度为7 × 10⁶ CFU/mL的菌液。每种样本分为3组，分别在660 nm 可见光照射10、20 min后，取100 μL菌液，用PBS稀释100倍，将100 μL稀释后的溶液滴入琼脂板均匀涂布。最后，将每个琼脂平板在37 ℃下培养24 h，观察各样品的表面菌落数量。同时，利用吖啶橙（acridine orange，AO）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）荧光染色来进一步评价抗菌能力。光照后吸取树脂表面菌液，滴至盖玻片上。两种染色剂的浓度均为1 µL/mL，取 50 µL 的混合染色剂均匀滴在盖玻片的表面，并在室温下避光染色 20 min。样品经 PBS 漂洗并倒置放于载玻片上，随后用激光共聚焦显微镜（C2 Plus，Nikon，日本）随机选择3个视野采集图片。此外，采用上述平板培养法，测量无光照下，样品表面与细菌接触24 h后的抗菌能力。抗菌率R的计算如式(4)所示：

4

其中，β_control为对照组（纯树脂组）细菌数，β_sample为实验组（TiO₂ 15%组和Ag-TiO₂ 15%组）细菌数。

1.7. 复合树脂生物相容性测试

采用荧光活/死染色和噻唑蓝溴化四唑（3-(4, 5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-2,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）法对Ag-TiO₂ 15%组和Ag-TiO₂ 30%组的细胞毒性进行评价。首先将样品（7 mm × 7 mm × 2 mm）用75%的酒精消毒30 min，并用PBS冲洗3次放入24孔板中。每孔加入1 mL培养基，在37 ℃下孵育24 h，收集浸提液供进一步使用。然后，将1 mL密度为2 × 10⁴ 个/cm²的成骨细胞与浸提液混合，培养在圆形显微镜盖玻片1、3 d。对于荧光活/死染色，将样品用无菌PBS漂洗3次，然后在黑暗中用50 μL含2 μL/ mL溴乙啡锭二聚体和0.5 μL/ mL钙黄绿素的染色液在37 °C下染色30 min。利用激光共聚焦显微镜观察细胞活力和数量。对于MTT分析，将标本用PBS冲洗3次，转移至新的24孔板中，然后，立即将900 μL新鲜培养基和100 μL MTT溶液添加到每个孔中，并在37 °C下孵育4 h。随后加入1 mL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解样品表面紫色结晶。用酶标仪（Infinite F50，TECAN，瑞士）在492 nm下测量所得每种溶液的OD值。

1.8. 统计分析

所有实验均重复3次以上，数据均采用均数 ± 标准差的形式。采用单因素方差法在统计分析软件SPSS （26.0，IBM公司，美国）分析组间差异性。

2. 结果与讨论

2.1. Ag-TiO₂纳米颗粒的微观结构

如图1所示为合成的Ag-TiO₂纳米颗粒的微观结构。由SEM和TEM图可以看出，纳米颗粒尺寸均匀，粒径小于100 nm，实验结果与文献[19]报道一致。由高分辨率（high resolution，HR）-TEM（HR-TEM）图片可见，0.35 nm晶格间距对应于锐钛矿型TiO₂的（101）晶面，而0.23 nm和0.27 nm晶格间距分别对应于单质Ag和氧化银（Ag₂O）的（111）晶面^[20]，说明Ag-TiO₂纳米颗粒中Ag是以单质和氧化态两种形式存在。由TiO₂和Ag-TiO₂纳米颗粒的XRD图谱（横坐标的2θ是X射线的衍射角），可以看出两种纳米颗粒都是由锐钛矿相组成，A表示锐钛矿的特征峰。从Ag-TiO₂图谱中未发现含Ag相的峰，这可能是由于纳米颗粒中Ag含量较低，且在TiO₂中均匀分布所致^[21]。在Ag的高分辨XPS图谱中368 、374 eV两个结合能对应于单质Ag，而366、372 eV两个结合能对应于Ag₂O中的Ag⁺。XPS结果与HR-TEM结果一致。

图 1.

Microstructure of Ag-TiO₂ nanoparticles

Ag-TiO₂纳米颗粒的微观结构

2.2. 复合树脂的微观结构及亲水性

如图2所示为纯树脂组、Ag-TiO₂ 15%组和Ag-TiO₂ 30%组的复合树脂断面SEM照片。添加Ag-TiO₂纳米颗粒后，树脂表面出现大量纳米颗粒凸起物，且随着纳米颗粒含量增加，树脂中凸起物也逐渐增多。Ag-TiO₂ 15%组EDS结果表明，Ag、钛（Ti）、碳（C）及氧（O）元素均匀分布在树脂表面，说明纳米颗粒在树脂中均匀分散。接触角图显示，随着纳米颗粒含量增加，复合树脂的接触角逐渐减小，说明亲水性改善，当纳米颗粒含量从15%增加到30%时，亲水性不再变化。生物材料表面亲水性对细胞行为起着重要作用，良好的亲水性能使细胞更好地黏附，并且有助于成骨细胞分化等^[22]。对于牙科修复复合树脂材料，通过手术替换或修补坏牙的操作都会对周围正常的口腔组织细胞造成一定损伤，而本研究所制得的复合树脂亲水性高，有利于术后牙床细胞与修复体的重新贴合。

图 2.

SEM images of the cross-section of the composite resins, EDS element distribution map of the cross-section of composite resin with 15% Ag-TiO₂ and contact angles

复合树脂断面SEM图、Ag-TiO₂ 15%组复合树脂断面的EDS元素分布图、表面接触角

2.3. 复合树脂的力学性能

为了评价复合树脂的力学性能，本文中不同质量百分比Ag-TiO₂纳米颗粒填充复合树脂的FS、FM、CS和VM的结果如图3所示。当复合树脂中纳米颗粒含量小于15%时，随着含量的增加，复合树脂的力学性能和显微硬度逐渐提高。含量为15%时，力学性能最佳，FS、FM、CS和VM分别为99.57 MPa、3.42 GPa、341.29 MPa和31.38 HV，与纯树脂组相比分别提高了79.66%、73.60%、23.49%和76.39%。添加Ag-TiO₂纳米颗粒后力学性能改善，是因为纳米颗粒的比表面积较大，树脂基体与纳米颗粒的接触面积变大^[23]。当添加Ag-TiO₂纳米颗粒含量达到30%时，复合树脂力学性能下降，是由于纳米颗粒过多发生了团聚^[24] 。

图 3.

Mechanical property of composite resin with different content of Ag-TiO₂

复合树脂材料的力学性能

2.4. 复合树脂的光催化与抗菌性能

根据力学实验结果，选择综合性能优异的Ag-TiO₂ 15%组复合树脂进行光催化和抗菌性能测试。分别采用MV和DPBF检测复合树脂在660 nm 光照下产生·OH和¹O₂的能力，进而评价其光催化性能^[25-26]。如图4所示，随着光照时间的延长，MV和DPBF的降解量都逐渐增加，意味着产生的ROS逐渐增多，说明复合树脂在光照条件下具有优良的光催化性能。

图 4.

ROS generation of composite resin with 15% Ag-TiO₂ under 660 nm light irradiaition

660 nm光照射下Ag-TiO₂ 15%组复合树脂光催化性能

抗菌实验采用 S.aureus、E.coli和S. mutans作为测试菌种。S.aureus和E.coli分别是常见的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的典型代表，而S. mutans是引起龋齿的主要致病菌。先采用平板培养法评价复合树脂在660 nm光照下的抗菌性能，结果如图5所示。不含Ag的TiO₂ 15%组光照20 min后未展现出明显抗菌能力，Ag-TiO₂ 15%组在无光照下培养20 min对三种细菌也都没有显示出明显抗菌能力，说明短时间内Ag离子的释放量有限，未能起到抗菌效果。而Ag-TiO₂ 15%组光照10 min后对S.aureus、E.coli和S. mutans三种细菌就展现出了优良的抗菌能力，抗菌率分别是85.83%、94.23%和84.3%。光照20 min后，对三种细菌的抗菌率都达到99.99%，这是由于Ag-TiO₂ 15%组光照下具有优良的光催化作用，产生的大量ROS短时间内快速杀灭了细菌^[27-30]。

图 5.

Representative colony forming unit images and the corresponding antibacterial rate of composite resin with 15% Ag-TiO₂ under 660 nm light irradiaition

660 nm光照射下Ag-TiO₂ 15%组复合树脂表面抗菌效果图及对应抗菌率

采用荧光活/死染色法进一步评价了Ag-TiO₂ 15%组复合树脂光催化杀菌性能。如图6所示，光照20 min后，两组对照样品表面都被绿点覆盖，说明表面细菌都是活的，而Ag-TiO₂ 15%组表面只有少数绿点存在，表明光催化杀灭了大多数细菌。

图 6.

Fluorescence images of alive/dead bacteria on the surface of composite resin with 15% Ag-TiO₂ under 660 nm light irradiaition

660 nm 光照射下Ag-TiO₂ 15%组复合树脂表面细菌荧 光活/死照片

采用平板培养法对Ag-TiO₂ 15%组在无光照条件下24 h接触抗菌进行了测试，结果如图7所示。Ag-TiO₂ 15%组对三种细菌都展现了优良的抗菌能力，这是由于长时间接触后，复合树脂释放了大量Ag离子^[31-33]。

图 7.

Representative colony forming unit images and the corresponding antibacterial rate of composite resin with 15% Ag-TiO₂ after culturing for 24 h

Ag-TiO₂ 15%组复合树脂表面无光照射下细菌培养24 h抗菌效果图及对应抗菌率

综上所述，Ag-TiO₂ 15%组复合树脂在光照下短时间内可以快速杀菌，无光照下长时间接触也可有效杀灭黏附的细菌，这对临床上龋齿的预防和治疗具有积极作用。

2.5. 复合树脂的生物相容性

采用荧光活/死染色和MTT评价了Ag-TiO₂纳米颗粒填充复合树脂对成骨细胞的生物相容性。如图8所示，经过1 d培养，四组样品表面细胞活力和数量都没有明显区别。培养3 d之后，与其它三组相比，Ag-TiO₂ 30%组表面细胞数量明显较少，说明大量Ag离子的释放影响了成骨细胞增殖，而Ag-TiO₂ 15%组仍表现出良好的生物相容性，表明这组样品释放的Ag离子含量在细胞安全范围之内。此外，本课题组之前已经在光催化抗菌方面进行了大量研究，产生大量ROS时，会对细胞增殖产生一定抑制作用，但继续培养后，细胞能够恢复活力。且不同于植入体材料，本文研究的是用于修复牙齿龋坏的光固化填充复合树脂，材料接触更多的是牙齿，几乎不直接接触周围正常的口腔细胞，所产生的ROS也几乎不会损伤到口腔细胞^{[28, 34]}。

图 8.

Fluorescence images of osteoblasts on the samples after culturing for 1, 3 days and MTT assay results

成骨细胞在样品表面培养1、3 d后的荧光染色图和MTT分析结果

3. 结论

本文通过化学还原法制备了Ag-TiO₂纳米颗粒，并将其作为填料填充到复合树脂中，经光固化聚合反应合成了Ag-TiO₂纳米颗粒填充复合树脂。物相分析表明，本研究所制纳米颗粒在树脂中均匀分散，显著改善了树脂的亲水性能。力学实验和抗菌实验初步证实了Ag-TiO₂纳米颗粒填充复合树脂具有高效的光控抗菌能力和较好的力学性能，即当Ag-TiO₂纳米颗粒填料质量百分比为15%时，复合树脂的综合机械性能最佳；并在660 nm光照下展现出高效抗菌能力，在无光照条件下，随着时间延长，由于Ag离子的释放作用，复合树脂也具有接触抗菌能力；并且Ag-TiO₂ 15%组复合树脂具有良好的生物相容性。

研究基于纳米技术和光催化技术，尝试构建多功能纳米颗粒填料，对复合树脂进行改性以改善其抗菌和力学性能，制备综合性能优异的牙科复合树脂。经实验初步证实，制备的Ag-TiO₂纳米颗粒材料具有优异的理化性能，对复合树脂的力学性能、抗菌性能具有很好的改善作用，在牙科修复复合树脂领域具有潜在的应用前景，但仍有一定的不足，还需从以下方面开展进一步探索：尽管细胞实验也证明了Ag-TiO₂纳米颗粒填充复合树脂具有较好的生物相容性，但Ag离子的长期释放是否会对人体产生毒副作用及释放量是否在安全剂量之内，仍需大量研究进行分析与验证。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：潘世奇负责实验操作、分析与整理数据及论文撰写，李若玉和鲁舒心协助实验，张翔宇和陈维毅参与论文相关实验结果的分析及论文修改。

Funding Statement

国家自然科学基金（52171240）；中国博士后基金（2021M691992）

National Natural Science Foundation of China; Postdoctoral Science Foundation of China