Abstract
体外人类肝脏模型常用于药物筛选，而人原代肝细胞（PHH）是体外人类肝脏模型的金标准。细胞色素P450（CYP450）是PHH进行药物代谢的关键酶，其活性在PHH体外培养过程中迅速下降。本研究通过温度敏感型培养皿探究小鼠胚胎成纤维细胞3T3-J2形成细胞薄膜的条件，并基于细胞薄膜技术构建3T3-J2细胞薄膜/PHH/胶原凝胶“三明治”式三维（3D）共培养体系。通过苏木素-伊红染色和免疫荧光染色观察模型切面的组织结构和蛋白表达。以非那西丁和安非他酮为反应底物测定CYP450的活性，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定模型中白蛋白和尿素含量。结果显示，在细胞接种密度为1.5 × 106 个/皿（35 mm培养皿）且低温孵育时间为60 min的条件下，可以获得完整的3T3-J2细胞薄膜。通过细胞薄膜叠层，开发了一种体外三维肝脏模型。与二维模型相比，三维模型中的细胞—细胞、细胞—基质间连接紧密，CYP450超家族中的CYP1A2和CYP2B6活性显著提高，白蛋白和尿素分泌水平提高，均可稳定维持21 d。因此，细胞薄膜叠层有助于提高三维肝脏模型的肝功能水平，该模型有望在临床前用于预测低清除率药物的代谢情况，对药物评估等研究具有重要意义。
Keywords: 人原代肝细胞, 共培养, 成纤维细胞, 细胞薄膜, 细胞色素P450
Abstract
Primary human hepatocytes (PHH) are the gold standard of in vitro human liver model for drug screening. However, a problem of culturing PHH in vitro is the rapid decline of cytochrome P450 (CYP450) activity, which plays an important role in drug metabolism. In this study, thermo-responsive culture dishes were used to explore the conditions for murine embryonic 3T3-J2 fibroblasts to form cell sheet. Based on the cell sheet engineering technology, a three-dimensional (3D) “sandwich” co-culture system of 3T3-J2 cell sheet/PHH/collagen gel was constructed. The tissue structure and protein expression of the model section were observed by hematoxylin eosin staining and immunofluorescence staining respectively. Phenacetin and bupropion were used as substrates to determine the activity of CYP450. The contents of albumin and urea in the system were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that the complete 3T3-J2 cell sheet could be obtained when the cell seeding density was 1.5×106 /dish (35 mm dish) and the incubation time at low temperature was 60 min. Through cell sheet stacking, a 3D in vitro liver model was developed. Compared with the two-dimensional (2D) model, in the 3D model, the cell-cell and cell-matrix connections were tighter, the activities of cytochrome P450 CYP1A2 and cytochrome P450 CYP2B6 were significantly increased, and the secretion levels of albumin and urea were increased. These indexes could be maintained stably for 21 d. Therefore, cell sheet stacking is helpful to improve the level of liver function of 3D liver model. This model is expected to be used to predict the metabolism of low-clearance drugs in preclinical, which is of great significance for drug evaluation and other studies.
Keywords: Primary human hepatocyte, Co-culture, Fibroblast, Cell sheet, Cytochrome P450
引言
在药物开发过程中，人体药代动力学和处方剂量的预测为评估药物的安全性和有效性提供重要信息。人体内的药物代谢主要发生在肝脏，研究显示约70%的市售药物由肝脏负责代谢[1]。目前利用微粒体、肝细胞悬液等肝脏模型来预测药物内在清除率的研究已有报道[2-3]。但这些体外肝模型面临的关键问题是药物代谢酶的活性不足。例如，悬浮的肝细胞在体外只能培养4~6 h，这使得慢代谢药物难以利用该模型来预测其内在清除率[4]。
细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是药物代谢过程中的关键酶，其活性变化将直接影响药物的药效评价结果[5]。CYP1A2和CYP2B6是CYP450超家族的不同亚型，CYP1A2参与约5%临床药物代谢，主要包括芳香族化合物、硝基芳香化合物、杂环胺和霉菌毒素[6]；CYP2B6参与约8%临床药物代谢，其中包括抗抑郁药物安非他酮、抗艾滋病药物依法韦伦、抗癫痫药物普罗米那等[7]。近年来，低清除率药物由于具备使用剂量少、体内暴露量大、半衰期长等优点而得到广泛重视和发展[8]。但由于低清除率药物需要更长的药物代谢时间，这需要能长期维持CYP450活性的体外肝脏模型来对其进行准确评价。目前，用于构建体外肝脏模型的方法主要有“三明治”培养法、共培养法和灌流法等，这些模型都能在维持肝细胞形态和功能方面发挥重要作用，但在长期维持CYP450活性方面尚有不足[9-12]。
细胞薄膜技术是一种无支架的组织工程技术[13]，其核心是温度敏感型培养皿。温度敏感型培养皿表面涂有聚（N-异丙基丙烯酰胺）［poly（N-isopropylacrylamide），PIPAAm］，当温度低于32 ℃时，PIPAAm由疏水性变为亲水性，使培养皿上的细胞自行脱落，形成细胞薄膜[14]。细胞薄膜可以完整地保留细胞表面蛋白、基质蛋白和细胞连接，可更好地维持细胞功能并易于堆叠形成三维组织[15-16]。近年来，细胞薄膜技术已用于构建体外肝脏模型，如Kim等[17]将内皮细胞的细胞薄膜覆盖在大鼠原代肝细胞上，发现肝细胞在28 d内分泌的白蛋白维持在较高水平。
在前期的研究中将人原代肝细胞（primary human hepatocyte，PHH）与小鼠胚胎成纤维细胞3T3-J2置于温度敏感型培养皿上共培养，进而剥离形成PHH/3T3-J2共培养组织；该组织的CYP450活性较高，但其活性不能长期维持[18]。本研究基于细胞薄膜技术，将3T3-J2细胞薄膜覆盖在PHH上，发现CYP450的活性可长期保持在较高水平。因此，构建可长期维持CYP450活性的体外肝模型对探究慢代谢药物内在清除率和鉴定代谢产物具有重要意义。
1. 材料与方法
1.1. 实验材料
PHH购自美国赛默飞公司；3T3-J2细胞购自美国Kerafast公司；温度敏感型培养皿购自日本CellSeed公司；胎牛血清购自美国GE Healthcare公司；胰岛素/人转铁蛋白/亚硒酸混合液（insulin/human transferrin/selenous acid and linoleic acid，ITS）、胶原蛋白混悬液购自美国Corning公司；E-钙黏蛋白抗体（产品编号：ab40772）和胶原蛋白Ⅰ抗体（产品编号：ab21286）购自英国Abcam公司；苏木素-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色试剂盒（产品编号：C0105S）、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（产品编号：A0423）和Alexa Fluor 555驴抗兔IgG（产品编号：A0453）购自碧云天生物科技有限公司；0.4%台盼蓝、地塞米松、胰高血糖素、非那西丁（phenacetin，PHE）和安非他酮（bupropion，BP）购自美国Sigma Aldrich公司；人白蛋白酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒和人尿素ELISA试剂盒购自美国Bethyl Laboratories公司；低温培养箱FCI-280HG （As one，日本）；液相色谱-质谱联用仪UPLC-MS/MS（Waters，美国）；酶标仪Spark 20M（Tecan，瑞士）；色谱柱ZORBAX SB-C18 (Agilent，美国)。
1.2. PHH存活率计算
本研究对冻存的PHH进行解冻和计算，评估PHH的存活率。将0.4%台盼蓝和磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（1 ×）1∶4混合，制备成台盼蓝稀释液。来回轻摇已解冻的PHH细胞悬液，将台盼蓝稀释液和PHH细胞悬液1:1混合，静置1 min，最终台盼蓝稀释液工作浓度为0.04%。吸取10 μL上述混合液至血细胞计数板上，计算活细胞与死细胞数量。显微镜视野中活细胞呈黄色或轮廓清晰，死细胞呈蓝色。最后算得PHH存活率在90%以上。将剩余的PHH用于后续的三维（three dimensional，3D）共培养体系和二维（two dimensional，2D）单培养体系构建。
1.3. 成纤维细胞的培养和细胞薄膜的收获
本课题组为成功收获3T3-J2细胞薄膜，从细胞接种密度和低温孵育时间两方面探究3T3-J2细胞形成细胞薄膜的条件。在35 mm温度敏感型培养皿上接种细胞，接种密度分别为0.5 × 106、1.0 × 106、1.5×106 个/皿。使用含10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖型杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培养3T3-J2细胞，置于37 ℃、5%的CO2培养箱。培养4 d后，将3种不同接种密度的细胞分别置于20 ℃低温培养箱30 min和60 min，观察细胞脱壁程度，收集细胞薄膜。
1.4. 3D共培养体系的构建
本课题组为构建3D共培养体系，首先将硅胶环附着在35 mm普通细胞培养皿中央，如图1步骤A所示，构建出一个面积为2 cm2的圆形区域。依据说明书方法配置胶原蛋白混悬液，如图1步骤B所示，将300 μL混悬液涂抹在硅胶环内圆区域，37 ℃孵育1 h，使胶原蛋白凝胶化。如图1步骤C所示，随后在胶原蛋白凝胶上接种PHH，细胞密度为0.2×106 个/皿，加入肝细胞专用培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h。如图1步骤D所示，移除硅胶环，在PHH上覆盖3T3-J2细胞薄膜，形成“三明治”式共培养组织，从下往上分别由胶原蛋白凝胶、PHH和3T3-J2细胞薄膜组成。不加入任何培养基，将该共培养组织置于37 ℃、5% CO2培养箱内孵育30 min，使3T3-J2细胞薄膜黏附在PHH上。如图1步骤E所示，往培养皿中加入肝细胞专用培养液，形成3T3-J2细胞薄膜/PHH/胶原蛋白凝胶3D共培养体系。所述专用培养液包括DMEM高糖培养基、0.1 μmol/L地塞米松、1% ITS、0.2 μmol/L胰高血糖素、10%胎牛血清和1%青链霉素。每2 d换液1次，共培养21 d。
图 1.
Construction of 3D co-culture system
3D共培养体系的构建
将没有3T3-J2细胞薄膜覆盖的PHH/胶原蛋白凝胶2D单培养体系作为对照组，其它培养条件和构建方法与3D共培养体系一致。
1.5. HE染色
在培养21 d后，用4%多聚甲醛固定3D共培养体系和2D单培养体系，室温固定1 h。随后分别用石蜡包埋，切成4 μm切片，脱蜡后进行HE染色。最后，封装干燥并用光学显微镜观察。
1.6. 免疫荧光染色
经石蜡切片，3D共培养体系和2D单培养体系的切片组织在脱蜡后分别用一抗孵育，所用一抗有E-钙黏蛋白抗体和胶原蛋白Ⅰ抗体，稀释比例为分别为1∶500和1∶250。采用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 555驴抗兔IgG作为二抗进行荧光染色，稀释比例为1∶500。细胞核用4’, 6-二氨基-2-苯吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色。最后将切片固定、干燥，并用荧光显微镜观察。
1.7. CYP450酶活性
在培养的第2、5、7、14、21 d，用PBS和DMEM高糖培养基冲洗3D共培养体系和2D单培养体系。将含100 μmol/L PHE和200 μmol/L BF的DMEM高糖培养基添加到3D共培养体系和2D单培养体系中。PHE和BP分别是CYP1A2和CYP2B6的底物。PHH吸收并代谢PHE和BP后，将其代谢物释放到培养基中，代谢产物分别是对乙酰氨基酚和羟基安非他酮。37 ℃孵育10 min，收集20 μL上清液。通过液相色谱-质谱联用仪测定上清液中两种代谢产物的含量。以代谢产物的生成速率来反映3D共培养体系和2D单培养体系PHH的CYP450代谢活性。
液相色谱-质谱联用仪在电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）正离子模式下，检测PHE和BP的生成量。采用色谱柱（3.0 mm × 100 mm，1.8 μm）对上清液进行液相分离，流动相A/B：乙腈（0.1%甲酸）/水（0.1%甲酸）；流速0.3 mL/min；洗脱时间6 min；进样量5 μL。质谱条件：离子源温度为500 ℃；喷雾电压5 500 kV；碰撞气压0.082 74 Mpa；气帘气压力0.137 90 Mpa；离子源气体一0.413 70 Mpa；离子源气体二0.137 90 Mpa。产物的生成速率计算公式如式(1)所示：
 |
1 |
1.8. 白蛋白和尿素含量的测定
分别在培养的第2、5、7、14、21 d收集细胞上清液，用于检测白蛋白和尿素含量，检测前置于−30 ℃冰箱储存。使用人白蛋白ELISA试剂盒和人尿素ELISA试剂盒检测白蛋白和尿素分泌量，分别进行3次独立实验，每组设置3个复孔。实验操作依据试剂盒说明书进行，反应后通过酶标仪记录光密度（optical density，OD）值，其中白蛋白吸收波长为450 nm，尿素吸收波长为430 nm。按照说明书计算临界值，OD值 ≥ 临界值，判断为阳性，反之判断为阴性。
1.9. 统计分析
结果以均数±标准差表示，采用独立样本t检验（双侧）进行统计学分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 3T3-J2细胞薄膜的制备
根据不同的低温孵育时间，将培养的3T3-J2细胞分为两组，组1：低温孵育30 min；组2：低温孵育60 min。结果如图2所示，在组1中，种植密度为0.5 × 106、1.0 × 106、1.5 × 106 个/皿的3T3-J2细胞均不能形成完整的细胞薄膜。在组2中，种植密度为1.5 × 106 个/皿的3T3-J2细胞可以形成完整的细胞薄膜；种植密度为1.0 × 106 个/皿的3T3-J2细胞形成的细胞薄膜有一定破损，韧性差；0.5 × 106 个/皿的3T3-J2细胞不能形成完整的细胞薄膜，极易破碎。因此，确认细胞播种密度为1.5 × 106 个/皿、低温孵育时间60 min是制作3T3-J2细胞薄膜的最佳条件，并将该方法用于后续实验，以收获3T3-J2细胞薄膜构建3D共培养体系模型。
图 2.
Effects of different seeding densities and low-temperature incubation time on cell sheet harvesting
不同的接种密度和低温孵育时间对收获细胞薄膜的影响
2.2. 3D共培养体系的制备
经石蜡包埋、切片、HE染色后，3D共培养体系和2D单培养体系截面的组织形态如图3所示。3D共培养体系，从下往上分别由胶原蛋白凝胶、PHH和3T3-J2细胞薄膜组成，利用光学显微镜观察发现PHH在胶原蛋白凝胶上形成小的细胞团，并被致密的3T3-J2细胞薄膜覆盖。2D单培养体系，从下往上分别由胶原蛋白凝胶和PHH组成，PHH在胶原凝胶上同样形成细胞团。对3D共培养体系和2D单培养体系的E-钙黏蛋白和胶原蛋白Ⅰ进行免疫荧光标记，其中Alexa Fluor 488标记E-钙黏蛋白（绿色），Alexa Fluor 555标记胶原蛋白Ⅰ（红色），DAPI标记细胞核（蓝色）。如图4所示，3D共培养体系显示出清晰的分层结构，表层富含由3T3-J2细胞产生的胶原蛋白Ⅰ，PHH在胶原蛋白凝胶和3T3-J2细胞薄膜之间形成细胞团；2D单培养体系也清晰地显示出PHH细胞团；这与HE染色结果一致。此外，E-钙黏蛋白在PHH细胞团中高表达，表明PHH之间连接紧密。
图 3.
The cross-sectional tissue morphologies of 3D co-culture system and 2D mono-culture system (HE staining)
3D共培养体系和2D单培养体系截面的组织形态（HE染色）
图 4.
Immunofluorescence staining of cross sections of 3D co-culture system and 2D mono-culture system
3D共培养体系和2D单培养体系截面的免疫荧光染色
2.3. 3D共培养体系可增加并长期维持CYP450的活性
为验证3D共培养体系和2D单培养体系的CYP450活性，本研究通过3次独立实验，分别测定两种体系中CYP1A2 和CYP2B6的活性，其中CYP1A2催化PHE产生对乙酰氨基酚，CYP2B6催化BP产生羟基安非他酮。结果如图5所示，在2D单培养体系中，随着时间的推移，对乙酰氨基酚的生成速率缓慢上升，在第21 d达到峰值；羟基安非他酮的生成速率在初期随时间推移逐渐上升，在第7 d达到峰值，随后下降。3D共培养体系中对乙酰氨基酚和羟基安非他酮的生成速率趋势与2D单培养体系相似，但其生成速率显著高于2D单培养体系。代谢产物的生成速率反映CYP450酶代谢活性，CYP1A2 和CYP2B6在3D共培养体系中活性显著高于2D单培养体系。此外，在第21 d，3D共培养体系的CYP1A2和CYP2B6活性仍维持在较高水平。
图 5.
Comparison of drug metabolism by hepatocytes between 3D co-culture system and 2D mono-culture system
3D共培养体系和2D单培养体系的肝细胞药物代谢功能比较
*P < 0.05
*P < 0.05
2.4. 3D共培养体系可增加并长期维持白蛋白和尿素水平
为进一步验证3D共培养体系的优越性，本研究通过人白蛋白ELISA试剂盒和人尿素ELISA试剂盒测定体系中白蛋白和尿素含量。结果如图6所示，3D共培养体系相对于2D单培养体系可大幅提高白蛋白和尿素产量；在第21 d白蛋白产量是2D单培养体系的3.75倍，尿素产量是2D单培养体系的2.70倍。第21 d发现2D单培养体系的白蛋白与尿素产量下降，而3D共培养体系仍能维持白蛋白与尿素的释放水平，因此该结果进一步证明3D共培养体系在提高并维持PHH肝功能上的重要性。
图 6.
Comparison of albumin and urea contents between 3D co-culture system and 2D mono-culture system
3D共培养体系和2D单培养体系的白蛋白和尿素含量比较
*P < 0.05
*P < 0.05
3. 讨论
3T3-J2细胞是由小鼠胚胎来源的3T3成纤维细胞经过射线处理之后得到的一种新型细胞，容易获得且不易被活化。据前人研究发现，3T3-J2细胞可分泌肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子等多种生长因子[19-20]，可在不依赖于肝非实质细胞的情况下稳定肝细胞表型，这其中还可能与N-钙黏蛋白的介导有关[10]。因此，3T3-J2细胞被证实是构建肝细胞正常模型的关键细胞[21]，可为长期研究肝细胞及肝细胞与肝非实质细胞的相互作用提供有利条件[22]。但是，与普通的3T3细胞相比，3T3-J2细胞增殖缓慢，产生细胞外基质较少，不易形成细胞薄膜，且细胞薄膜韧性较差。低温孵育30 min后对细胞薄膜进行剥离，发现边缘处仍有部分区域与培养皿紧密贴壁，导致细胞薄膜破裂，据此推测30 min不能使所有细胞彻底脱壁。因此，本研究将孵育时间延长到60 min，发现细胞薄膜剥离较为顺利，说明延长低温孵育时间可使细胞彻底脱壁，从而获得形态完整的细胞薄膜。
Kim等[17]使用具有明胶涂层的类似于“邮戳”的操纵器来转移细胞薄膜，将之覆盖在大鼠原代肝细胞上。但是在本课题组初步的研究中发现，PHH对培养条件的要求比大鼠原代肝细胞更高，细胞薄膜操作器带来的物理压力会降低PHH的活性。因此，本研究使用移液管转移细胞薄膜[23]，以减少细胞薄膜在叠层过程对PHH的损伤。
整体培养体系样本的肝功能受PHH存活率以及单个PHH的肝功能影响，而PHH体外培养时存活率只会下降，不会提高。依结果来看，3D共培养体系在培养过程中肝功能大幅度提高，其中白蛋白倍增指数（峰值与初始值之比）5.57，尿素倍增指数2.03，CYP1A2倍增指数12.27，CYP2B6倍增指数7.36。因此，肝功能指标大幅度提高说明了3D共培养体系可有效增加单个细胞的肝功能水平。相较于传统的肝细胞培养模型，基于细胞薄膜的共培养体系具有更为丰富的细胞和细胞外基质。大量的成纤维细胞被压缩、整合到3D共培养体系中，增加细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互作用，可产生高浓度的生长因子。因此本课题组认为这为肝细胞的生存和功能维持提供了有利条件。Kukla等[24]将3T3-J2细胞包裹在PHH外部形成一个三维立体模型，相较于其他类型的包被细胞，3T3-J2细胞包被的PHH也表现出更高的肝功能水平，这与本研究结果相印证。
根据对乙酰氨基酚和羟基安非他酮的生成速率结果可以看出，3D共培养体系显著提高CYP1A2和CYP2B6的活性，体现了细胞薄膜叠层的重要性。此外，在培养的第21 d，3D共培养体系中的CYP1A2和CYP2B6活性仍维持在较高水平，这对慢代谢药物的评价具有重要意义。
4. 结论
本研究建立了一个基于细胞薄膜的3D共培养体系—3T3-J2细胞薄膜/PHH/胶原蛋白凝胶。该3D共培养体系相较于2D单培养体系可显著提高CYP450酶活性以及白蛋白和尿素的分泌水平，反映出该体系的肝功能指标得到大幅度提高，且可稳定维持21 d。因此，该3D共培养体系有望在未来用于预测慢代谢药物的内在清除率，对药物代谢等相关研究具有重要意义。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：高博韬主要负责项目主持、协调沟通、实验设计以及论文审阅修订；关淑文主要负责实验流程、数据记录与分析以及论文撰写；肖将尉主要负责实验指导、数据分析指导。
Funding Statement
广东省科学院“百人计划”引进专项资金项目（2020GDASYL-20200102005）；广东省基础与应用基础研究基金项目（2020A1515110054）；中国博士后科学基金面上资助项目（2021M690746）；广东省重点领域研发计划项目（2020B1111560001）
Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation; China Postdoctoral Science Foundation; Department of Science and Technology of Guangdong Province
References
- 1.Wienkers L C, Heath T G Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat Rev Drug Discov. 2005;4(10):825–833. doi: 10.1038/nrd1851. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Obach R S Predicting clearance in humans from in vitro data. Curr Top Med Chem. 2011;11(4):334–339. doi: 10.2174/156802611794480873. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Houston J B Utility of in vitro drug metabolism data in predicting in vivo metabolic clearance. Biochem Pharmacol. 1994;47(9):1469–1479. doi: 10.1016/0006-2952(94)90520-7. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Smith C M, Nolan C K, Edwards M A, et al A comprehensive evaluation of metabolic activity and intrinsic clearance in suspensions and monolayer cultures of cryopreserved primary human hepatocytes. J Pharm Sci. 2012;101(10):3989–4002. doi: 10.1002/jps.23262. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.孙英辉, 慈小燕, 李薇, 等 应用人肝细胞研究人参皂苷Rb_1和Rg_1、丹参素钠、冰片对CYP450药物代谢酶1A2、2B6和3A4的体外诱导作用. 药物评价研究. 2021;44(1):38–44. [Google Scholar]
- 6.董航, 张海晖, 窦桂芳, 等 γ射线辐射对大鼠肝药物代谢酶CYP1A2,CYP2C9和CYP2D6蛋白表达及药物代谢活性的影响. 中国药理学与毒理学杂志. 2021;35(4):290–296. doi: 10.3867/j.issn.1000-3002.2021.04.007. [DOI] [Google Scholar]
- 7.徐聪, 徐思云, 胡海红, 等 CYP2B6体外诱导活性评价模型的建立及其在中药活性成分筛选的应用. 药学学报. 2013;48(1):119–124. [Google Scholar]
- 8.Di L, Obach R S Addressing the challenges of low clearance in drug research. AAPS J. 2015;17(2):352–357. doi: 10.1208/s12248-014-9691-7. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.阮婷婷, 鞠武建, 熊海伟, 等 低清除率药物的代谢稳定性预测模型研究进展. 中国药科大学学报. 2019;50(2):152–160. doi: 10.11665/j.issn.1000-5048.20190204. [DOI] [Google Scholar]
- 10.Khetani S R, Szulgit G, Del Rio J A, et al Exploring interactions between rat hepatocytes and nonparenchymal cells using gene expression profiling. Hepatology. 2004;40(3):545–554. doi: 10.1002/hep.20351. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Gu J, Shi X, Zhang Y, et al Establishment of a three-dimensional co-culture system by porcine hepatocytes and bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Hepatol Res. 2009;39(4):398–407. doi: 10.1111/j.1872-034X.2008.00472.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Thomas R J, Bhandari R, Barrett D A, et al The effect of three-dimensional co-culture of hepatocytes and hepatic stellate cells on key hepatocyte functions in vitro. Cells Tissues Organs. 2005;181(2):67–79. doi: 10.1159/000091096. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Haraguchi Y, Shimizu T, Yamato M, et al Scaffold-free tissue engineering using cell sheet technology. Chem Inform. 2012;2(6):2184–2190. [Google Scholar]
- 14.Kobayashi J, Kikuchi A, Aoyagi T, et al Cell sheet tissue engineering: cell sheet preparation, harvesting/manipulation, and transplantation. J Biomed Mater Res A. 2019;107(5):955–967. doi: 10.1002/jbm.a.36627. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Yang J, Yamato M, Kohno C, et al Cell sheet engineering: recreating tissues without biodegradable scaffolds. Biomaterials. 2005;26(33):6415–6422. doi: 10.1016/j.biomaterials.2005.04.061. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Yang J, Yamato M, Shimizu T, et al Reconstruction of functional tissues with cell sheet engineering. Biomaterials. 2007;28(34):5033–5043. doi: 10.1016/j.biomaterials.2007.07.052. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Kim K, Ohashi Kazuo, Utoh R, et al Preserved liver-specific functions of hepatocytes in 3D co-culture with endothelial cell sheets. Biomaterials. 2012;33(5):1406–1413. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.10.084. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 18.Gao B, Sakaguchi K, Ogawa T, et al Functional analysis of induced human ballooned hepatocytes in a cell sheet-based three dimensional mode. Tissue Eng Regen Med. 2021;18(2):217–224. doi: 10.1007/s13770-020-00297-x. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 19.Hynds R E, Gowers K, Nigro E, et al Cross-talk between human airway epithelial cells and 3T3-J2 feeder cells involves partial activation of human MET by murine HGF. PLoS One. 2018;13(5):e0197129. doi: 10.1371/journal.pone.0197129. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 20.Barreca A, de Luca M, Del Monte P, et al In vitro paracrine regulation of human keratinocyte growth by fibroblast-derived insulin-like growth factors. J Cell Physiol. 1992;151(2):262–268. doi: 10.1002/jcp.1041510207. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.Ruoß M, Kieber V, Rebholz S, et al Cell-type-specific quantification of a scaffold-based 3D liver co-culture. Methods Protoc. 2019;3(1):1–19. doi: 10.3390/mps3010001. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 22.Ware B R, Liu J S, Monckton C P, et al Micropatterned coculture with 3T3-J2 fibroblasts enhances hepatic functions and drug screening utility of HepaRG cells. Toxicol Sci. 2021;181(1):90–104. doi: 10.1093/toxsci/kfab018. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 23.Haraguchi Y, Shimizu T, Sasagawa T, et al Fabrication of functional three-dimensional tissues by stacking cell sheets in vitro. Nat Protoc. 2012;7(5):850–858. doi: 10.1038/nprot.2012.027. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 24.Kukla D, Crampton A L, Wood D K, et al Microscale collagen and fibroblast interactions enhance primary human hepatocyte functions in three-dimensional models. Gene Expr. 2020;20(1):1–18. doi: 10.3727/105221620X15868728381608. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]