比率型血清胆红素荧光检测系统的设计与实现

Abstract

The current quantitative methods of bilirubin have disadvantages such as high cost and low sensitivity. Due to the negative correlation between the level of serum bilirubin and the risk of cardiovascular diseases, a fluorescent ratiometric film sensor was developed aiming at bilirubin detection at low level concentration. Blue-emitting and red-emitting gold nanoclusters were assembled into the same film using layer-by-layer self-assembly technology. Detection of bilirubin was achieved based on the intensity ratio of the two nanoclusters. Bilirubin exposure causes fluorescent quenching of the film. The fluorescence intensity ratio of the two cluster probes had quantitative relationship versus bilirubin concentration. Based on this film sensor, a portable fluorescence detection system was designed for the ratiometric sensing of bilirubin. The hardware of the system was mainly composed of main control chip STM32F407, TSL237 and TSL238T optical frequency sensor. A light-avoiding dark room and detection light path were designed through three-dimensional printing to reduce the interference from ambient light and improve detection accuracy. Experimental results showed that the proposed detection system had strong anti-interference, good stability and accuracy. The linear coefficient of bilirubin detected by this system was 0.987. The system presented good results in reproducible experiments and possessed a good linear relationship with the data obtained by standard spectrofluorometer. The portable system is expected to detect serum bilirubin at low levels.

引言

近年来，随着人口老龄化加剧，我国慢性病患者人数迅速增长，其中心血管疾病已经成为人类健康的一大威胁^[1-2]。血清胆红素作为人体内重要的抗氧化剂，其抗氧化功能对降低动脉粥脉硬化、降低冠心病发生概率具有重要意义^[3-5]。胆红素是人体内血红素分解代谢后产生的最终物质。一些具有肝功能障碍及患有黄疸病的患者其体内的血清胆红素水平过高，而心血管疾病患者，如小动脉硬化、高血压和糖尿病并发症患者，体内胆红素水平的高低与疾病风险呈负相关^[6-10]。目前，用于定量检测胆红素的主要方法有色谱法、经皮法、酶法等^[11-13]，以上方法在对胆红素进行检测时，存在操作复杂、检测时间长、成本高等缺点。

本文所设计的比率型血清胆红素检测系统，将分别能发射蓝色荧光（B-AuNCs）及红色荧光（R-AuNCs）的金纳米簇，通过层层自组装（layer-by-layer self-assembly，LBL）技术沉积于同一薄膜，得到比率型的荧光薄膜传感器，比率型荧光探针具有自参比特性，可有效避免来自环境的干扰，提高检测精度^[14]。

1. 检测方法建立及系统总体设计

1.1. 检测原理

胆红素在紫外-可见光范围不具有荧光特性，因此采用能发射蓝色/红色荧光的金纳米簇作为荧光探针测定胆红素。以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）为模板在生理条件下制备金纳米簇，BSA能起到还原剂和稳定剂的作用，可形成稳定的金纳米簇。BSA与游离胆红素形成复合物，当BSA保护的金纳米簇与胆红素溶液发生作用时，形成非荧光的基态复合物，使得金纳米簇发生荧光猝灭现象^[15-18]，且荧光猝灭程度与所加入被测样本中胆红素浓度存在线性关系。

1.2. 蓝/红荧光金纳米簇溶液的制备及其荧光光谱

本文通过水热法制备分别能发射蓝色及红色荧光的金纳米簇溶液（BSA-AuNCs）。制备方法如下：① B-AuNCs溶液的制备：取5 mL氯金酸溶液（10 mmol/L）与5 mL BSA溶液（50 mg/mL）混合，加入10 μL的组氨酸溶液（100 mmol/L），使用10 mmol/L的NaOH溶液将混合液的pH值调至5.5，将溶液置于37 ℃水浴加热6 h，得到B-AuNCs。将B-AuNCs溶液在蒸馏水中进行2天透析，透析后的溶液冷冻干燥，4 ℃保存备用。② R-AuNCs溶液的制备：取5 mL的HAuCl₄水溶液（10 mmol/L，37 ℃），在剧烈搅拌条件下加入到5 mL BSA溶液（50 mg/mL，37 ℃）中，继续搅拌2 min，加入NaOH溶液（1 mol/L）将pH值调至12～13，温育12 h，可见溶液由淡黄色变成棕色，得到R-AuNCs。之后采用锌离子共沉淀法对R-AuNCs进行纯化，纯化后的溶液进行冷冻干燥，4 ℃保存备用。

图1为日立F-4600荧光分光光度计（日本）测得的蓝/红金纳米簇溶液的激发光谱和发射光谱。由图可知蓝光金纳米簇在激发光源波长为365 nm产生激发峰，最大发射峰位于443 nm处；红光金纳米簇在激发光源波长为365 nm和501 nm处产生激发峰，最大发射峰位于623 nm处。

图 1.

Fluorescence and absorbance spectra of blue (left)/ red (right)-emitting gold nanoclusters

蓝色荧光（左）和红色荧光（右）金纳米簇溶液的荧光光谱和吸收光谱

1.3. 薄膜传感器的制备与其荧光性能

荧光探针在均相溶液中进行测定时受外界干扰较大且具有耗费试剂、增加实验成本、无法重复利用等缺点^[19]，因而采用LBL技术，将蓝/红两种金纳米簇溶液偶联后的交联物进行组装，得到具有双发射峰的荧光薄膜传感器。层层静电自组装技术是一种比较有效的有序组装纳米分子材料的方法，可以制备均匀、多层复合膜，并且操作简单。利用这种方法可以将不同的分子有序地组合到薄膜上，通过调控薄膜的厚度和结构，能够实现薄膜光、电、非线性光学等特性的功能化^[20-21]。

本文制备的BSA-AuNCs表面带负电荷，聚烯丙胺盐酸盐（polyallylamine hydrochloride，PAH）带正电荷，利用静电作用将蓝色及红色荧光金纳米簇逐层组装到石英基片上，得到LBL荧光薄膜。薄膜制备的主要流程如下。分别取R-AuNCs、B-AuNCs固体溶解于磷酸盐（phosphate buffer saline，PBS）缓冲液（pH = 7.4，50 mmol/L）中，获得20 mg/mL的溶液。在2 mL R-AuNCs溶液中加入碳二亚胺（EDC，2 mg）与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，3 mg）固体用来提高偶联效率，在37 ℃水浴加热15 min后加入2 mL B-AuNCs溶液（20 mg/mL），37 ℃水浴加热12 h，得到蓝/红荧光金纳米簇交联物溶液（20 mg/mL）。将处理好的石英基片置于PAH溶液（2 mg/mL）中浸泡10 min，这时基片表面带正电，之后将石英基片浸泡在蓝/红荧光金纳米簇交联物溶液10 min，带负电的交联物沉积于基片上。重复上述步骤n次便得到了n层的双发射比率型荧光探针薄膜。

由图2可知，在激发光源为365 nm时，交联物溶液（20 mg/mL）在443 nm处与623 nm处存在荧光发射峰，因此交联过程并未改变两者的荧光性质。在石英基片上组装14层交联物后，薄膜具有较强的荧光，其荧光发射峰位于443 nm和623 nm，与溶液的荧光一致。

图 2.

Comparison of fluorescence properties between solution and film

溶液与薄膜荧光性质对比

1.4. 比率型荧光检测方法的建立

本文通过前期实验确定，当金纳米簇溶液铺膜浓度为20 mg/mL、层数为14时，薄膜传感器的荧光性能最优，且对胆红素的最佳检测时间为120 s。采用365 nm的激发光源对其进行激发，在薄膜上滴加一定浓度梯度的胆红素标准液后，采用荧光分光光度计检测薄膜的荧光光谱，荧光探针发射峰荧光强度的变化情况如图3所示。随着胆红素浓度增加，两个峰荧光强度下降的程度越发明显，且峰值之间的比值与胆红素标准液浓度存在线性关系。因此，建立了一种双发射型的比率薄膜传感器，通过同时检测波长1（443 nm）与波长2（623 nm）处的荧光强度F1、F2，将检测结果做比例运算（F1/F2），达到对血清胆红素浓度进行测定的目的。

图 3.

Fluorescence quenching of the film by adding bilirubin standard solution

加入胆红素标准液后薄膜荧光光强变化情况

为了确定比率荧光膜传感器的性能，我们进行了红色荧光金纳米簇单一探针及薄膜对胆红素响应的对比实验。在水溶液中采用单一的荧光探针测定胆红素，其荧光猝灭程度与胆红素浓度的Stern-Volmer线性拟合方程为：F₀/F−1＝0.097 1C−1.012，F₀为滴加胆红素前荧光峰强度，F为滴加胆红素后的荧光峰强度，C为胆红素标准液浓度（单位为μmol/L），胆红素浓度线性范围为11.19～23.14 μmol/L。本文中的比率型荧光薄膜对胆红素测定的线性方程为F1/F2=0.35C+1.46，C为胆红素标准液浓度（单位为μmol/L），胆红素浓度线性范围为0.01～2.00 μmol/L。从二者标准曲线的斜率及线性范围可知，比率型金纳米簇荧光膜的灵敏度更高，适用于低浓度水平血清胆红素的测定。

2. 检测系统总体设计

基于上述检测原理，设计了一种便携式比率型血清胆红素荧光检测系统，该系统总体框图如图4所示。系统主要由微处理器、程序下载模块、电源模块、恒流源模块、光频转换模块、显示屏模块、暗室等组成。微处理模块的功能是控制其他外设电路工作，并且对采集的数据进行分析；程序下载模块的功能为下载程序以及初期阶段代码调试，确保软件正常运行；电源模块的功能主要是为本系统中其他模块提供电压输入，并且配置了充电保护，使得系统可长时间使用；恒流源模块是用来为激发光源提供稳定的电流输入，确保激发光源工作稳定；光频传感器模块用来检测LBL薄膜在加入胆红素前后的荧光强度值；显示屏模块将所滴加胆红素的浓度进行显示。为了避免环境光的干扰，除显示屏外，其余模块均置于三维打印制作的暗盒中。

图 4.

Overall framework of the ratiometric fluorescence detection system for serum bilirubin

便携式比率型血清胆红素荧光检测系统总体框架图

系统启动后，STM32驱动恒流源芯片对激发光源进行调控确保其稳定工作，激发光经过光路结构后，照射到可抽拉的检测槽上，对放置好的LBL薄膜进行激发。由于金纳米簇具有荧光特性，因此LBL膜受到特定的激发光照射后，会产生一定强度的荧光发射。通过滤光片将其他波段的杂光滤除，只允许波长为两个发射荧光峰（F1、F2）的荧光信号通过，之后分别经过位于滤光片后的聚光镜汇聚到光频传感器光窗，被光频传感器转换成脉冲电信号，最终返回到主控芯片进行数据分析与处理，液晶显示屏对分析后的数据进行显示。为了防止外界环境对检测结果的干扰，整个实验过程在室温（20～25℃）条件下的暗室中进行。

3. 系统硬件实现

3.1. 微处理器模块

本系统采用STM32F407ZGT6作为主控芯片，其在低功耗模式下电流仅为1.7 μA，功耗较少。STM32F407ZGT6是Cortex^TM-M4为内核的STM32F4系列高性能微控制器，支持浮点型运算，在数据处理方面十分出色^[22]。

3.2. 电源模块

本系统中采用锂电池供电，电池最大输出电压为3.7 V，输入电压为4.5 V。为了达到长期使用的目的，为锂电池设计了充电电路。使用功率计对系统功耗进行测定，静息态时实际功耗为0.81 W。

3.3. 激发光源模块

本系统中，当激发光源的波长为365 nm时，测定443、623 nm两个波长处LBL薄膜的荧光强度，应该采用紫外光源作为激发光源。在荧光检测中常用的紫外光源有氙灯、激光、钨灯和LED光源等^[23]。本实验选用LED作为激发光源，LED具有成本低、光源稳定、散热量小的优点。根据LBL薄膜的最佳激发波长，系统选用的LED为鸿光电子公司生产，其峰值波长为 365 nm，带宽10 nm，功率为0.5 W，通过恒流源芯片AMC7150驱动可满足实验的需要。

3.4. 光频转换模块

系统中采用双通道比率检测方法，因此需要两个光频传感器来采集荧光信号。由于光电二极管灵敏度高、响应快并且拥有良好的线性测量范围，在弱光检测中被广泛使用^[24-25]。本系统选择内部集成了光电二极管和电流频率转换器的光频传感器TSL237和TSL238T作为荧光光强检测器。

在光频传感器前需放置滤光片用来滤除杂光的干扰，其主要功能是允许特定波段的光通过^[26]，本次实验中使用的滤光片为亿照公司生产的截止深度为OD5的带通滤光片，中心波长分别为620 nm和440 nm，带宽为20 nm。

经过滤光片滤除杂光干扰后，特定波段的荧光信号分别照射到TSL237、TSL238T的光窗上。TSL237内部COMS集成电路上集成了光电二极管和电流频率转换器，光信号经过转换后输出占空比为50%的方波信号，且输出频率与照射到传感器内的光电二极管的光照强度成正比，数字输出允许直接与微控制器或其他逻辑接口相连接。器件经过温度补偿，适用于320 ～ 700 nm的紫外-可见光范围，并可对320 ～ 1050 nm范围内的光强作出响应，在波长524 nm处具有最强辐照响应度，故用于443 nm荧光的检测。TSL238T内部与TSL237类似，不同的是，TSL238T输出使能（output enable，OE）为低电平时芯片工作，OE输入线便于同一个总线在挂接多个设备时操作；TSL238T在波长640 nm处具有最强辐照响应度，故用于623 nm荧光的检测。

3.5. 显示屏模块

显示屏的主要作用是用来显示检测物质浓度及系统的其他一些信息。本系统采用的为2.8寸的电阻型触摸屏，其内部驱动芯片为ILI9341。电阻屏具有触摸灵敏度高、视角广、反应速度快等优点，并且支持众多的芯片，本文通过FSMC总线对屏幕进行驱动^[27]。

3.6. 检测光路及检测暗室模块

光路的结构决定了发射光和激发光在系统内部的传递方向，本系统采用传统的荧光激发光路，该光路结构在一定程度上可减少激发光源的干扰，且对荧光信号的收集具有良好的效果^[28-30]。图5为本系统的光路结构及整个系统示意图，主要光路工作原理为：在检测区域放置LBL薄膜，激发光源经过滤光片A后，通过二向色镜A反射到检测池中对薄膜进行激发，所产生的荧光透射过二向色镜A，在经过二向色镜B时，443 nm附近波段的光折射到滤光片B后，被耦合镜收集在传感器B的光窗上，623 nm波长附近的光透射到滤光片C后，被耦合镜收集在传感器A的光窗上。传感器将光信号转换为电信号输出，并将数据传入系统主控芯片进行数据分析。

图 5.

System structure diagram

系统结构示意图

本系统中的暗室模块主要是用来将检测光路、检测槽及其他硬件模块嵌入其中，建立一个避光的检测环境，减少环境光的干扰。

4. 系统软件实现

系统下位机软件设计是基于ST公司提供的官方固件库开发，使用Keil 5集成开发平台，在系统工作及模块驱动方面采用C语言编写，实现了光源控制、信号采集、信号预处理等功能。系统的上位机软件开发是基于开源的littleVGL官方库开发，使用Code Blocks平台，最后将开发好的图形用户界面（graphical user interface，GUI）移植到微处理器中。

5. 实验结果分析

5.1. 系统重复性测试

使用PBS溶液（pH = 7.0）配置不同浓度梯度的血清胆红素标准液，打开系统中的激发光源等待光源稳定（10 s）。在光源稳定后取出检测槽，将LBL薄膜放入检测槽中，之后将检测槽缓缓推入暗室，在显示界面可看到F1与F2的值，待数值稳定后将检测槽拉出，使用移液枪吸取50 μL浓度为0.4 μmol/L的胆红素标准液滴加在LBL薄膜上，使用滤纸将多余的溶液吸干，之后将检测槽推入暗室反应120 s，上述流程重复五次。在对系统进行重复性实验时通常都采用相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）作为评价系统重复性的指标，其定义为标准差（standard deviation，SD）与平均值（Mean）之比。

1

2

实验结果如表1所示。由表1可知，在加入胆红素后，由于荧光猝灭作用，F1、F2的值均发生下降，且五次重复实验测试结果所得到的F1/F2值一致性较好，RSD值为1.8%，由此可知本系统具有良好的重复性。

表 1. Repeatability of the system.

重复性实验

检测次数	检测浓度/（μmol·L−1）	F1	F2	F1/F2
1	0（未加胆红素）	622.26	112.20	5.55
2	0.4	512.69	82.88	6.19
3	0.4	509.98	81.21	6.28
4	0.4	515.42	82.52	6.24
5	0.4	528.21	81.39	6.49
6	0.4	511.15	82.09	6.23

5.2. 系统稳定性测试

为了对系统的稳定性进行测试，在最佳的实验条件下，本文以浓度为0.6 μmol/L的胆红素标准液作为实验对象，持续5 min对系统所检测的荧光光强数据进行记录，结果如图6所示。随着反应时间的增加，F1和F2的荧光强度均下降，在0～90 s范围内，荧光强度下降较为明显，90 s之后荧光值基本达到平衡。该平衡时间反映了LBL膜中BSA保护的金纳米簇对胆红素的分子识别过程，由于BSA与胆红素结合成非荧光性的复合物，削弱了BSA与金纳米簇之间的结合作用，导致LBL膜的荧光强度下降。BSA与胆红素之间的结合作用是一个动态的平衡过程，到达平衡之前，随着胆红素的结合量增加，荧光下降明显，当胆红素分子完全被结合之后，荧光强度不再变化，达到稳定值。从系统稳定性测试结果可知，该系统能实时反映分子识别过程，其平衡时间为90 s，且信号稳定时间在3 min以上，稳定时间满足检测需要。

图 6.

System stability test

系统稳定性测试

5.3. 系统标准工作曲线及验证

根据上述实验方法流程，取五组不同浓度的标准液（0.05、0.10、0.20、0.50、0.80 μmol/L）进行平行实验，将得到的多组实验数据去除粗大误差后，取平均值作为每组浓度的实验结果。使用该检测结果与浓度进行标准工作曲线的绘制，如图7所示，标准工作曲线方程为y = 2.20C + 5.46，其中y为荧光强度比值，C为胆红素标准液浓度（单位为μmol/L），两者相关系数R² = 0.987，说明该系统检测到的LBL薄膜的双荧光峰强度比值与胆红素浓度具有较好的相关性。

图 7.

System standard curve

系统标准曲线

取验证标准工作曲线之外的4种胆红素标准液浓度（0.08、0.15、0.30、0.40 μmol/L）作为验证集，将这4种浓度的溶液按照上述实验方法进行10次平行实验，将检测结果通过标准工作曲线换算成系统所测浓度C，上述浓度实测RSD值依次为9.0%、7.3%、3.1%、2.5%。虽然存在一定误差，但是由于薄膜制备上的差异及系统电路上存在的噪声影响，总体来说，此实验数据可表明该系统具有较高的准确性。

5.4. 测量结果与标准仪器对比

将日立F-4600荧光分光光度计作为商品化标准仪器进行对比。使用标准仪器对胆红素标准液的检测流程与本系统类似，首先使用五个样本进行五次平行实验，去除误差后，绘制出标准仪器的工作曲线如图8所示，标准仪器对胆红素检测的标准曲线为y = 0.35C + 1.46，其中y为荧光强度比值，C为血清胆红素标准液浓度（单位为μmol/L），两者相关系数R² = 0.994，由此可知标准仪器在对胆红素进行检测时，具有较高的可信度。之后将本系统与标准仪器在相同浓度下所检测的荧光强度比值进行分析，由图8可知二者拟合曲线为y = 6.42x − 3.59，其中x为标准仪器检测值，y为本系统检测值，两者相关系数R² = 0.991。本系统的最低检测限度为0.02 μmol/L，比标准仪器的检测限略高，主要是由于本系统中激发光源的发光强度有限，且仪器内部硬件性能差异，也使得两者所检测的荧光强度比值存在一定差别，但二者具有较强的相关性，并不影响本系统的正常使用。以上结果表明，尽管本检测仪器与标准仪器相比还存在一定差异，但本系统对低水平胆红素浓度的检测具有可行性。

图 8.

The relationship between the data measured by our sys tem and the standard instrument

本系统与标准仪器测量值关系图

5.5. 系统抗干扰性实验

在血清胆红素中存在多巴胺（Dopamine）、果糖(Fructose)、半乳糖（Galactose）、葡萄糖（Glucose）、血红素（Heme）、谷胱甘肽（Glutathione）等共存物，为了验证这些共存物是否会对检测结果产生影响，在胆红素溶液（0.2 μmol/L）中添加共存物（0.1 mmol/L），根据上述的实验流程进行测定。实验结果如图9所示，在共存物浓度为胆红素浓度的500倍时，所检测的荧光强度比值并不存在明显的上升或下降，可知这些共存物的存在并不影响该系统对血清胆红素的测定。

图 9.

System interference test

系统干扰性测试

6. 结论

为了满足对低水平血清胆红素浓度进行检测的需要，本文构建了比率型胆红素荧光薄膜传感器，基于此传感器，设计了一套小巧、便携的胆红素检测系统。实验结果表明，该系统具有较高的灵敏度、较好的重复性以及很强的抗干扰性，该系统检测结果与标准仪器相比具有很强的相关性，相关系数为0.991，检测时间仅为2 min，可以实现对血清低水平胆红素的定量检测。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：支冬灿为主要撰写人，完成文献资料的整理收集与分析，嵌入式系统的搭建以及论文初稿的撰写；肖文香参与前期化学实验指导以及论文修改。

Funding Statement

国家自然科学基金项目（61761013）；广西自然科学基金项目（2017GXNSFAA198116）；广西自动检测技术与仪器重点实验室基金项目（YQ17113）

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