Development and validation of a vero cell-based suspension method for the detection of Zika virus

Dina Popuche; Alfredo Huaman; Steev Loyola; María Silva; Sarah A Jenkins; Carolina Guevara

doi:10.17843/rpmesp.2023.403.12606

. 2023 Sep 25;40(3):297–306. doi: 10.17843/rpmesp.2023.403.12606

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Development and validation of a vero cell-based suspension method for the detection of Zika virus

Dina Popuche ¹, Alfredo Huaman ¹, Steev Loyola ^2,³, María Silva ¹, Sarah A Jenkins ^1,⁴, Carolina Guevara ¹

¹U.S. Naval Medical Research Unit SOUTH, Lima, Peru. U.S. Naval Medical Research Unit SOUTH, Lima , Peru

²Facultad de Medicina, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Peru. Universidad Peruana Cayetano Heredia, Facultad de Medicina, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima , Peru

³Vysnova Partners Inc., Maryland, USA, Vysnova Partners Inc. Maryland , USA

⁴Naval Medical Research Center, Silver Spring, USA, Naval Medical Center, Naval Medical Research Center, Silver Spring , USA

^✉

Correspondence: Steev Loyola; steev.loyola@gmail.com

Authorship contributions.: All authors declare that they meet the authorship criteria recommended by the ICMJE.

Conflicts of Interest.: The authors declare no conflict of interest. The views expressed in this article are those of the authors and do not necessarily reflect the official policy or position of the Department of the Navy, Department of Defense, nor the U.S. Government. Several authors are employees of the U.S. government. This work was prepared as part of their official duties. Title 17, U.S.C., §105 provides that copyright protection under this title is not available for any work of the U.S. Government. Title 17, U.S.C., §101 defines a U.S. Government work as a work prepared by a military Service member or employee of the U.S. Government as part of that person’s official duties.

Roles according to CRediT.: DP: Conceptualization, Methodology, Investigation, Data Curation. AH: Conceptualization, Methodology, Investigation, Data Curation. SL: Conceptualization, Methodology, Software, Formal analysis, Investigation, Writing - Original Draft, Visualization. MS: Validation, Resources, Writing - Review & Editing, Supervision, Project administration, Funding acquisition. SAJ: Validation, Resources, Writing - Review & Editing, Supervision, Project administration, Funding acquisition. CG: Conceptualization, Methodology, Validation, Investigation, Resources, Writing - Review & Editing, Supervision, Project administration, Funding acquisition.

Roles

Dina Popuche: Medical technologist

Alfredo Huaman: Naval nurse

Steev Loyola: Medical technologist, Master in Epidemiology

María Silva: Veterinarian, PhD in Molecular Genetics and Biochemistry

Sarah A Jenkins: Biologist, Ph.D. in Biomedical Sciences

Carolina Guevara: Biologist, Master in Microbiology

PMCID: PMC10959515 PMID: 37991033

ABSTRACT

Objective.

To develop and validate a cell suspension method using Vero 76 cells for culturing Zika virus (ZIKV) based on infection of detached freshly seeded cells.

Material and methods.

Three different multiplicities of infection of ZIKV were used to develop and compare this novel method to the standard confluent cell monolayer method. In addition, we preliminary validated the cell suspension method using well-characterized ZIKV positive and negative clinical samples. The standard confluent cell monolayer method was used as the reference method, and viral isolation was confirmed by a ZIKV-specific RT-PCR. The sensitivity and its 95% confidence intervals for the cell suspension method were estimated. Also, a technical comparison of the cell suspension method against the cell monolayer method was performed.

Results.

Our findings suggested that both the viral load and replication of ZIKV were comparable between both monolayer- and suspension-infection methods. Although both methods were suitable for culturing and isolating ZIKV, the cell suspension method was easier, cheaper, and quicker as well as a sensitive isolation technique. The cell suspension method was significantly more sensitive in detecting Zika in inconclusive cases by RT-PCR, with a fourfold increase compared to the confluent cell monolayer method.

Conclusion.

The cell suspension method has the potential to be an effective method for cultivating and isolating ZIKV and its application is potentially useful in both research and clinical settings.

Keywords: Zika Virus, Zika Virus Infection, Virus Replication, Cell Culture Techniques

INTRODUCTION

Zika virus (ZIKV) is an emerging flavivirus transmitted by Aedes mosquitoes in several Latin American countries ¹^,². Since 2015, several countries reported autochthonous transmission of ZIKV that led to severe outbreaks in the Americas ³^-⁵. ZIKV infection causes clinical manifestations in about 20 percent of patients who presented an acute onset of fever, maculopapular rash/eruptions, arthralgia, or conjunctivitis ³^,⁶. After the emergence of ZIKV in Brazil in 2015, infection by the virus was associated with a significant increase in the number of infants born with microcephaly and birth defects, as well as an increase in neurological disease cases in all age groups, such as myelitis and Guillain-Barre ⁷^,⁸. Several studies have shown that ZIKV can be transmitted through sex and blood transfusion, which complicates the understanding of the transmission process as infected individuals may not be aware of the transmission potential ⁹^-¹³. Since ZIKV was declared as a global emergency by the World Health Organization, countries vulnerable to ZIKV emergence should be able to detect and confirm ZIKV cases regardless of whether or not active cases are detected in endemic regions ¹⁴^-¹⁶.

Diagnostic testing for arboviral infections is aimed at the detection of the virus or host immune antibody response ¹⁷. Serological assays have been used to detect ZIKV IgM antibodies to confirm a recent infection, but the results of these tests are difficult to confirm due to cross-reactivity among flaviviruses and false positives ¹⁸^,¹⁹. ZIKV is usually detected by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) in serum, blood, urine, and other body fluids, but the use of molecular diagnostic tools may be limited as the kinetics of viremia and specific viral RNA sequences may not be specific enough to detect the virus ²⁰. As such, negative or inconclusive results based on molecular assays do not necessarily imply the absence of ZIKV infection ¹⁶^,¹⁸^,²¹^,²².

The different types of cell cultures, used in several virus isolation techniques, play an important role in diagnosing cases when samples of clinically suspected cases are negative or inconclusive by RT-PCR. Virus isolation is particularly sensitive and useful for detecting circulating viruses during the viremic stage of infection and for correctly classifying samples with inconclusive results but has drawbacks in settings with limited resources. Although virus isolation can be cost-effective and can be used to evaluate the kinetics of viral infections and clinical outcomes, it requires highly skilled operators and can be laborious ¹⁵^,¹⁷. Viral isolation of ZIKV has been comparatively difficult ²⁰^,²³ because the method relies on infrastructure and specific laboratory resources that are not available in developing countries, such as cold-chain processes for viral preservation, cell-culture laboratories and supplies, cell lines, and well-trained and competent laboratory personnel. Thus, diagnostic methods must be accessible and balanced. Having confident methods of ZIKV diagnosis is a time-sensitive need because susceptible populations like pregnant women and infants are at risk of ZIKV infection ⁷^,¹¹^,¹⁶^,²⁴.

This study aimed to find an isolation method that balances the critical need for accuracy and the rapid detection of ZIKV, particularly during emergency or outbreak situations in which early detection and isolation are required for the development or evaluation of different diagnostic tests. For instance, complementary methods are required to rapidly detect or isolate the virus in cases when ZIKV infection is suspected with negative or inconclusive RT-PCR results. In this regard, conventional culture methods require a previously formed monolayer, which, depending on the concentration of seeded cells, could take between 12 or even 48 hours. As such, the development of isolation methods without the need for a pre-formed monolayer could have a significant impact on decreasing response times and could help decision-makers in developing better public health measures earlier. Here, we described the development and standardization of an in-house cell suspension method as well as its preliminary validation using human clinical samples. In addition, the cell suspension method was compared to the confluent cell monolayer method using Vero 76 cells to optimize an accurate and rapid alternative isolation technique for ZIKV detection.

KEY MESSAGES

Motivation for the study. To search and develop new useful alternatives for Zika virus (ZIKV) research in emergency situations.

Main findings. We developed and validated a novel method for isolating and culturing ZIKV based on infecting freshly seeded and unattached Vero cells. This method was found to be easy, cheap, fast and more sensitive when compared to the standard method used for ZIKV isolation.

Implications. The method we developed can be used to strengthen the diagnosis and public surveillance of ZIKV with fast and reliable results.

MATERIAL AND METHODS

Study design

Experimental study based on the design and validation of a two-phase proof-of-concept; in vitro experiment using a viral seed, and a preliminary validation with clinical samples. Both phases used Vero cells (African green monkey [Chlorocebus] renal epithelium) obtained from the American Type Culture Collection (ATCC; CRL-1587). We used 29 samples for preliminary validation, which were collected in Honduras (FHT codes, n=4), Colombia (FCC codes, n=4), Venezuela (FVM code, n=1) and Peru (FPI and FPY codes, n=20) by researchers from the U.S. Naval Medical Research Unit SUR. The samples were obtained from individuals with fever for up to five days and clinical symptoms compatible with Zika infection.

Culturing cells for ZIKV inoculation

Vero 76 is an optimal cell line for ZIKV isolation and also supports the development of human viral vaccines and biomedical research on viral diseases ¹⁸^,²⁵^,²⁶. This cell line is used regularly in our laboratory for virus culturing and isolation because it is susceptible to flaviviruses, such as ZIKV and other arboviruses. Viability was assessed in all cell experiments using trypan blue in a hemocytometer, resulting in values between 90-95%. No differences in cell viability between cells used in the confluent cell monolayer or the cell suspension method were found.

Confluent cell monolayer method: Vero 76 cells were seeded at a density of 1.0 x 10⁵ cells/mL in a T12.5-culture flask (Corning, Glendale, AZ, United States; Cat. No.: 353018) using 3 mL of Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) (Quality biological, Gaithersburg, MD, United States; Cat. No.: 112-018-101) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Merck, Darmstadt, Germany; Cat. No.: F4135) and incubated for two days at 37°C, 5% CO₂. Thereafter, the 2-day monolayer was confluent at 1.3 x 10⁶ cells per flask. This standard culturing method is used routinely to prepare cells for attempting to isolate ZIKV and other arboviruses.

Cell suspension method: On the day of inoculation of cells with ZIKV, Vero 76 cells were seeded in 12-well culture plates (Thermo Fisher, Cleveland, OH, United States; Cat. No.: 150628) using 1mL of EMEM supplemented with 10% FBS at a density of 2.0 x 10⁵ cells/mL. Prior to inoculation, cells were incubated for 30 minutes at 37°C, 5% CO₂ to facilitate pH stabilization. This method was designed to eliminate the incubation time required to prepare a confluent cell monolayer in order to have a faster response time for ZIKV testing. However, it is important to mention that, as the incubation time elapses, the cells proliferate and tend to form a monolayer. The 12-well culture plates were selected because it allows for maximizing the use of cells and reagents per sample, and because it allows the inoculation of multiple samples per plate.

Virus inoculation and follow-up

We used ZIKV isolated in Vero 76 cells collected from an acute serum sample obtained from a Zika case in Iquitos, Peru to carry out the viral infection for both methods. In order to assess viral replication, we prepared three multiplicities of infection (MOI) of 0.1, 0.01, and 0.001 in EMEM without FBS for virus inoculation of Vero 76 cells. Cell cultures without virus inoculum were used as negative controls.

Monolayer-infection method: After two days, the supernatant of Vero cells was discarded using a sterile technique. The cells were then inoculated with 0.2 mL of MOIs at concentrations of 0.1, 0.01, and 0.001 of ZIKV in duplicate. Flasks were shaken gently back and forth manually five times and incubated for 1 hour at 37°C in 5% CO₂. Then, 3 mL of EMEM supplemented with 2% FBS was added to each culture and incubated under the same conditions described above. For this method, no media replacements were performed after the infection with the viral inoculum, thus, the incubation was continuous.

Suspension-infection method: Infection occurs in cells that were recently seeded and are not yet fully adhered to the culture plates. This method was standardized by inoculating 0.1 mL in duplicate of the three MOIs directly onto each Vero cell culture and then incubating for three days at 37°C in 5% CO₂. A previous study suggested that, regardless of the viral titer used for the infection, the absence of FBS correlates with high rates of viral replication ²⁷. Therefore, to avoid depletion of media components, on the third day, the medium was carefully removed using a 1-mL pipette without disturbing the monolayer and then replaced with 1 mL of new EMEM without FBS. Cultures were then placed in the incubator at 37°C in 5% CO₂.

Follow-up: Vero cell cultures inoculated with ZIKV were observed daily for cytopathic effect (CPE) and 200 µL of supernatant of each inoculated culture were collected for further molecular and plaque assay analysis. Cultures were harvested when the cells showed >75% (3+) CPE or up to 10 days post-inoculation.

Molecular assay

RNA was extracted using 140 µL from each supernatant sample obtained daily from ZIKV-infected Vero cells starting on day 0 up to the time of the appearance of CPE or up to 10 days post-inoculation. The QIAamp Viral RNA kit (Qiagen, Hilden, Germany, Cat. No.: 52904) was used for extraction according to the manufacturer’s instructions. Detection of ZIKV RNA was performed using primers and probes, and PCR conditions as previously described ²⁸. The reaction mixture for the one-step RT-PCR was prepared using the Fast Virus 1-step master mix (Thermo Fisher, Cleveland, OH, United States; Cat. No.: 4444436), and the amplification was performed in the Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Instrument (Thermo Fisher, Cleveland, OH, United States; Cat. No.: 4406984). The detection limit of the RT-PCR assay for ZIKV was previously described at the cycle threshold (Ct) of 36.2 ± 1.6 ²⁸. Here, serum or blood samples with a Ct value less than or equal to the cutoff value were classified as positive (Ct ≤ 34.6), while those with no amplification signal were classified as negative. Samples with a late amplification signal (Ct > 34.6) were classified as inconclusive. The cycle threshold (Ct) values were registered and used as a reference for viral load.

Plaque assay

A549 and Vero cells are susceptible to the ZIKV infection resulting in CPE ²⁵. In previous experiments conducted in our laboratory, we did not find significant differences in the ZIKV load when comparing the plaque-forming unit counts in Vero and A549 cells using the semisolid plaque assay method ²⁹. However, we noticed that plaques were better formed in A549 cells on the third day of infection in comparison to Vero cells (Figure 1). The semisolid plaque assay was carried out by preparing an A549 cell suspension in 12 well plates at a density of 2.0 x 10⁵ cells/mL per well. The cell cultures were placed in the incubator for 30 minutes at 37°C and 5% CO₂. Cell supernatant samples were tested in a single 12-well culture plate, as in previous studies ³⁰. Six 10-fold dilutions were prepared using 100 µL of each supernatant sample and then inoculated onto cultures in duplicates. After three hours of incubation under the same conditions described above, 1 mL of 3% of carboxymethyl cellulose was added to each culture and then incubated for three days. Cells were stained using 3 mL of a solution prepared with anhydrous sodium acetate, naphthol blue black, and acetic acid. Plaque forming units (PFU) were counted and used for calculating the PFU per mL (PFU/mL) to determine the infectivity titer.

Validation of the cell suspension-infection method

Twenty-nine acute serum samples were used initially to validate the cell suspension method. This set of samples included 15 ZIKV-positive, 12 ZIKV-inconclusive, and 2 ZIKV-negative samples as determined by RT-PCR ²⁸. ZIKV-inconclusive samples were included in the validation process under the assumption that the late amplification (39.0 > Ct > 34.6) observed in the RT-PCR was associated with a low viral load and that propagation in cell culture could subsequently help to classify the sample as positive or negative. The two negative samples were included as they showed a small amplification pattern close to 40 cycles. The blood specimens were collected from participants during the acute phase of febrile illness with clinical symptoms compatible with Zika infection from Honduras (FHT codes, n=4), Colombia (FCC codes, n=4), Venezuela (FVM code, n=1), and Peru (FPI and FPY codes, n=20). Collected samples were centrifuged to separate the serum and stored at -80°C until use. Thawed serum samples were diluted 1/10 using EMEM without FBS. The infection was carried out in the cell suspension infection and the confluent monolayer infection methods in duplicate as described above.

Statistical analysis

PFU/mL values were transformed to log₁₀ (PFU/mL). Ct and log₁₀ (PFU/mL) values were plotted independently to assess the viral growth kinetics of the confluent cell monolayer and cell suspension method at the three MOI dilutions. We conducted Mann-Whitney tests using Ct and log₁₀ (PFU/mL) values per day without considering the MOI inoculum to explore differences between methods. For the validation process, we explored differences in the harvest day using a paired T-test. The sensitivity and its 95% confidence intervals for both infection models were estimated considering the molecular assay as the gold standard. The data analysis was performed using Stata v16.0 (StataCorp. 2015. Stata Statistical Software: Release 14. College Station, TX: StataCorp LP.; licensed by Universidad Peruana Cayetano Heredia) and considering p<0.05 as significant.

Ethical aspects

The study was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki. The study protocols NMRCD.2010.0010 and NAMRU6.2020.004 were approved by the Institutional Review Board of the U.S. Naval Medical Research Unit SOUTH in compliance with all applicable federal and local regulations governing the protection of human subjects. During the first protocol, samples were collected from individuals who provided informed consent for arbovirus research, while for the second protocol, anonymized samples were used for the development and validation of laboratory-developed tests.

RESULTS

Technical analysis

Table 1 shows the comparison between the confluent cell monolayer and the cell suspension infection methods for ZIKV culturing. The suspension method did not require culturing a confluent 2-day monolayer, thus saving time (48 hours) in the process. Interestingly, however, on day 2 after the infection, a complete monolayer of cells was observed in all experiments performed for the suspension-infection method. The suspension method required less medium, less sample volume, and supported multiple samples to be tested (in duplicates and five times more than the monolayer) simultaneously. The suspension method was also 2.7 times less expensive than the monolayer method, which is favorable in resource-limited laboratories (Table 1). Figure 2 shows a visual representation of the culture and inoculation process of the suspension method.

Table 1. Comparison of the cost of the cell monolayer versus the cell suspension model for detecting ZIKV.

Characteristics		Monolayer	Suspension
Materials
	Support	T12.5 culture flask	12-well culture plate
	Medium per sample before the infection (mL)	3	0
	Medium per sample after the infection (mL)	3	2
Cell culture time
	Prior to infection (hours)	48 ^a	0
Sample
	Volume required (mL) ^b	0.2	0.1
	No. of samples in parallel	1 per flask	5 to 11 per 12-well plate ^c
Cost per 5 samples (USD) ^d
	Total	10.73	4.03

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A monolayer can form within hours if enough cells are planted, thus it is also possible to reduce the time for the formation of a cell monolayer. ^b This volume does not include the duplicate. ^c Five samples in duplicates or 11 samples with no duplicates, including one cell control. d Prices were reviewed on July 2022. The costs associated with protective equipment and salaries were not considered.

Development and standardization

Daily search for CPE confirmed ZIKV infectivity, which was comparable in both isolation methods during the standardization process. Supernatants of both methods were harvested on day 4 after infection for MOIs of 0.1 and 0.01, and on day 5 for MOI of 0.001. Regardless of the viral replication, ZIKV replicated in both cell suspension and cell monolayer methods. ZIKV replication was assessed using RT-PCR assay and plaque method.

Supernatant Ct values were compared daily for each method in order to evaluate the amount of replicated viral particles. We did not find differences in the total number of viral particles between the methods across different MOIs (Figure 3).

The analysis of the log₁₀ (PFU/mL) values estimated by the plaque assay did not show any differences in the infectious viral particle loads until the second day post-infection (Figure 4). The number of infectious viral particles was lower for the cell suspension method in comparison to the confluent cell monolayer method on day 3 before the media was changed (p=0.049, 3dpi, Figure 4). After the media was changed, the infectious particle load was comparable between the methods across different MOIs (Figure 4).

Validation of the cell suspension-infection method

We used 29 serum samples from febrile cases to assess the performance of the cell suspension method (Table 2). Overall, we did not observe differences (p=0.243) in the harvest day between the monolayer (9.2 ± 1.3 days) and cell suspension method (9.6 ± 1.1 days), nor between ZIKV-positive (p=0.403) or ZIKV-inconclusive serum samples (p=0.166). The sensitivity in ZIKV-positive samples was 40.0% (6/15, 95%CI: 16.3% - 67.7%) for both methods, but the suspension method showed lower Ct values on the harvest day. Interestingly, two Zika cases were positive by the monolayer method but negative by the cell suspension method, and two other cases were negative by the monolayer but positive by the suspension method. Among the ZIKV-inconclusive samples, the sensitivity was 8.3% (1/12, 95%CI: 0.2% - 38.5%) for the monolayer method and 33.3% (4/12, 95%CI: 9.9% - 65.1%) for the cell suspension method. Both isolation methods were able to detect ZIKV in the two serum samples that were presumptively negative by RT-PCR.

Table 2. Validation results of the developed cell suspension-infection method.

Sample code		Ct value in serum/blood	Harvest day		Ct values in Supernatant ^a
Sample code		Ct value in serum/blood	Monolayer	Suspension	Monolayer	Monolayer
Positive serum by RT-PCR (n=15) ^b
	FHT01120	26.5	7	6	12.6	12.6
	FPI15198	20.9	7	6	15.9	15
	FPI15263	20.3	10	8	22.8	19.2
	FCC00093	28.5	8	8	20.2	16.3
	FPI16318	21.8	10	10	22.1	Negative
	FPY00911	23.9	7	10	26.4	Negative
	FVM00251	25.7	10	10	Negative	30.9
	FHT01144	29.6	7	10	Negative	17.6
	FCC00110	27.1	10	10	Negative	Negative
	FHT01166	24.4	10	10	Negative	Negative
	FPI15173	22.4	10	10	Negative	Negative
	FPI15283	25.1	10	10	Negative	Negative
	FPI15452	23.8	10	10	Negative	Negative
	FHT01166	24.4	10	10	Negative	Negative
	FPI15263	20.3	7	10	Negative	Negative
Inconclusive serum by RT-PCR (n=12) ^c
	FPI16332	35.9	10	10	24.3	20.4
	FCC00100	36.1	7	10	Negative	33.1
	FPI16096	38.3	10	10	Negative	19.8
	FPY00920	37.2	10	10	Negative	33.7
	FCC00087	35.2	7	10	Negative	Negative
	FPI15509	37.3	10	10	Negative	Negative
	FPI15698	35.9	10	10	Negative	Negative
	FPI16402	37.1	10	10	Negative	Negative
	FPY00937	36.4	10	10	Negative	Negative
	FPI16290	37.8	10	10	Negative	Negative
	FPY00925	38.1	10	10	Negative	Negative
	FPI15575	31.9	10	10	Negative	Negative
Negative serum by RT-PCR (n=2) ^d
	FPI15718	39.8	10	10	29.5	28.1
	FPI16191	39.7	10	10	28.5	27.8

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The real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed in supernatants on harvest day, and cycle threshold (Ct) of duplicates were summarized using means (the standard deviation between duplicates varied between 0.31 and 0.07). ^b Ct values ranged from 20.3 to 29.6. ^c Ct values for serum/blood samples classified as inconclusive (Ct>34.6) ranged from 35.2 to 38.3. ^d Ct values for serum/blood samples classified as negative, since they were very close to the total 40 cycles of amplification.

DISCUSSION

The isolation method is an important component of ZIKV research. Nonetheless, several researchers have reported failed virus isolation attempts when working with RT-PCR-positive human body fluids due to the time of sample collection after symptom onset and the viral load ⁹^,²²^,³¹. There is a need to improve and develop cost-effective virus culturing methods to provide evidence and duration of infectious virus from body fluids ¹⁸^,²⁰. Here we report the development and standardization, as well as the preliminary validation of an in-house cell suspension method for ZIKV using Vero cells.

Nikolay et al. previously suggested that Vero cells infected with ZIKV at low concentrations and maintained in suspension resulted in the production of large amounts of ZIKV ²⁶. This finding led us to utilize the suspension-infection method described in this report. Overall, ZIKV replication was comparable in both culturing methods. Interestingly, two RT-PCR -positive samples (FPI16318 and FPY00911) were only detected by the monolayer method, and two other RT-PCR-positive samples (FVM00251 and FHT01144) were only detected by the suspension method. Despite the discrepancies for these RT-PCR positive samples, it is likely that they do not pose a significant disadvantage for the culture methods since there is usually no need to culture RT-PCR positive samples in real and emergency situations. As described in previous research ³², these findings could be explained by differences in the analytical performance of each culturing method, as well as by factors related to the specimens or viral infectivity that were not evaluated here. Though, as expected, the cell suspension method provided several advantages: shorter time, reduced sample volume, and costs per sample. Interestingly, we detected lower infectious viral particle load in the three MOIs tested with the cell suspension method in comparison to the confluent cell monolayer on the third day post-infection, followed by an increase in viral load on the fourth day. This difference was not found when Ct values of both methods were compared, which indicates that RT-PCR assays can detect both non-infectious and infectious viruses while plaque assays detect only infectious particles. Therefore, media changes on the third day most likely favored viral replication as viral load increased on days 4 and 5.

We assessed the performance of the cell suspension method using a set of samples characterized by ZIKV-specific RT-PCR. Clinical samples were obtained from individuals who met the eligibility criteria and had symptoms (such as headache, myalgia) for 5 days or less. We found that there was no difference in the performance of the cell suspension method and the confluent cell monolayer for culturing the virus in the subset of ZIKV-positive samples. Clinical samples with viral loads below RT-PCR’s limit of detection or mutations in the primer- or probe-binding site may incorrectly classify cases as negative or inconclusive ³³^-³⁵. During the validation process, both isolation methods were able to detect ZIKV in two cases initially classified as negatives by a ZIKV-specific RT-PCR that had clinical symptoms compatible with Zika disease. This finding suggests that the analytical sensitivity of both isolation methods was comparable even in cases with nearly undetectable viral load by virus-specific molecular tools. Restricting the analysis to clinical samples with inconclusive results for detecting ZIKV, the cell suspension method was four times more sensitive in comparison to the monolayer method.

The cell suspension method was preliminary validated using clinical samples collected in four countries where active ZIKV transmission has been reported ¹³^,²⁴. The small number of clinical samples used in this study resulted in wide confidence intervals. Nevertheless, despite the small sample size, we were able to detect a substantial difference in the sensitivity between both culturing methods when the analysis was restricted to ZIKV-inconclusive samples, but comparable with ZIKV-positive and -negative samples. Hence, the use of the cell suspension method may favor the increase of the isolation rate, particularly in inconclusive cases of Zika infection by RT-PCR. The time to form the monolayer can be reduced if enough cells are planted, so no difference in time would exist between both isolation methods. Furthermore, since the suspension method requires changing the media, cross-contamination is possible, particularly in settings with limited resources. Finally, based on the study design, both methods required culturing the virus for up to 10 days, as well as follow-up to confirm identity of the virus. However, molecular detection of the virus could be performed even before 10 days using supernatants.

The epidemiological significance of ZIKV is undeniable and its impact on public health worldwide is an ongoing concern. Therefore, the relevance of developing and validating methodologies to investigate ZIKV in a rapid and efficient manner is of great importance ¹⁴^-¹⁶. Thus, the method described here could serve as an invaluable tool for the detection of ZIKV in existing surveillance systems as well as during outbreaks. Furthermore, the method could contribute to improve ZIKV prevention and control measures by allowing reliable and rapid detection, which would ultimately translate into early identification of cases and timely treatment. Moreover, it is important to highlight that this method has the potential to be used for the detection and isolation of other arboviruses (such as dengue virus, Chikungunya virus) and other pathogens of public health relevance. Similarly, future studies could optimize the preliminary validation described here, as well as expand the proof-of-concept technique using several different cell lines (such as A549, BHK, C6/36, among others) ¹⁸^,²⁵^,²⁶.

In conclusion, the cell suspension method has several advantages in comparison to the confluent cell monolayer method for detecting ZIKV. Our findings suggest that both culturing methods could be used interchangeably in confirmed cases of Zika disease with detectable viral load by RT-PCR. More importantly, the cell suspension method was four times more sensitive in detecting Zika in inconclusive cases by RT-PCR when compared to a confluent cell monolayer method. The development of this alternative tool, without needing a cell monolayer, could significantly improve the detection capabilities for ZIKV infections in urgent situations.

Acknowledgments.

Authors thank Alicia Rosas for the cell production, Zonia Rios for the quality control of laboratory procedures, and Jane Rios and Cecilia Rivera for IFI assays. Authors also thank Dr. Doris E. Gomez-Camargo, Dr. Margarita M. Ochoa-Diaz, Dr. Ivette Lorenzana, Dr. Guillermo Comach and Dr. Julia S. Ampuero and Peruvian health care workers from Iquitos and Yurimaguas for providing samples and supporting the cell suspension method development, standardization and validation. We are grateful to Dr. Andrea McCoy and Dr. Paul Graf for their feedback and critical opinion.

Funding Statement

Armed Forces Health Surveillance Division (AFHSD), Global Emerging Infections Surveillance (GEIS) Branch, ProMIS ID P0106_18_N6_01.

Funding.: This study was funded by the Armed Forces Health Surveillance Division (AFHSD), Global Emerging Infections Surveillance (GEIS) Branch, ProMIS ID P0106_18_N6_01. The funders had no role in study design, data collection and analysis, the decision to publish, or the preparation of the manuscript.

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Popuche D, Huaman A, Loyola S, Silva M, Jenkins S, Guevara C. Development and validation of a vero cell-based suspension method for the detection of Zika virus. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2023;40(3):297-306. doi: 10.17843/rpmesp.2023.403.12606.

References

1.Metsky HC, Matranga CB, Wohl S, Schaffner SF, Freije CA, Winnicki SM. Zika virus evolution and spread in the Americas. Nature. 2017;546(7658):411–415. doi: 10.1038/nature22402. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
2.Petersen E, Wilson ME, Touch S, McCloskey B, Mwaba P, Bates M. Rapid Spread of Zika Virus in The Americas--Implications for Public Health Preparedness for Mass Gatherings at the 2016 Brazil Olympic Games. Int J Infect Dis. 2016;44:11–15. doi: 10.1016/j.ijid.2016.02.001. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
3.Christofferson RC. Zika Virus Emergence and Expansion Lessons Learned from Dengue and Chikungunya May Not Provide All the Answers. Am J Trop Med Hyg. 2016;95(1):15–18. doi: 10.4269/ajtmh.15-0866. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
4.O'Reilly KM, Lowe R, Edmunds WJ, Mayaud P, Kucharski A, Eggo RM, et al. Projecting the end of the Zika virus epidemic in Latin America a modelling analysis. BMC Med. 2018;16(1):180–180. doi: 10.1186/s12916-018-1158-8. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
5.Talero-Gutiérrez C, Rivera-Molina A, Pérez-Pavajeau C, Ossa-Ospina I, Santos-García C, Rojas-Anaya MC. Zika virus epidemiology from Uganda to world pandemic, an update. Epidemiol Infect. 2018;146(6):673–679. doi: 10.1017/S0950268818000419. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
6.Lessler J, Chaisson LH, Kucirka LM, Bi Q, Grantz K, Salje H. Assessing the global threat from Zika virus. Science. 2016;353(6300):aaf8160–aaf8160. doi: 10.1126/science.aaf8160. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
7.Méndez N, Oviedo-Pastrana M, Mattar S, Caicedo-Castro I, Arrieta G. Zika virus disease, microcephaly and Guillain-Barré syndrome in Colombia epidemiological situation during 21 months of the Zika virus outbreak, 2015-2017. Arch Public Health. 2017;75:65–65. doi: 10.1186/s13690-017-0233-5. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
8.Rasmussen SA, Jamieson DJ. Teratogen update Zika virus and pregnancy. Birth Defects Res. 2020;112(15):1139–1149. doi: 10.1002/bdr2.1781. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
9.Barzon L, Percivalle E, Pacenti M, Rovida F, Zavattoni M, Del Bravo P. Virus and Antibody Dynamics in Travelers With Acute Zika Virus Infection. Clin Infect Dis. 2018;66(8):1173–1180. doi: 10.1093/cid/cix967. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
10.Moreira J, Peixoto TM, Siqueira AM, Lamas CC. Sexually acquired Zika virus a systematic review. Clin Microbiol Infect. 2017;23(5):296–305. doi: 10.1016/j.cmi.2016.12.027. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
11.Ngwe Tun MM, Moriuchi M, Toizumi M, Luvai E, Raini S, Kitamura N. Congenital Zika Virus Infection in a Birth Cohort in Vietnam, 2017-2018. Am J Trop Med Hyg. 2020;103(5):2059–2064. doi: 10.4269/ajtmh.20-0286. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
12.Beau F, Mallet HP, Lastère S, Broult J, Laperche S. Transfusion risk associated with recent arbovirus outbreaks in French Polynesia. Vox Sang. 2020;115(2):124–132. doi: 10.1111/vox.12855. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
13.Bayona-Pacheco B, Acosta-Reyes J, Navarro E, San-Juan H, Bula J, Baquero H. Seroprevalence of Zika virus among blood donors before the epidemic in Barranquilla, Colombia, 2015-2016. An Acad Bras Cienc. 2019;91(3):e20180860. doi: 10.1590/0001-3765201920180860. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
14.Wijesooriya SL, Nguyen CT, Nguyen TTT, Vu TBH, Taichiro T, Morita K. Long-term surveillance needed to detect Zika virus outbreaks in endemic regions. Lancet Infect Dis. 2020;20(2):168–169. doi: 10.1016/S1473-3099(19)30677-2. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
15.Charrel RN, Leparc-Goffart I, Pas S, de Lamballerie X, Koopmans M, Reusken C. Background review for diagnostic test development for Zika virus infection. Bull World Health Organ. 2016;94(8):574–584D. doi: 10.2471/BLT.16.171207. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
16.Martins MM, Medronho RA, Cunha AJLAD. Zika virus in Brazil and worldwide a narrative review. Paediatr Int Child Health. 2021;41(1):28–35. doi: 10.1080/20469047.2020.1776044. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
17.Forshey BM, Guevara C, Laguna-Torres VA, Cespedes M, Vargas J, Gianella A. Arboviral etiologies of acute febrile illnesses in Western South America, 2000-2007. PLoS Negl Trop Dis. 2010;4(8):e787. doi: 10.1371/journal.pntd.0000787. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
18.Bonaldo MC, Ribeiro IP, Lima NS, Dos Santos AA, Menezes LS, da Cruz SO. Isolation of Infective Zika Virus from Urine and Saliva of Patients in Brazil. PLoS Negl Trop Dis. 2016;10(6):e0004816. doi: 10.1371/journal.pntd.0004816. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
19.Timoney PJ, Geraghty VP, Harrington AM, Dillon PB. Microneutralization test in PK(15) cells for assay of antibodies to louping ill virus. J Clin Microbiol. 1984;20(1):128–130. doi: 10.1128/jcm.20.1.128-130.1984. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
20.Paz-Bailey G, Rosenberg ES, Doyle K, Munoz-Jordan J, Santiago GA, Klein L. Persistence of Zika Virus in Body Fluids - Final Report. N Engl J Med. 2017;379(13):1234–1243. doi: 10.1056/NEJMoa1613108. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
21.Faye O, Freire CC, Iamarino A, Faye O, de Oliveira JV, Diallo M. Molecular evolution of Zika virus during its emergence in the 20(th) century. PLoS Negl Trop Dis. 2014;8(1):e2636. doi: 10.1371/journal.pntd.0002636. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
22.Matsuzaki Y, Mizuta K, Takashita E, Okamoto M, Itagaki T, Katsushima F. Comparison of virus isolation using the Vero E6 cell line with real-time RT-PCR assay for the detection of human metapneumovirus. BMC Infect Dis. 2010;10:170–170. doi: 10.1186/1471-2334-10-170. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
23.Pyke AT, Moore PR, Hall-Mendelin S, McMahon JL, Harrower BJ, Constantino TR. Isolation of Zika Virus Imported from Tonga into Australia. PLoS Curr. 2016;8 doi: 10.1371/currents.outbreaks.849adc0ad16beec4536695281707f785. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
24.Weilg C, Troyes L, Villegas Z, Silva-Caso W, Mazulis F, Febres A. Detection of Zika virus infection among asymptomatic pregnant women in the North of Peru. BMC Res Notes. 2018;11(1):311–311. doi: 10.1186/s13104-018-3400-z. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
25.Himmelsbach K, Hildt E. Identification of various cell culture models for the study of Zika virus. World J Virol. 2018;7(1):10–20. doi: 10.5501/wjv.v7.i1.10. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
26.Nikolay A, Castilho LR, Reichl U, Genzel Y. Propagation of Brazilian Zika virus strains in static and suspension cultures using Vero and BHK cells. Vaccine. 2018;36(22):3140–3145. doi: 10.1016/j.vaccine.2017.03.018. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
27.Kim HJ, Kwon SR, Yuasa K. Establishing the optimal fetal bovine serum concentration to support replication of cyprinid herpesvirus 3 in CCB and KF-1 cell lines. J Virol Methods. 2020;276:113733–113733. doi: 10.1016/j.jviromet.2019.113733. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
28.Faye O, Faye O, Diallo D, Diallo M, Weidmann M, Sall AA. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 2013;10:311–311. doi: 10.1186/1743-422X-10-311. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
29.Juarez D, Long KC, Aguilar P, Kochel TJ, Halsey ES. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J Virol Methods. 2013;187(1):185–189. doi: 10.1016/j.jviromet.2012.09.026. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
30.Baer A, Kehn-Hall K. Viral concentration determination through plaque assays using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. 2014;(93):e52065. doi: 10.3791/52065. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
31.Medina FA, Torres G, Acevedo J, Fonseca S, Casiano L, De León-Rodríguez CM. Duration of the Presence of Infectious Zika Virus in Semen and Serum. J Infect Dis. 2019;219(1):31–40. doi: 10.1093/infdis/jiy462. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
32.Leland DS, Ginocchio CC. Role of cell culture for virus detection in the age of technology. Clin Microbiol Rev. 2007;20(1):49–78. doi: 10.1128/CMR.00002-06. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
33.Corman VM, Rasche A, Baronti C, Aldabbagh S, Cadar D, Reusken CB. Assay optimization for molecular detection of Zika virus. Bull World Health Organ. 2016;94(12):880–892. doi: 10.2471/BLT.16.175950. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
34.Drexler JF, de Souza Luna LK, Pedroso C, Pedral-Sampaio DB, Queiroz AT, Brites C, et al. Rates of and reasons for failure of commercial human immunodeficiency virus type 1 viral load assays in Brazil. J Clin Microbiol. 2007;45(6):2061–2063. doi: 10.1128/JCM.00136-07. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
35.Gourinat AC, O'Connor O, Calvez E, Goarant C, Dupont-Rouzeyrol M. Detection of Zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 2015;21(1):84–86. doi: 10.3201/eid2101.140894. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2023 Sep 25;40(3):297–306. [Article in Spanish]

Desarrollo y validación de un método de suspensión basado en células Vero para la detección del virus Zika

Dina Popuche ¹, Alfredo Huaman ¹, Steev Loyola ^2,³, María Silva ¹, Sarah A Jenkins ^1,⁴, Carolina Guevara ¹

¹U.S. Naval Medical Research Unit SOUTH, Lima, Perú

²Facultad de Medicina, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú

³Vysnova Partners Inc., Maryland, EE.UU

⁴Naval Medical Research Center, Silver Spring, EE.UU.

^✉

Correspondencia: Steev Loyola; steev.loyola@gmail.com

Contribuciones de autoría.: Todos los autores declaran que cumplen los criterios de autoría recomendados por el ICMJE.

Conflictos de interés.: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Las opiniones expresadas en este artículo pertenecen a los autores y no reflejan necesariamente la política oficial o la posición del Departamento de la Armada, el Departamento de Defensa, ni el Gobierno de EE.UU. Varios autores son empleados del gobierno de los Estados Unidos. Este trabajo se preparó como parte de sus funciones oficiales. El Título 17, U.S.C., §105 establece que la protección de los derechos de autor bajo este título no está disponible para ningún trabajo del Gobierno de los Estados Unidos. El Título 17, U.S.C., §101 define una obra del Gobierno de los EE.UU. como una obra preparada por un miembro del servicio militar o un empleado del Gobierno de los EE.UU. como parte de las funciones oficiales de esa persona.

Roles según CRediT.: DP: Conceptualización, Metodología, Investigación, Curación de datos. AH: Conceptualización, Metodología, Investigación, Curación de datos. SL: Conceptualización, Metodología, Software, Análisis formal, Investigación, Redacción - Borrador original, Visualización. MS: Validación, Recursos, Redacción - revisión y edición, Supervisión, Administración del proyecto, Obtención de fondos. SAJ: Validación, Recursos, Redacción - Revisión y edición, Supervisión, Administración del proyecto, Adquisición de fondos. CG: Conceptualización, Metodología, Validación, Investigación, Recursos, Redacción - Revisión y edición, Supervisión, Administración del proyecto, Adquisición de fondos.

Roles

Dina Popuche: Tecnólogo médico

Alfredo Huaman: enfermero naval

Steev Loyola: Tecnólogo médico, Magíster en Epidemiología

María Silva: Médico Veterinario, Doctora en Genética Molecular y Bioquímica

Sarah A Jenkins: Biólogo, Doctora en Ciencias Biomédicas

Carolina Guevara: Biólogo, Magíster en Microbiología

RESUMEN

Objetivo

. Desarrollar y validar un método de suspensión celular utilizando células Vero 76 para el cultivo del virus Zika (ZIKV) basado en la infección de células recién sembradas no adheridas.

Material y métodos

. Se utilizaron tres multiplicidades de infección diferentes del ZIKV para desarrollar y comparar este novedoso método con el método estándar de monocapa de células confluentes. Además, validamos preliminarmente el método de suspensión utilizando muestras clínicas caracterizadas como positivas o negativas para el ZIKV. El método estándar de monocapa se utilizó como método de referencia, y el aislamiento viral se confirmó mediante un RT-PCR específico del ZIKV. Se estimó la sensibilidad e intervalos de confianza del 95% para el método de suspensión. Asimismo, se realizó una comparación técnica del método de suspensión contra el método de monocapa.

Resultados

. Nuestros hallazgos sugieren que tanto la carga viral como la replicación del ZIKV fueron comparables entre los métodos de infección en monocapa y en suspensión. Aunque ambos métodos fueron adecuados para cultivar y aislar el ZIKV, el método de suspensión se caracterizó por ser más fácil, barato y rápido, así como una técnica de aislamiento sensible. En comparación con el método de monocapa, el método de suspensión fue cuatro veces más sensible en la detección del ZIKV en casos inconclusos por RT-PCR.

Conclusiones

. El método de suspensión tiene el potencial de ser un método eficaz para cultivar y aislar el ZIKV y su uso es potencialmente útil tanto en la investigación como en entornos clínicos.

Palabras clave: Zika Virus, Infección por el Virus Zika, Replicación Viral, Técnicas de Cultivo de Célula

INTRODUCCIÓN

El virus Zika (ZIKV) es un flavivirus emergente transmitido por el mosquito Aedes en varios países latinoamericanos ¹^,². Desde el 2015, múltiples países notificaron la transmisión autóctona del ZIKV, lo cual conllevó a graves brotes en América ³^-⁵. La infección por ZIKV causa manifestaciones clínicas en alrededor del 20% de los pacientes; inicio agudo de fiebre, erupciones maculopapulares, artralgia o conjuntivitis ³^,⁶. Tras la aparición del ZIKV en Brasil en 2015, la infección por el virus se asoció a un aumento significativo del número de bebés nacidos con microcefalia y defectos congénitos, así como a un aumento de enfermedades neurológicas en todos los grupos de edad, incluyendo mielitis y Guillain-Barré ⁷^,⁸. Diversos estudios han demostrado que el ZIKV puede transmitirse por vía sexual y por transfusión. Esta complejidad en los modos de transmisión plantea un desafío adicional, dado que las personas infectadas pueden no ser conscientes de su capacidad de transmitir el virus ⁹^-¹³. La declaración del ZIKV como emergencia por parte de la Organización Mundial de la Salud estableció que los países vulnerables a la emergencia del ZIKV deben establecer y mantener la capacidad de detectar y confirmar los casos de ZIKV, independientemente de si se detectan o no casos activos en regiones endémicas ¹⁴^-¹⁶.

Las pruebas diagnósticas de infecciones arbovirales tienen como objetivo detectar el virus o la respuesta inmune basada en los anticuerpos del huésped ¹⁷. Los ensayos serológicos son utilizados para detectar anticuerpos IgM contra el ZIKV y confirmar una infección reciente; no obstante, los resultados no siempre confirman la infección debido a falsos positivos generados por la reactividad cruzada entre flavivirus ¹⁸^,¹⁹. La detección del ZIKV se ha logrado mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa en tiempo real (RT-PCR) en suero, sangre, orina y otros fluidos corporales; sin embargo, el uso de herramientas de diagnóstico molecular puede ser afectado por la cinética de la viremia y las secuencias que detectan el ARN viral pueden no ser lo bastante específicas para detectar el virus ²⁰. Por ello, los resultados negativos o no concluyentes obtenidos en ensayos moleculares no implican necesariamente la ausencia de infección por ZIKV ¹⁶^,¹⁸^,²¹^,²².

Las técnicas de aislamiento viral mediante diversos cultivos celulares pueden desempeñar un papel importante en el diagnóstico cuando las muestras de casos clínicamente sospechosos son negativas o no concluyentes por RT-PCR. El aislamiento viral es especialmente sensible y útil para detectar virus circulantes durante la fase virémica de la infección y para clasificar correctamente muestras con resultados no concluyentes, pero presenta inconvenientes de uso en entornos de recursos limitados. Aunque el aislamiento del virus puede ser rentable y utilizarse para evaluar la cinética de las infecciones víricas y los resultados clínicos, la técnica requiere operadores altamente calificados y puede ser laboriosa ¹⁵^,¹⁷. El aislamiento del ZIKV puede ser comparativamente complejo ²⁰^,²³ debido a que este método depende de infraestructura y recursos específicos, procesos de cadena de frío para la preservación viral, laboratorios y suministros de cultivo celular, líneas celulares y personal capacitado y competente, los cuales no necesariamente están inmediatamente disponibles en países en desarrollo. Por lo tanto, la accesibilidad y precisión de los métodos de diagnóstico cobran gran importancia. En específico, existe una necesidad urgente de exámenes diagnósticos para ZIKV que sean confiables, especialmente para las poblaciones susceptibles en riesgo de infección por ZIKV, como las mujeres embarazadas y los bebés ⁷^,¹¹^,¹⁶^,²⁴.

El objetivo de este estudio fue encontrar un método de aislamiento que equilibre la necesidad crítica de precisión y la rápida detección del ZIKV, especialmente en situaciones de emergencia o brotes en las que se requiere detección y aislamiento temprano para el desarrollo o evaluación de diferentes pruebas diagnósticas. Por ejemplo, en situaciones de alta sospecha de infección por ZIKV con resultados de RT-PCR negativos o no concluyentes, se requieren métodos complementarios para detectar o aislar rápidamente el virus. En este sentido, los métodos de cultivo convencionales requieren de una monocapa previamente formada, lo que, dependiendo de la concentración de células sembradas, podría llevar entre 12 a 48 horas. Por ello, el desarrollo de métodos de aislamiento que permitan una respuesta casi inmediata sin necesidad de una monocapa previamente formada podría tener un impacto significativo en los tiempos de respuesta y podría incluso impulsar medidas de salud pública de forma temprana. Aquí describimos el desarrollo y la estandarización de un método de suspensión celular, así como su validación preliminar utilizando muestras clínicas humanas. Además, el método de suspensión celular se comparó con el método de monocapa celular confluente utilizando células Vero 76 para optimizar una técnica de aislamiento alternativa, precisa y rápida para la detección del ZIKV.

MENSAJES CLAVE

Motivación para realizar el estudio. Búsqueda y desarrollo de nuevas alternativas útiles en la investigación del virus del Zika (ZIKV) en situaciones de emergencia.

Principales hallazgos. Se desarrolló y validó un método novedoso para el aislamiento y cultivo del ZIKV basado en la infección de células Vero recién sembradas no adheridas. Este método se caracterizó por ser fácil, barato, rápido, y más sensible en comparación con el método estándar utilizado para el aislamiento de ZIKV.

Implicancias. El método desarrollado podría ser utilizado para fortalecer el diagnóstico y vigilancia pública, generando así resultados rápidos y confiables.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño de estudio

Estudio experimental basado en el diseño y validación de una prueba de concepto en dos fases; experimentos in vitro usando una semilla viral, y validación preliminar usando muestras clínicas. En ambas fases se usaron células Vero (Epitelio renal del mono verde africano [Chlorocebus]) obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; CRL-1587). Para la validación preliminar se utilizó un total de 29 muestras, las cuales fueron recolectadas en Honduras (códigos FHT, n=4), Colombia (códigos FCC, n=4), Venezuela (código FVM, n=1) y Perú (códigos FPI y FPY, n=20) por investigadores de la Unidad de Investigación Médica Naval SUR de EE.UU. Las muestras fueron obtenidas de individuos con fiebre de hasta cinco días y síntomas clínicos compatibles con la infección por Zika.

Cultivo celular para la inoculación del ZIKV

Vero 76 es una línea celular óptima para el aislamiento del ZIKV y también sirve para el desarrollo de vacunas víricas humanas y la investigación biomédica de enfermedades virales ¹⁸^,²⁵^,²⁶. Esta línea celular se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para el cultivo y aislamiento viral porque es susceptible a los flavivirus como el ZIKV y otros arbovirus. En todos los experimentos celulares se evaluó la viabilidad utilizando azul tripán en un hemocitómetro, obteniéndose valores entre el 90-95%. No se observaron diferencias en la viabilidad celular entre las células utilizadas en el método de monocapa de células confluentes o en el de suspensión celular.

Método de monocapa celular confluente

Las células Vero 76 fueron sembradas a una densidad de 1,0 x 10⁵ células/mL en frascos de cultivo T12.5 (Corning, Glendale, AZ, Estados Unidos; Nº de catálogo: 353018) utilizando 3 mL de medio esencial mínimo de Eagle (MEME) (Quality biological, Gaithersburg, MD, Estados Unidos; Nº de catálogo: 112-018-101) suplementado con 10% de suero bovino fetal (SBF) (Merck, Darmstadt, Alemania; Cat. No.: F4135) e incubado durante dos días a 37°C, 5% CO₂. La monocapa de dos días fue confluente a una densidad de 1,3 x 10⁶ células por frasco. Este método de cultivo estándar se utiliza rutinariamente para preparar células e intentar aislar ZIKV y otros arbovirus.

Método de suspensión celular

El día de la inoculación con ZIKV, se sembraron células Vero 76 en placas de cultivo de 12 pozos (Thermo Fisher, Cleveland, OH, Estados Unidos; Nº de cat.: 150628) utilizando 1mL de MEME suplementado con 10% de SBF a una densidad de 2,0 x 10⁵ células/mL. Para facilitar la estabilización del pH, antes de la inoculación, las células fueron incubadas durante 30 minutos a 37°C, 5% CO₂. Este método se diseñó para eliminar el tiempo de incubación necesario para preparar una monocapa celular confluente y con el fin de tener un tiempo de respuesta más rápido para las pruebas del ZIKV. Sin embargo, es importante mencionar que, a medida que transcurre el tiempo de incubación, las células proliferan y tienden a formar una monocapa. Las placas de cultivo de 12 pozos fueron seleccionadas porque permiten maximizar el uso de células y reactivos por muestra, y porque permiten la inoculación de múltiples muestras por placa.

Inoculación del virus y seguimiento

La infección viral para ambos métodos se llevó a cabo utilizando una semilla viral de ZIKV aislada en células Vero 76, la cual fue obtenida a partir de una muestra de suero aguda colectada de un caso de Zika en Iquitos, Perú. Para evaluar la replicación viral e inocular el virus en células Vero 76, se prepararon tres multiplicidades de infección (MDI) de 0,1; 0,01; y 0,001 en MEME sin SBF. Los cultivos celulares sin inóculo viral fueron utilizados como controles negativos.

Método de infección en monocapa

Después de dos días, el sobrenadante de las células Vero se desechó utilizando una técnica estéril. A continuación, se inocularon las células con 0,2 mL de cada MDI de ZIKV por duplicado. Los frascos se agitaron manual y suavemente de un lado a otro cinco veces y se incubaron durante 1 hora a 37°C en 5% de CO₂. Después, se añadió 3 mL de MEME suplementado con 2% de SBF a cada cultivo, y se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente. Para este método, no se realizaron cambios de medio después de la infección con el inóculo viral, por lo que la incubación fue continua.

Método de infección en suspensión

La infección se produjo en células que fueron recientemente sembradas y no totalmente adheridas a las placas de cultivo. Este método se estandarizó inoculando 0,1 mL por duplicado de cada una de las tres MDI directamente en cada cultivo de células Vero, los cuales fueron incubados durante tres días a 37°C en 5% de CO₂. Un estudio previo sugirió que, independientemente del título viral utilizado para la infección, la ausencia de SBF se correlaciona con altas tasas de replicación viral ²⁷. Por tanto, para evitar el agotamiento de los componentes del medio, al tercer día se retiró cuidadosamente el medio con una pipeta de 1 mL sin alterar la monocapa, y se sustituyó con 1 mL de MEME nuevo sin SBF. Luego, los cultivos se colocaron en la incubadora a 37°C con un 5% de CO₂.

Seguimiento

Los cultivos de células Vero inoculados con ZIKV fueron observados diariamente para detectar efectos citopáticos (ECP), y se colectaron 200 µL de sobrenadante de cada cultivo inoculado para su posterior análisis molecular y por el ensayo de placa viral. Los cultivos se cosecharon cuando las células mostraron >75% (3+) de ECP o hasta 10 días después de la inoculación.

Ensayo molecular

Se extrajo ARN viral utilizando 140 µL de cada sobrenadante recolectado diariamente de células Vero infectadas con ZIKV a partir del día 0 hasta el momento del desarrollo de ECP o hasta 10 días después de la inoculación. La extracción se realizó utilizando el kit QIAamp Viral RNA (Qiagen, Hilden, Alemania, Cat. No.: 52904) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La detección del ARN del ZIKV se realizó utilizando cebadores y sondas, así como condiciones de ciclado previamente descritos ²⁸. La mezcla de reacción para la RT-PCR de un paso se preparó utilizando Fast Virus 1-step (Thermo Fisher, Cleveland, OH, Estados Unidos; Nº de cat.: 4444436), y la amplificación se realizó en el instrumento Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR (Thermo Fisher, Cleveland, OH, Estados Unidos; Nº de cat.: 4406984). El límite de detección del ensayo RT-PCR para ZIKV ha sido previamente descrito en el umbral de ciclo (Ct) de 36,2 ± 1,6 ²⁸. En este estudio, las muestras de suero o sangre con un valor Ct inferior o igual al valor de corte fueron clasificadas como positivas (Ct ≤ 34,6), mientras que aquellas sin señal de amplificación fueron clasificadas como negativas. Las muestras con una señal de amplificación tardía (Ct > 34,6) fueron clasificadas como no concluyentes. Los valores de Ct fueron registrados y utilizados como referencia de la carga viral .

Ensayo de placa viral

Las células A549 y Vero son susceptibles a la infección por ZIKV, dando lugar al ECP ²⁵. En experimentos previos realizados en nuestro laboratorio, no hemos observado diferencias significativas en la carga de ZIKV al comparar los recuentos de unidades formadoras de placas en células Vero y A549 utilizando el método semisólido de ensayo de placa viral ²⁹. Sin embargo, observamos que la mayoría de las placas se formaban mejor en las células A549 al tercer día de la infección en comparación con las células Vero (Figura 1). El método semisólido fue ejecutado preparando una suspensión de células A549 en placas de 12 pozos a una densidad de 2,0 x 10⁵ células/mL por pozo. Los cultivos celulares se colocaron en la incubadora durante 30 minutos a 37°C y 5% de CO₂. Las muestras de sobrenadante celular se analizaron en placas de cultivo de 12 pozos, tal como ha sido previamente descrito ³⁰. Seis diluciones 1/10 fueron preparadas utilizando 100 µL de cada muestra de sobrenadante, y luego se inocularon en los cultivos por duplicado. Después de tres horas de incubación en las mismas condiciones descritas anteriormente, se añadió 1 mL de carboximetilcelulosa al 3% a cada cultivo, y luego, se incubó durante tres días. Las células se tiñeron utilizando 3 mL de una solución compuesta por acetato de sodio anhidro, negro azul de naftol y ácido acético. Las unidades formadoras de placa (UFP) fueron contabilizadas, y se utilizaron para estimar las UFP por mL (UFP/mL) y determinar el título viral infeccioso.

Validación del método de infección en suspensión celular

Se utilizaron 29 muestras de sueros agudos para validar el método de suspensión celular. Este conjunto de especímenes incluyó 15 muestras positivas para ZIKV, 12 muestras inconclusas para ZIKV y 2 muestras presuntamente negativas para ZIKV según lo determinado por RT-PCR ²⁸. Las muestras inconclusas se incluyeron en la validación bajo el supuesto de que la amplificación tardía (39,0 > Ct > 34,6) observada en la RT-PCR estaba asociada a una carga viral baja y que la propagación en cultivo celular podría ayudar posteriormente a clasificar la muestra como positiva o negativa. Las dos muestras negativas se incluyeron porque mostraban un pequeño patrón de amplificación cercano a los 40 ciclos. Las muestras de sangre se recogieron de participantes durante la fase aguda de la enfermedad febril, los cuales manifestaron síntomas clínicos compatibles con la infección por Zika. Las muestras recolectadas fueron centrifugadas para separar el suero y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Las muestras de suero descongeladas se diluyeron 1/10 utilizando MEME sin SBF, y la infección se llevó a cabo en duplicados en los métodos de infección por suspensión celular e infección por monocapa confluente, tal y como se describe líneas arriba.

Análisis estadístico

Los valores de las UFP/mL se transformaron a log₁₀ (UFP/mL). Los valores de Ct y log₁₀ (UFP/mL) fueron utilizados de forma independiente para evaluar la cinética de la replicación viral en el método de monocapa de células confluentes y de suspensión celular con las tres MDI. Se realizaron pruebas de Mann-Whitney utilizando los valores Ct y log₁₀ (UFP/mL) por día sin tener en cuenta el inóculo de cada MDI para explorar diferencias entre los métodos. En la validación, exploramos las diferencias en el día de cosecha utilizando una prueba T pareada. La sensibilidad e intervalos de confianza al 95% (IC95%) para ambos modelos de infección fueron estimados considerando el ensayo molecular como la referencia. El análisis de los datos se realizó utilizando Stata v16.0 (StataCorp. 2015. Stata Statistical Software: Release 14. College Station, TX: StataCorp LP.; licenciado por la Universidad Peruana Cayetano Heredia) y considerando p<0,05 como significativo.

Aspectos éticos

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los protocolos de estudio NMRCD.2010.0010 y NAMRU6.2020.004 fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Unidad de Investigación Médica Naval SUR de EE.UU. en cumplimiento de todas las normativas federales y locales aplicables que rigen la protección de los seres humanos. El primer protocolo permitió la recolección de muestras de individuos que emitieron consentimiento informado para la investigación de arbovirus, mientras que el segundo protocolo permitió la utilización de muestras anonimizadas para el desarrollo y validación de pruebas desarrolladas en el laboratorio.

RESULTADOS

Análisis técnico

En la Tabla 1 se comparan los métodos de cultivo del ZIKV en monocapa de células confluentes y de células en suspensión. En específico, el método de suspensión no requirió el cultivo de una monocapa confluente de 2 días; ahorrando así tiempo (48 horas) en el proceso. Interesantemente, al día 2 después de la infección se observó una monocapa celular completa en todos los experimentos realizados para el método de infección por suspensión. El método de suspensión requirió menos medio, menos volumen de muestra y permitió analizar múltiples muestras (cinco veces más, y por duplicados en comparación al de monocapa) simultáneamente. El método de suspensión también fue 2,7 veces menos costoso que el método de monocapa, lo que resulta favorable en laboratorios con recursos limitados (Tabla 1). En la Figura 2, se muestra una representación gráfica del proceso de cultivo e inoculación del método de suspensión.

Tabla 1. Comparación técnica del método de monocapa celular frente al de suspensión celular para la detección del ZIKV.

Características		Monocapa	Suspensión
Materiales
	Soporte	Frasco de cultivo T12.5	Placa de cultivo de 12 pozos
	Medio por muestra antes de la infección (mL)	3	0
	Medio por muestra tras la infección (mL)	3	2
Tiempo de cultivo celular
	Antes de la infección (horas)	48 ^a	0
Muestra
	Volumen necesario (mL) ^b	0,2	0,1
	N° de muestras en paralelo	1 por frasco	5 a 11 por placa de 12 pozos ^c
Costo por 5 muestras (USD) ^d
	Total	10,73	4,03

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La monocapa puede formarse en cuestión de horas si se siembran suficientes células, por lo que es posible reducir el tiempo de formación de la monocapa. ^b El volumen indicado no incluye el duplicado. Si se realiza un duplicado del método de la monocapa, se requiere un frasco de cultivo adicional, mientras que las placas de 12 pozos podrían permitir hasta 5 muestras por duplicado. ^c Cinco muestras por duplicado u 11 muestras sin duplicados, incluido un control de células. ^d Los precios se revisaron en julio de 2022. No se tuvieron en cuenta los costos asociados a los equipos de protección y salarios.

Desarrollo y estandarización

La infecciosidad del ZIKV se demostró mediante observaciones diarias del ECP, la cual fue comparable en ambos métodos de aislamiento durante el proceso de estandarización. Los sobrenadantes de ambos métodos se cosecharon al día 4 después de la infección para la MDI de 0,1 y 0,01, y al día 5 para la MDI de 0,001. Independientemente de la cinética de replicación viral, el ZIKV se replicó tanto en el método de suspensión celular como en el de monocapa celular. La replicación del ZIKV se evaluó mediante RT-PCR y el ensayo de placa viral.

Los valores de Ct en el sobrenadante se compararon diariamente para cada método con el fin de evaluar la cantidad de partículas virales producidas. En general, no se detectaron diferencias en el número total de partículas virales entre los métodos y las diferentes MDI (Figura 3).

El análisis de los valores log₁₀ (UFP/mL) estimados por el ensayo de placas virales no mostró diferencias para las cargas de partículas virales infecciosas hasta el tercer día posterior a la infección (Figura 4). El número de partículas virales infecciosas fue inferior para el método de suspensión celular en comparación al método de monocapa celular confluente al día 3, antes de que se cambiara el medio (p=0,049, 3dpi, Figura 4). Después de cambiar el medio, la carga de partículas infecciosas fue comparable entre los métodos en todas las MDI (Figura 4).

Validación del método de infección con células en suspensión

Se utilizó un total de 29 muestras de suero de casos febriles para evaluar el rendimiento del método de suspensión celular (Tabla 2). En general, no se observaron diferencias (p=0,243) en el día de cosecha entre el método de monocapa (9,2 ± 1,3 días) y el de suspensión celular (9,6 ± 1,1 días), ni entre las muestras de suero positivas (p=0,403) o no concluyentes para ZIKV (p=0,166). La sensibilidad en muestras positivas a ZIKV fue del 40,0% (6/15, IC95%: 16,3% - 67,7%) para ambos métodos, pero el método de suspensión dio lugar a valores Ct más bajos en el día de la cosecha. Interesantemente, dos casos de Zika fueron positivos con el método de monocapa pero negativos con el método de suspensión celular, y otros dos casos fueron negativos con el método de monocapa pero positivos con el método de suspensión. Entre las muestras no concluyentes para ZIKV, la sensibilidad fue del 8,3% (1/12, IC95%: 0,2% - 38,5%) para el método de monocapa y del 33,3% (4/12, IC95%: 9,9% - 65,1%) para el método de suspensión celular. Ambos métodos de aislamiento fueron capaces de detectar el ZIKV en las dos muestras de suero presuntamente negativas por RT-PCR.

Tabla 2. Resultados de la validación del método de infección en suspensión de células.

Código de muestra		Valor de Ct en suero/sangre	Día de cosecha		Valores de Ct en el sobrenadante ^a
Código de muestra		Valor de Ct en suero/sangre	Monocapa	Suspensión	Monocapa	Suspensión
Suero positivo por RT-PCR (n=15) ^b
	FHT01120	26,5	7	6	12,6	12,6
	FPI15198	20,9	7	6	15,9	15
	FPI15263	20,3	10	8	22,8	19,2
	FCC00093	28,5	8	8	20,2	16,3
	FPI16318	21,8	10	10	22,1	Negativo
	FPY00911	23,9	7	10	26,4	Negativo
	FVM00251	25,7	10	10	Negativo	30,9
	FHT01144	29,6	7	10	Negativo	17,6
	FCC00110	27,1	10	10	Negativo	Negativo
	FHT01166	24,4	10	10	Negativo	Negativo
	FPI15173	22,4	10	10	Negativo	Negativo
	FPI15283	25,1	10	10	Negativo	Negativo
	FPI15452	23,8	10	10	Negativo	Negativo
	FHT01166	24,4	10	10	Negativo	Negativo
	FPI15263	20,3	7	10	Negativo	Negativo
Suero no concluyente por RT-PCR (n=12) ^c
	FPI16332	35,9	10	10	24,3	20,4
	FCC00100	36,1	7	10	Negativo	33,1
	FPI16096	38,3	10	10	Negativo	19,8
	FPY00920	37,2	10	10	Negativo	33,7
	FCC00087	35,2	7	10	Negativo	Negativo
	FPI15509	37,3	10	10	Negativo	Negativo
	FPI15698	35,9	10	10	Negativo	Negativo
	FPI16402	37,1	10	10	Negativo	Negativo
	FPY00937	36,4	10	10	Negativo	Negativo
	FPI16290	37,8	10	10	Negativo	Negativo
	FPY00925	38,1	10	10	Negativo	Negativo
	FPI15575	31,9	10	10	Negativo	Negativo
Suero negativo por RT-PCR (n=2) ^d
	FPI15718	39,8	10	10	29,5	28,1
	FPI16191	39,7	10	10	28,5	27,8

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La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa en tiempo real (RT-PCR) se realizó en sobrenadantes el día de la recolección, y el umbral de ciclo (Ct) de los duplicados se resumió utilizando medias (la desviación estándar entre duplicados varió entre 0,31 y 0,07). ^b Los valores de Ct oscilaron entre 20,3 y 29,6. ^c Los valores de Ct de las muestras de suero/sangre clasificadas como no concluyentes (Ct>34,6) oscilaron entre 35,2 y 38,3. ^d Las muestras de suero/sangre fueron clasificadas como negativas por valores de Ct muy cercanos a los 40 ciclos totales de amplificación.

DISCUSIÓN

El método de aislamiento es una parte importante de la investigación del ZIKV. No obstante, varios investigadores han informado de intentos fallidos para aislar el virus al trabajar con fluidos corporales humanos positivos por RT-PCR debido al tiempo de recolección de la muestra tras la aparición de los síntomas y a la carga viral ⁹^,²²^,³¹. Existe la necesidad de mejorar y desarrollar métodos de cultivo viral rentables que proporcionen evidencia y permitan evaluar la cinética de virus infecciosos en fluidos corporales ¹⁸^,²⁰. Aquí informamos del desarrollo y estandarización, así como de la validación preliminar de un método de suspensión celular para ZIKV utilizando células Vero.

Nikolay et al. sugirieron previamente que las células Vero infectadas con ZIKV a bajas concentraciones y mantenidas en suspensión daban lugar a la producción de grandes cantidades de ZIKV ²⁶. Este hallazgo nos llevó a utilizar el método de infección en suspensión descrito en este documento. En general, la replicación del ZIKV fue comparable en ambos métodos de cultivo. Interesantemente, dos muestras positivas por RT-PCR (FPI16318 y FPY00911) sólo fueron detectadas por el método de monocapa, y otras dos muestras también positivas por RT-PCR (FVM00251 y FHT01144) sólo se detectaron con el método de suspensión. A pesar de las discrepancias observadas para estas muestras positivas por RT-PCR, es probable que el hallazgo no suponga una desventaja significativa para los métodos de cultivo evaluados, dado que, en condiciones reales y de emergencia, normalmente no hay necesidad de cultivar muestras positivas por RT-PCR. Tal como fue previamente descrito ³², estos resultados podrían explicarse por diferencias en el rendimiento analítico de cada método de cultivo, así como por factores relacionados a las muestras o la infectividad viral; los cuales no fueron evaluados aquí. Aunque, como era de esperar, el método de suspensión celular ofrece múltiples ventajas: menor tiempo, menor volumen de muestra y menor costo por muestra. Interesantemente, detectamos una menor carga de partículas virales infecciosas en las tres MDI probadas en el método de suspensión celular en comparación con la monocapa celular confluente al tercer día posterior a la infección, seguido de un aumento de la carga viral al cuarto día. Esta diferencia no fue observada al comparar los valores Ct de ambos métodos, lo cual confirma que el RT-PCR puede detectar tanto virus no infeccioso como infeccioso, mientras que el ensayo de placa viral sólo detecta partículas infecciosas. Por tanto, lo más probable es que los cambios de medio al tercer día favorezcan la replicación viral, puesto que la carga viral aumentó al día 4 y 5.

El rendimiento del método de suspensión celular fue evaluado utilizando un conjunto de muestras caracterizadas por un RT-PCR específico para detectar ZIKV. Las muestras clínicas se obtuvieron de individuos que cumplían los criterios de elegibilidad y presentaban síntomas (como fiebre, dolor de cabeza, mialgia) durante 5 días o menos. Encontramos que, en el subconjunto de muestras positivas para ZIKV, no hubo diferencia en el rendimiento del método de suspensión celular y el monocapa de células confluentes para cultivar el virus. Las muestras clínicas con cargas virales por debajo del límite de detección del RT-PCR o mutaciones en el sitio de unión del cebador o la sonda pueden resultar en la clasificación incorrecta de casos negativos o no concluyentes ³³^-³⁵. En la validación, ambos métodos de aislamiento pudieron detectar ZIKV en dos casos clasificados inicialmente como negativos por el RT-PCR específico para ZIKV, los cuales presentaban síntomas clínicos compatibles con la enfermedad del Zika. Este hallazgo sugiere que la sensibilidad analítica de ambos métodos de aislamiento fue comparable incluso en casos con carga viral casi indetectable por herramientas moleculares que específicamente detectan el virus. Restringiendo el análisis a las muestras clínicas con resultados no concluyentes para la detección del ZIKV, el método de suspensión celular fue cuatro veces más sensible en comparación al método de monocapa.

El método de suspensión celular se validó de forma preliminar utilizando muestras clínicas recolectadas en cuatro países en los que se había notificado transmisión activa del ZIKV ¹³^,²⁴. El reducido número de muestras clínicas utilizadas en este estudio dio lugar a amplios intervalos de confianza. No obstante, a pesar del pequeño tamaño de la muestra, pudimos detectar una diferencia sustancial en la sensibilidad entre ambos métodos de cultivo cuando el análisis se restringió a muestras no concluyentes para ZIKV, pero comparable con muestras positivas y negativas para ZIKV. Por lo tanto, el uso del método de suspensión celular puede favorecer el aumento de la tasa de aislamiento, específicamente en casos no concluyentes de infección por Zika mediante RT-PCR. Por otro lado, el tiempo para formar la monocapa puede reducirse si se siembran suficientes células, por lo que podría no existir diferencia de tiempo entre ambos métodos de aislamiento. Además, dado que el método de suspensión requiere cambiar los medios, es posible que se produzca contaminación cruzada, especialmente en entornos con pocos recursos. Por último, según el diseño del estudio, ambos métodos requirieron del cultivo del virus durante un máximo de 10 días y realizar estudios de seguimiento para confirmar la presencia del virus. Sin embargo, la detección molecular del virus podría realizarse incluso antes de los 10 días utilizando sobrenadantes.

La importancia epidemiológica del ZIKV es innegable y su impacto en la salud pública mundial es una preocupación constante. Por lo tanto, la relevancia de desarrollar y validar metodologías para investigar el ZIKV de manera rápida y eficiente es de gran importancia ¹⁴^-¹⁶^). Así, el método descrito aquí podría servir como una herramienta invaluable para la detección de ZIKV en los sistemas de vigilancia existentes, así como en la respuesta a brotes. Además, el método podría contribuir a diversos esfuerzos de prevención y control del ZIKV al proporcionar detecciones fiables y rápidas, que en última instancia se traducen en la identificación temprana de casos y de tratamiento oportuno. Además, es importante destacar que el método descrito tiene potencial de ser utilizado en la detección y aislamiento de otros arbovirus (como el virus del dengue, el virus Chikungunya) y otros patógenos de relevancia para la salud pública. Del mismo modo, futuros estudios podrían optimizar la validación preliminar aquí descrita, así como ampliar la prueba de concepto utilizando líneas celulares diferentes (como A549, BHK, C6/36, entre otras) ¹⁸^,²⁵^,²⁶.

En conclusión, el método de suspensión celular tiene múltiples ventajas en comparación con el método de monocapa celular confluente para detectar el ZIKV. Nuestros hallazgos sugieren que ambos métodos de cultivo podrían utilizarse indistintamente en casos confirmados de enfermedad por Zika con carga viral detectable mediante RT-PCR. Más importante aún, en comparación con el método de monocapa de células confluentes, el método de suspensión celular fue cuatro veces más sensible en la detección del Zika en casos no concluyentes por RT-PCR. El desarrollo de esta herramienta alternativa, que no requiere de una monocapa celular, mejorará significativamente las capacidades de detección de infecciones por ZIKV en situaciones de emergencia.

Agradecimientos.

Los autores agradecen a Alicia Rosas por la producción de células, a Zonia Ríos por el control de calidad de los procedimientos de laboratorio, y a Jane Ríos y Cecilia Rivera por los ensayos de IFI. Los autores también agradecen a la Dra. Doris E. Gómez-Camargo, la Dra. Margarita M. Ochoa-Díaz, la Dra. Ivette Lorenzana, el Dr. Guillermo Comach y la Dra. Julia S. Ampuero, y a los trabajadores de la salud peruanos de Iquitos y Yurimaguas por proporcionar muestras y apoyar el desarrollo, estandarización y validación del método de suspensión celular. Agradecemos a la Dra. Andrea McCoy y al Dr. Paul Graf por sus comentarios y opinión crítica.

Financiamiento.: Este estudio fue financiado por la División de Vigilancia Sanitaria de las Fuerzas Armadas (Armed Forces Health Surveillance Division; AFHSD), Subdivisión de Vigilancia de Infecciones Emergentes Mundiales (Global Emerging Infections Surveillance; GEIS), ProMIS ID P0106_18_N6_01. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos y análisis, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.

Citar como: Popuche D, Huaman A, Loyola S, Silva M, Jenkins S, Guevara C. Desarrollo y validación de un método de suspensión basado en células Vero para la detección del virus Zika. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2023;40(3):297-306. doi: 10.17843/rpmesp.2023.403.12606.

[B1] 1.Metsky HC, Matranga CB, Wohl S, Schaffner SF, Freije CA, Winnicki SM. Zika virus evolution and spread in the Americas. Nature. 2017;546(7658):411–415. doi: 10.1038/nature22402. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B2] 2.Petersen E, Wilson ME, Touch S, McCloskey B, Mwaba P, Bates M. Rapid Spread of Zika Virus in The Americas--Implications for Public Health Preparedness for Mass Gatherings at the 2016 Brazil Olympic Games. Int J Infect Dis. 2016;44:11–15. doi: 10.1016/j.ijid.2016.02.001. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B3] 3.Christofferson RC. Zika Virus Emergence and Expansion Lessons Learned from Dengue and Chikungunya May Not Provide All the Answers. Am J Trop Med Hyg. 2016;95(1):15–18. doi: 10.4269/ajtmh.15-0866. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B4] 4.O'Reilly KM, Lowe R, Edmunds WJ, Mayaud P, Kucharski A, Eggo RM, et al. Projecting the end of the Zika virus epidemic in Latin America a modelling analysis. BMC Med. 2018;16(1):180–180. doi: 10.1186/s12916-018-1158-8. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B5] 5.Talero-Gutiérrez C, Rivera-Molina A, Pérez-Pavajeau C, Ossa-Ospina I, Santos-García C, Rojas-Anaya MC. Zika virus epidemiology from Uganda to world pandemic, an update. Epidemiol Infect. 2018;146(6):673–679. doi: 10.1017/S0950268818000419. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B6] 6.Lessler J, Chaisson LH, Kucirka LM, Bi Q, Grantz K, Salje H. Assessing the global threat from Zika virus. Science. 2016;353(6300):aaf8160–aaf8160. doi: 10.1126/science.aaf8160. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B7] 7.Méndez N, Oviedo-Pastrana M, Mattar S, Caicedo-Castro I, Arrieta G. Zika virus disease, microcephaly and Guillain-Barré syndrome in Colombia epidemiological situation during 21 months of the Zika virus outbreak, 2015-2017. Arch Public Health. 2017;75:65–65. doi: 10.1186/s13690-017-0233-5. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B8] 8.Rasmussen SA, Jamieson DJ. Teratogen update Zika virus and pregnancy. Birth Defects Res. 2020;112(15):1139–1149. doi: 10.1002/bdr2.1781. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B9] 9.Barzon L, Percivalle E, Pacenti M, Rovida F, Zavattoni M, Del Bravo P. Virus and Antibody Dynamics in Travelers With Acute Zika Virus Infection. Clin Infect Dis. 2018;66(8):1173–1180. doi: 10.1093/cid/cix967. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B10] 10.Moreira J, Peixoto TM, Siqueira AM, Lamas CC. Sexually acquired Zika virus a systematic review. Clin Microbiol Infect. 2017;23(5):296–305. doi: 10.1016/j.cmi.2016.12.027. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B11] 11.Ngwe Tun MM, Moriuchi M, Toizumi M, Luvai E, Raini S, Kitamura N. Congenital Zika Virus Infection in a Birth Cohort in Vietnam, 2017-2018. Am J Trop Med Hyg. 2020;103(5):2059–2064. doi: 10.4269/ajtmh.20-0286. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B12] 12.Beau F, Mallet HP, Lastère S, Broult J, Laperche S. Transfusion risk associated with recent arbovirus outbreaks in French Polynesia. Vox Sang. 2020;115(2):124–132. doi: 10.1111/vox.12855. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B13] 13.Bayona-Pacheco B, Acosta-Reyes J, Navarro E, San-Juan H, Bula J, Baquero H. Seroprevalence of Zika virus among blood donors before the epidemic in Barranquilla, Colombia, 2015-2016. An Acad Bras Cienc. 2019;91(3):e20180860. doi: 10.1590/0001-3765201920180860. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B14] 14.Wijesooriya SL, Nguyen CT, Nguyen TTT, Vu TBH, Taichiro T, Morita K. Long-term surveillance needed to detect Zika virus outbreaks in endemic regions. Lancet Infect Dis. 2020;20(2):168–169. doi: 10.1016/S1473-3099(19)30677-2. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B15] 15.Charrel RN, Leparc-Goffart I, Pas S, de Lamballerie X, Koopmans M, Reusken C. Background review for diagnostic test development for Zika virus infection. Bull World Health Organ. 2016;94(8):574–584D. doi: 10.2471/BLT.16.171207. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B16] 16.Martins MM, Medronho RA, Cunha AJLAD. Zika virus in Brazil and worldwide a narrative review. Paediatr Int Child Health. 2021;41(1):28–35. doi: 10.1080/20469047.2020.1776044. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B17] 17.Forshey BM, Guevara C, Laguna-Torres VA, Cespedes M, Vargas J, Gianella A. Arboviral etiologies of acute febrile illnesses in Western South America, 2000-2007. PLoS Negl Trop Dis. 2010;4(8):e787. doi: 10.1371/journal.pntd.0000787. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B18] 18.Bonaldo MC, Ribeiro IP, Lima NS, Dos Santos AA, Menezes LS, da Cruz SO. Isolation of Infective Zika Virus from Urine and Saliva of Patients in Brazil. PLoS Negl Trop Dis. 2016;10(6):e0004816. doi: 10.1371/journal.pntd.0004816. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B19] 19.Timoney PJ, Geraghty VP, Harrington AM, Dillon PB. Microneutralization test in PK(15) cells for assay of antibodies to louping ill virus. J Clin Microbiol. 1984;20(1):128–130. doi: 10.1128/jcm.20.1.128-130.1984. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B20] 20.Paz-Bailey G, Rosenberg ES, Doyle K, Munoz-Jordan J, Santiago GA, Klein L. Persistence of Zika Virus in Body Fluids - Final Report. N Engl J Med. 2017;379(13):1234–1243. doi: 10.1056/NEJMoa1613108. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B21] 21.Faye O, Freire CC, Iamarino A, Faye O, de Oliveira JV, Diallo M. Molecular evolution of Zika virus during its emergence in the 20(th) century. PLoS Negl Trop Dis. 2014;8(1):e2636. doi: 10.1371/journal.pntd.0002636. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B22] 22.Matsuzaki Y, Mizuta K, Takashita E, Okamoto M, Itagaki T, Katsushima F. Comparison of virus isolation using the Vero E6 cell line with real-time RT-PCR assay for the detection of human metapneumovirus. BMC Infect Dis. 2010;10:170–170. doi: 10.1186/1471-2334-10-170. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B23] 23.Pyke AT, Moore PR, Hall-Mendelin S, McMahon JL, Harrower BJ, Constantino TR. Isolation of Zika Virus Imported from Tonga into Australia. PLoS Curr. 2016;8 doi: 10.1371/currents.outbreaks.849adc0ad16beec4536695281707f785. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B24] 24.Weilg C, Troyes L, Villegas Z, Silva-Caso W, Mazulis F, Febres A. Detection of Zika virus infection among asymptomatic pregnant women in the North of Peru. BMC Res Notes. 2018;11(1):311–311. doi: 10.1186/s13104-018-3400-z. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B25] 25.Himmelsbach K, Hildt E. Identification of various cell culture models for the study of Zika virus. World J Virol. 2018;7(1):10–20. doi: 10.5501/wjv.v7.i1.10. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B26] 26.Nikolay A, Castilho LR, Reichl U, Genzel Y. Propagation of Brazilian Zika virus strains in static and suspension cultures using Vero and BHK cells. Vaccine. 2018;36(22):3140–3145. doi: 10.1016/j.vaccine.2017.03.018. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B27] 27.Kim HJ, Kwon SR, Yuasa K. Establishing the optimal fetal bovine serum concentration to support replication of cyprinid herpesvirus 3 in CCB and KF-1 cell lines. J Virol Methods. 2020;276:113733–113733. doi: 10.1016/j.jviromet.2019.113733. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B28] 28.Faye O, Faye O, Diallo D, Diallo M, Weidmann M, Sall AA. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 2013;10:311–311. doi: 10.1186/1743-422X-10-311. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B29] 29.Juarez D, Long KC, Aguilar P, Kochel TJ, Halsey ES. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J Virol Methods. 2013;187(1):185–189. doi: 10.1016/j.jviromet.2012.09.026. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B30] 30.Baer A, Kehn-Hall K. Viral concentration determination through plaque assays using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. 2014;(93):e52065. doi: 10.3791/52065. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B31] 31.Medina FA, Torres G, Acevedo J, Fonseca S, Casiano L, De León-Rodríguez CM. Duration of the Presence of Infectious Zika Virus in Semen and Serum. J Infect Dis. 2019;219(1):31–40. doi: 10.1093/infdis/jiy462. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]

[B32] 32.Leland DS, Ginocchio CC. Role of cell culture for virus detection in the age of technology. Clin Microbiol Rev. 2007;20(1):49–78. doi: 10.1128/CMR.00002-06. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B33] 33.Corman VM, Rasche A, Baronti C, Aldabbagh S, Cadar D, Reusken CB. Assay optimization for molecular detection of Zika virus. Bull World Health Organ. 2016;94(12):880–892. doi: 10.2471/BLT.16.175950. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B34] 34.Drexler JF, de Souza Luna LK, Pedroso C, Pedral-Sampaio DB, Queiroz AT, Brites C, et al. Rates of and reasons for failure of commercial human immunodeficiency virus type 1 viral load assays in Brazil. J Clin Microbiol. 2007;45(6):2061–2063. doi: 10.1128/JCM.00136-07. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

[B35] 35.Gourinat AC, O'Connor O, Calvez E, Goarant C, Dupont-Rouzeyrol M. Detection of Zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 2015;21(1):84–86. doi: 10.3201/eid2101.140894. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

PERMALINK

Development and validation of a vero cell-based suspension method for the detection of Zika virus

Dina Popuche

Alfredo Huaman

Steev Loyola

María Silva

Sarah A Jenkins

Carolina Guevara

Roles

ABSTRACT

Objective.

Material and methods.

Results.

Conclusion.

INTRODUCTION

KEY MESSAGES

MATERIAL AND METHODS

Study design

Culturing cells for ZIKV inoculation

Virus inoculation and follow-up

Molecular assay

Plaque assay

Validation of the cell suspension-infection method

Statistical analysis

Ethical aspects

RESULTS

Technical analysis

Table 1. Comparison of the cost of the cell monolayer versus the cell suspension model for detecting ZIKV.

Development and standardization

Validation of the cell suspension-infection method

Table 2. Validation results of the developed cell suspension-infection method.

DISCUSSION

Acknowledgments.

Funding Statement

References

Desarrollo y validación de un método de suspensión basado en células Vero para la detección del virus Zika

Dina Popuche

Alfredo Huaman

Steev Loyola

María Silva

Sarah A Jenkins

Carolina Guevara

Roles

RESUMEN

Objetivo

Material y métodos

Resultados

Conclusiones

INTRODUCCIÓN

MENSAJES CLAVE

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño de estudio

Cultivo celular para la inoculación del ZIKV

Inoculación del virus y seguimiento

Ensayo molecular

Ensayo de placa viral

Validación del método de infección en suspensión celular

Análisis estadístico

Aspectos éticos

RESULTADOS

Análisis técnico

Tabla 1. Comparación técnica del método de monocapa celular frente al de suspensión celular para la detección del ZIKV.

Desarrollo y estandarización

Validación del método de infección con células en suspensión

Tabla 2. Resultados de la validación del método de infección en suspensión de células.

DISCUSIÓN

Agradecimientos.

ACTIONS

PERMALINK

RESOURCES

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