Abstract
目的
探讨分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy, CMA）对未结合胆红素（unconjugated bilirubin, UCB）诱导的小鼠小胶质细胞BV2损伤的影响。
方法
BV2细胞实验分为两部分。（1）CMA激活实验分为：对照组（等体积二甲基亚砜处理）、QX77组（20 μmol/L QX77处理24 h）、UCB组（40 μmol/L UCB处理24 h）、UCB+QX77组（20 μmol/L QX77和40 μmol/L UCB共处理24 h）。（2）细胞转染实验分为：LAMP2A沉默对照组（等体积二甲基亚砜处理）、LAMP2A沉默对照+UCB组（40 μmol/L UCB处理24 h）、LAMP2A沉默组（等体积二甲基亚砜处理）、LAMP2A沉默+UCB组（40 μmol/L UCB处理24 h）。采用改良MTT法检测细胞存活率，蛋白免疫印迹法检测p65、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1）蛋白表达水平，实时荧光定量聚合酶链反应法检测炎症因子白细胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）mRNA相对表达量，ELISA法检测细胞培养上清液中炎症因子IL-6和TNF-α水平，免疫荧光法检测细胞内p65、NLRP3与热休克同源蛋白70的荧光共定位。
结果
与UCB组相比，UCB+QX77组细胞存活率升高，炎症相关蛋白p65、NLRP3、caspase-1表达水平降低，炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量降低以及IL-6、TNF-α水平降低（P<0.05）。与对照组相比，UCB组和UCB+QX77组热休克同源蛋白70与p65、NLRP3存在共定位。沉默LAMP2A基因后，与LAMP2A沉默对照+UCB组相比，LAMP2A沉默+UCB组炎症相关蛋白p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达水平升高，炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量升高以及IL-6、TNF-α水平升高（P<0.05）。
结论
CMA在UCB诱导的BV2细胞损伤中被抑制，激活CMA可能通过降低p65和NLRP3蛋白水平，抑制炎症反应，拮抗胆红素神经毒性。
Keywords: 胆红素, 分子伴侣介导的自噬, 神经毒性, 小胶质细胞
Abstract
Objective
To investigate the effect of chaperone-mediated autophagy (CMA) on the damage of mouse microglial BV2 cells induce by unconjugated bilirubin (UCB).
Methods
The BV2 cell experiments were divided into two parts. (1) For the CMA activation experiment: control group (treated with an equal volume of dimethyl sulfoxide), QX77 group (treated with 20 μmol/L QX77 for 24 hours), UCB group (treated with 40 μmol/L UCB for 24 hours), and UCB+QX77 group (treated with both 20 μmol/L QX77 and 40 μmol/L UCB for 24 hours). (2) For the cell transfection experiment: LAMP2A silencing control group (treated with an equal volume of dimethyl sulfoxide), LAMP2A silencing control+UCB group (treated with 40 μmol/L UCB for 24 hours), LAMP2A silencing group (treated with an equal volume of dimethyl sulfoxide), and LAMP2A silencing+UCB group (treated with 40 μmol/L UCB for 24 hours). The cell viability was assessed using the modified MTT method. The expression levels of p65, nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3), and cysteinyl aspartate specific proteinase-1 (caspase-1) were detected by Western blot. The relative mRNA expression levels of the inflammatory cytokines interleukin (IL)-1β, IL-6, and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were determined by real-time quantitative polymerase chain reaction. Levels of IL-6 and TNF-α in the cell culture supernatant were measured using ELISA. The co-localization of heat shock cognate protein 70 with p65 and NLRP3 was detected by immunofluorescence.
Results
Compared to the UCB group, the cell viability in the UCB+QX77 group increased, and the expression levels of inflammation-related proteins p65, NLRP3, and caspase-1, as well as the mRNA relative expression levels of IL-1β, IL-6, and TNF-α and levels of IL-6 and TNF-α decreased (P<0.05). Compared to the control group, there was co-localization of heat shock cognate protein 70 with p65 and NLRP3 in both the UCB and UCB+QX77 groups. After silencing the LAMP2A gene, compared to the LAMP2A silencing control+UCB group, the LAMP2A silencing+UCB group showed increased expression levels of inflammation-related proteins p65, NLRP3, and caspase-1, as well as increased mRNA relative expression levels of IL-1β, IL-6, and TNF-α and levels of IL-6 and TNF-α (P<0.05).
Conclusions
CMA is inhibited in UCB-induced BV2 cell damage, and activating CMA may reduce p65 and NLRP3 protein levels, suppress inflammatory responses, and counteract bilirubin neurotoxicity.
Keywords: Bilirubin, Chaperone-mediated autophagy, Neurotoxicity, Microglia
新生儿黄疸是新生儿期常见的临床现象，超过80%的早产儿和60%以上的足月新生儿会出现不同程度的黄疸［1］。目前，光疗作为新生儿黄疸的一线疗法，对大多数程度较轻的黄疸有效［2］，但当血液中游离胆红素水平进一步升高时，透过血脑屏障的胆红素会沉积在患儿中枢神经系统进而可能发展为胆红素脑病，部分可能遗留神经系统后遗症。关于胆红素神经毒性相关机制尚未完全阐明，已有研究报道神经炎症是胆红素神经毒性关键机制，调控神经炎症对于防治胆红素脑病有积极意义［3］。
分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy, CMA）是一种选择性降解单一蛋白质的途径。热休克同源蛋白70（heat shock cognate protein 70, HSC70）识别并结合含有特定序列“KFERQ”的底物蛋白形成底物复合物，底物复合物激活溶酶体相关膜蛋白2A型（lysosome associated membrane protein 2A, LAMP2A），触发CMA关键限速蛋白LAMP2A多聚化形成易位复合物并转运底物蛋白至溶酶体内降解［4］。生理条件下，CMA通过不断降解、回收和清除不必要或功能失调的细胞成分，以动态调节细胞适应环境变化，维持细胞稳态［5］。有文献报道CMA参与调节多种炎症反应过程［6-7］，其中包括炎症小体的关键组成部分核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3）及其上游调节信号核转录因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）。值得注意的是，有研究通过序列分析证实NLRP3和p65蛋白的结构域中含有可被特异性识别的特定序列，在受到相应刺激后，细胞内两种蛋白可以通过CMA途径部分降解［8-9］。课题组前期研究发现，NF-κB和NLRP3炎症小体是参与胆红素诱导神经细胞焦亡的关键因子，抑制NF-κB［10］和炎症小体［11-12］活化可以减少炎症因子的释放，减轻脑损伤，改善模型动物的神经系统预后。目前，对CMA与胆红素神经毒性的相关研究报道较罕见，本研究使用未结合胆红素（unconjugated bilirubin, UCB）诱导小鼠小胶质细胞BV2损伤，观察CMA能否通过调控NF-κB和NLRP3减轻UCB诱导的神经炎症反应，为新生儿胆红素脑病的防治新策略提供实验依据。
1. 材料与方法
1.1. 细胞和主要试剂
小鼠小胶质细胞BV2（武汉普诺赛生命科技有限公司），Opti-MEM™ I减血清培养基、DMEM培养基（Gibco，美国），胎牛血清（Hyclone，美国），β-actin、胆红素、噻唑蓝四唑蓝MTT（Sigma，美国），CMA激活剂QX77（MCE，美国），LAMP2A siRNA（北京擎科生物科技股份有限公司），HiPerFect转染试剂（Qiagen，德国），RNA提取和逆转录试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司），ELISA试剂盒（苏州四正柏生物科技有限公司），兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1；武汉三鹰生物技术有限公司），兔抗p65（CST，美国），兔抗LAMP2A（Abcam，英国），兔抗NLRP3（Novus，美国），鼠抗HSC70（Santa Cruz，美国），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（武汉塞维尔生物科技有限公司）。
1.2. 溶液配制
胆红素溶液：避光环境下将胆红素粉末溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）中，40~56℃水浴加热至完全溶解，分装后-20℃下避光保存，工作浓度为40 μmol/L。
QX77溶液：将QX77粉末溶于DMSO中，震荡和37℃水浴加热交替进行，充分溶解后分装于-20℃保存，工作浓度为20 μmol/L。
1.3. 细胞培养及实验分组
将冻存的BV2细胞快速置于37℃水浴锅中复苏，待其完全溶解后加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，轻轻混匀离心，弃去培养基后重悬，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。传1~2代后，接种细胞于细胞培养板中，待细胞稳定贴壁后开始后续干预。
（1）时间梯度分组：细胞中加入浓度为40 μmol/L的UCB工作液，刺激不同的时间（0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h）。
（2）CMA激活实验分组：对照组、QX77组、UCB组、UCB+QX77组。QX77使用浓度为20 μmol/L，UCB工作浓度为40 μmol/L，各组均培养24 h。
（3）细胞转染实验分组：LAMP2A沉默对照组、LAMP2A沉默对照+UCB组、LAMP2A沉默组、LAMP2A沉默+UCB组。UCB工作浓度为40 μmol/L，各组转染后干预24 h。
1.4. 细胞转染
细胞接种于6孔板，待细胞密度长至40%~60%时进行转染。在冰上用无酶水将siRNA粉末溶解，配制成浓度为20 μmol/L的储存液，按照说明书用250 μL减血清培养基分别稀释5 μL siRNA和5 μL转染试剂，轻轻吹匀后混合，静置20 min后加入2 mL培养基中。细胞培养板置于37℃、5% CO2培养箱中培养4~6 h后更换新鲜培养基，按1.3所示处理各组细胞。
1.5. 改良MTT法检测细胞存活率
细胞接种于96孔板，到达干预时间点后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，避光孵育4 h后弃上清，每孔加100 μL DMSO溶液溶解，避光置于摇床10~15 min，至蓝色结晶溶解后，酶标仪测570 nm处吸光度值。实验独立重复3次。
1.6. 实时荧光定量聚合酶链反应法检测炎症因子mRNA表达水平
细胞接种于12孔板，根据RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。内参基因GAPDH上游引物：5'-TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3'，下游引物：5'-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-3'，白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）上游引物：5'-TGGTGTGTGACGTTCCCATT-3'，下游引物：5'-CAGCACGAGGCTTTTTTGTTG-3'；白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）上游引物：5'-CATGTTCTCTGGGAAATCGTG-3'，下游引物：5'-TTCTGCAAGTGCATCATCG-3'；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）上游引物：5'-ATCGGTCCCCAAAGGGATGA-3'，下游引物：5'-GCTACAGGCTTGTCACTCGAA-3'。采用2-△△CT法计算mRNA的相对表达量，实验独立重复3次。引物由湖南擎科生物科技有限公司设计合成。
1.7. 蛋白免疫印迹法检测炎症相关蛋白表达水平
细胞接种于6孔板，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。100℃煮沸至蛋白变性，凝胶电泳后转膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，洗膜3次，4℃孵育一抗过夜（一抗稀释比例按说明书所示，β-actin为1∶5 000，p65为1∶1 000，caspase-1为1∶1 000，NLRP3为1∶500）。TBST洗涤3次后，室温孵育二抗1 h（按1∶5 000稀释），洗膜3次后，ECL化学发光法显色。使用Image J 8.0软件对蛋白条带灰度值进行分析，结果以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值比值表示。实验独立重复3次。
1.8. ELISA法检测炎症相关蛋白水平
细胞接种于6孔板，取细胞上清液，根据ELISA试剂盒说明书操作后，酶标仪检测各孔450 nm处吸光度值，根据标准曲线计算相应样本中炎症相关蛋白浓度。实验独立重复3次。
1.9. 免疫荧光法检测细胞内p65、NLRP3与HSC70的共定位
细胞接种于24孔板，PBS摇床清洗5 min，4 %多聚甲醛固定15 min后再洗3次，5 % BSA封闭1 h，PBS清洗3次后，加入一抗（稀释比例参照说明书，p65为1∶1 000，HSC70为1∶1 200，NLRP3为1∶50），4℃孵育过夜。清洗3次后加入二抗（按1∶500稀释），室温孵育1 h，清洗3次后加入DAPI（按1∶500稀释），清洗3次后使用抗荧光淬灭封片液封片。
1.10. 统计学分析
采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（ ）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. UCB和QX77对BV2细胞存活率的影响
UCB和QX77分别单独和共刺激BV2细胞24 h。与对照组（100%±0%）相比，QX77组（80.2%±2.3%）、UCB组（60.4%±6.4%）细胞存活率降低（P<0.001），而UCB+QX77组（68.6%±1.9%）细胞存活率较UCB组升高（P=0.021），但仍低于对照组（P<0.001）。
2.2. UCB刺激BV2细胞不同时间对LAMP2A蛋白表达的影响
UCB刺激BV2细胞0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h。与0 h组（0.90±0.14）比较，24 h组（0.61±0.12）LAMP2A蛋白相对表达量显著下降（P=0.010）。LAMP2A蛋白相对表达量随时间延长逐渐下降。见图1。
图1. UCB刺激BV2细胞不同时间后LAMP2A蛋白表达情况 左图为Western blot电泳图，右图为折线图（n=5）。a示与0 h组比较，P<0.05。LAMP2A蛋白相对表达量随时间延长逐渐下降。.
2.3. UCB和QX77对BV2细胞LAMP2A蛋白和炎症相关蛋白表达的影响
UCB和QX77分别单独和共刺激BV2细胞24 h。相较于对照组（0.68±0.10），QX77组（0.84±0.09）LAMP2A蛋白表达水平升高，UCB组（0.32±0.16）LAMP2A蛋白表达水平降低（P=0.001）；UCB+QX77组（0.61±0.13）LAMP2A蛋白表达水平较UCB组升高（P=0.006），UCB+QX77组LAMP2A蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图2A。
图2. 各组LAMP2A、p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达水平比较 A：Western blot法检测LAMP2A蛋白表达电泳图（n=4）；B：Western blot法检测p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达电泳图。.
UCB和QX77刺激BV2细胞24 h。UCB组p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达水平较对照组升高（P<0.05）；UCB+QX77组p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达水平较UCB组降低（P<0.05）。见图2B、表1。
表1.
UCB和QX77处理BV2细胞后炎症相关蛋白相对表达量的比较 （ ，n=3）
| 组别 | p65 | NLRP3 | caspase-1 |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 0.98±0.06 | 0.473±0.042 | 0.54±0.04 |
| UCB组 | 1.32±0.10a | 0.865±0.019a | 1.03±0.04a |
| QX77+UCB组 | 1.06±0.04b | 0.708±0.059a,b | 0.70±0.05a,b |
| F值 | 19.333 | 62.584 | 109.808 |
| P值 | 0.002 | <0.001 | <0.001 |
注：a示与对照组比较，P<0.05；b示与UCB组比较，P<0.05。［UCB］胆红素；［NLRP3］核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3；［caspase-1］半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1。
2.4. UCB和QX77对BV2细胞炎症因子mRNA相对表达量和含量的影响
实时荧光定量聚合酶链式反应检测结果显示，UCB组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量较对照组增加（P<0.05），UCB+QX77组较UCB组减少（P<0.05）。ELISA法检测结果显示，UCB组IL-6、TNF-α水平较对照组升高（P<0.001），UCB+QX77组较UCB组降低（P<0.05）。见表2。
表2.
UCB和QX77处理BV2细胞炎症因子mRNA相对表达量和含量的比较 （ ，n=3）
| 组别 | IL-1β mRNA | IL-6 mRNA | TNF-α mRNA | IL-6 (pg/mL) | TNF-α (pg/mL) |
|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 1±0 | 1±0 | 1±0 | 3.5±1.6 | 299±61 |
| UCB组 | 28±5a | 19.5±4.6a | 4.0±0.8a | 163.3±16.4a | 4 088±736a |
| QX77+UCB组 | 15±7a,b | 12.8±1.7a,b | 2.2±0.4a,b | 116.7±2.3a,b | 2 452±319a,b |
| F值 | 28.203 | 31.989 | 19.610 | 220.775 | 50.283 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
注：a示与对照组比较，P<0.05；b示与UCB组比较，P<0.05。［UCB］胆红素；［TNF-α］肿瘤坏死因子-α；［IL-1β］白细胞介素-1β；［IL-6］白细胞介素-6。
2.5. UCB和QX77对BV2细胞内p65、NLRP3与HSC70共定位的影响
与对照组相比，UCB组p65蛋白阳性表达增加；与UCB组相比，UCB+QX77组p65蛋白阳性表达减少；UCB组和UCB+QX77组中绿色荧光与红色荧光部分重合，存在共定位情况。与对照组相比，UCB组NLRP3蛋白阳性表达增加；与UCB组相比，UCB+QX77组NLRP3蛋白阳性表达稍减少。UCB组和UCB+QX77组中绿色荧光与红色荧光部分重合，存在共定位情况。见图3~4。
图3. UCB和QX77处理BV2细胞后p65与HSC70的荧光共定位（荧光显微镜，×600） 绿色荧光为p65，红色荧光为HSC70，共定位处显示黄色。与对照组相比，UCB组p65蛋白阳性表达增强；与UCB组相比，UCB+QX77组p65蛋白阳性表达减弱。UCB组和UCB+QX77组中绿色荧光与红色荧光部分重合，存在共定位情况。.
图4. UCB和QX77处理BV2细胞后NLRP3与HSC70的荧光共定位（荧光显微镜，×600） 绿色荧光为NLRP3，红色荧光为HSC70，共定位处显示黄色。与对照组相比，UCB组NLRP3蛋白阳性表达增强；与UCB组相比，UCB+QX77组NLRP3蛋白阳性表达稍减弱。UCB组和UCB+QX77组中绿色荧光与红色荧光部分重合，存在共定位情况。.
2.6. LAMP2A siRNA对BV2细胞LAMP2A蛋白和炎症相关蛋白的影响
与LAMP2A沉默对照组（0.907±0.007）相比，LAMP2A沉默组（0.305±0.033）LAMP2A蛋白表达水平降低（P<0.001）；与LAMP2A沉默对照+UCB组（0.776±0.004）相比，LAMP2A沉默+UCB组（0.216±0.049）LAMP2A蛋白表达水平降低（P<0.001）。见图5A。
图5. 各组LAMP2A、p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达水平比较 A：Western blot法检测各组LAMP2A蛋白表达电泳图，1为LAMP2A沉默对照组；2为LAMP2A沉默对照+UCB组；3为LAMP2A沉默组；4为LAMP2A沉默+UCB组。B：Western blot法检测各组p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达电泳图，1为LAMP2A沉默对照组；2为LAMP2A沉默对照+UCB组；3为LAMP2A沉默+UCB组。.
与LAMP2A沉默对照组相比，LAMP2A沉默对照+UCB组p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达水平升高（P<0.05）；与LAMP2A沉默对照+UCB组相比，LAMP2A沉默+UCB组p65、NLRP3、caspase-1表达水平升高（P<0.05）。见表3、图5B。
表 3.
LAMP2A siRNA处理后BV2细胞炎症相关蛋白表达水平比较 （ ，n=3）
| 组别 | p65 | NLRP3 | caspase-1 |
|---|---|---|---|
| LAMP2A沉默对照组 | 0.656±0.025 | 0.506±0.071 | 0.553±0.021 |
| LAMP2A沉默对照+UCB组 | 0.854±0.010a | 0.732±0.031a | 0.746±0.028a |
| LAMP2A沉默+UCB组 | 0.945±0.013a,b | 0.903±0.027a,b | 1.073±0.056a,b |
| F值 | 214.092 | 52.734 | 143.974 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
注：a示与LAMP2A沉默对照组比较，P<0.05；b示与LAMP2A沉默对照+UCB组比较，P<0.05。［UCB］胆红素；［NLRP3］核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3；［caspase-1］半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1。
2.7. LAMP2A siRNA对BV2细胞炎症因子mRNA相对表达量和含量的影响
实时荧光定量聚合酶链式反应法检测结果显示，与LAMP2A沉默对照组相比，LAMP2A沉默对照+UCB组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相对表达量增加（P<0.05）；与LAMP2A沉默对照+UCB组相比，LAMP2A沉默+UCB组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA相对表达量增加（P<0.05）。ELISA法检测结果显示，与LAMP2A沉默对照组相比，LAMP2A沉默对照+UCB组炎症因子IL-6、TNF-α水平升高（P<0.05）；与LAMP2A沉默对照+UCB组相比，LAMP2A沉默+UCB组炎症因子IL-6、TNF-α水平升高（P<0.05）。见表4。
表 4.
LAMP2A siRNA处理后BV2细胞炎症因子mRNA相对表达量和含量的比较 （ ，n=3）
| 组别 | IL-1β mRNA | IL-6 mRNA | TNF-α mRNA | IL-6 (pg/mL) | TNF-α (pg/mL) |
|---|---|---|---|---|---|
| LAMP2A沉默对照组 | 1.00±0 | 1.0±0 | 1.0±0 | 4.3±1.1 | 49±40 |
| LAMP2A沉默对照+UCB组 | 5.91±0.15a | 16.7±2.7a | 5.7±0.4a | 370.3±18.8a | 5 325±1 164a |
| LAMP2A沉默+UCB组 | 16.89±1.83a,b | 39.8±9.8a,b | 7.9±1.2a,b | 419.1±13.7a,b | 7 765±1 134a,b |
| F值 | 201.609 | 52.059 | 89.980 | 850.779 | 52.983 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
注：a示与LAMP2A沉默对照组比较，P<0.05；b示与LAMP2A沉默对照+UCB组比较，P<0.05。［UCB］胆红素；［TNF-α］肿瘤坏死因子-α；［IL-1β］白细胞介素-1β；［IL-6］白细胞介素-6。
3. 讨论
目前，关于胆红素脑病相关机制尚不清楚。有研究显示，胆红素神经毒性主要通过神经炎症、线粒体功能障碍、氧化应激等分子机制导致神经细胞损伤甚至死亡［13］。抑制神经炎症在一定程度上改善模型动物的神经系统预后［11］，提示调控神经炎症对于防治胆红素脑病有积极作用。相较于星形胶质细胞和神经元，小胶质细胞是对UCB反应最灵敏的神经细胞［14］，课题组前期研究发现30 μmol/L胆红素刺激引起小胶质细胞激活，并动态分化为促炎表型和抑炎表型，促/抑炎小胶质细胞比例1~6 h内保持动态平衡，这段时间内小胶质细胞吞噬作用较强，但随着暴露于UCB的时间延长，小胶质细胞从抑炎表型逐步转变为可能导致细胞死亡的促炎状态，炎症因子释放水平在24 h达到巅峰［15］。小胶质细胞作为炎症因子的主要来源，对神经炎症损伤起关键作用。
CMA是一种重要的胞内精细调节途径，通过HSC70和LAMP2A将受损或未受损的蛋白质转移至溶酶体内降解以终止其功能来发挥作用。HSC70是唯一被证实可以与“KFERQ”样基序直接结合的伴侣蛋白，但胞质内的HSC70直接或间接参与哺乳动物体内三种不同类型的自噬过程，并不局限于CMA；依赖LAMP2A进入溶酶体是目前确定蛋白质通过CMA发生降解的“金标准”，LAMP2A作为CMA的限速成分，降低LAMP2A的表达是抑制CMA最有效的方法［4］。本研究显示，UCB使小胶质细胞LAMP2A表达下降，提示CMA活动受到抑制；同时，p65、NLRP3、caspase-1等炎症相关指标升高，细胞存活率下降。而课题组前期研究发现，UCB刺激使原代小胶质细胞内巨自噬活动被抑制，胞内NLRP3炎症小体表达升高，表现出强烈的炎症反应［16］。通常认为，CMA和巨自噬之间存在密切的相互作用，任何一条途径的抑制会导致另一条途径补偿性激活［17］。小胶质细胞内补偿性激活的缺失值得关注。有研究提示，在敲除LAMP2A基因的阿尔茨海默症小鼠模型的神经元中没有出现巨自噬的补偿性激活，胞内致病蛋白聚集，导致部分重要神经元发生功能失调和死亡，巨自噬补偿性激活的缺失突出了CMA功能在部分神经细胞蛋白质组的维护和微调中的重要性［18］。本研究使用CMA特异性激动剂QX77处理小胶质细胞，发现UCB+QX77组炎症相关指标下降，细胞存活率升高。结合前期研究，UCB诱导的小胶质细胞内巨自噬没有被补偿性激活，因此，CMA可能在拮抗UCB诱导的小胶质细胞神经炎症及损伤中发挥了重要调控作用。
NF-κB作为经典的炎症信号，在许多炎症反应和自身免疫性疾病中发挥着重要作用［19］。UCB诱导的小胶质细胞内，NF-κB信号通路被激活，活化的p50/p65二聚体进入胞核内促进炎症因子的转录和翻译。本研究使用QX77处理UCB诱导的小胶质细胞后发现，p65蛋白表达下降，炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达降低，IL-6和TNF-α释放减少；沉默LAMP2A的实验结果则与上述结果相反。已证实，p65和NLRP3含有特定序列“KFERQ”，本研究通过免疫荧光检测发现，QX77+UCB组的小胶质细胞内p65、NLRP3与HSC70存在共定位，提示激活CMA后p65和NLRP3可通过该途径部分降解。这与之前报道的文献结果一致，CMA通过HSC70识别p65 RHD结构域中的相应序列，下调胞内p65蛋白的含量，调节NF-κB的活性［8］。值得关注的是，近期有研究显示，CMA可以通过调控p65乙酰化酶来间接调节NF-κB的转录活性［20］。这进一步表明CMA在调控NF-κB转录活动中发挥了重要作用。活化的NF-κB进入细胞核后与NLRP3启动子中相应位点结合，诱导NLRP3转录和表达增加。NLRP3与含CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白和caspase-1前体蛋白组装形成完整且有活性的NLRP3炎症小体，促使caspase-1前体蛋白自我裂解产生活化的效应蛋白caspase-1［21］。本研究使用QX77激活CMA后可抑制UCB诱导的小胶质细胞内NLRP3的表达、阻止炎症小体的组装和caspase-1的活化，且沉默LAMP2A会导致NLRP3和caspase-1进一步升高。因此，推测CMA可能通过调控NF-κB和NLRP3数量与活性，抑制小胶质细胞内UCB引起的炎症反应，在一定程度上拮抗了胆红素对小胶质细胞的毒性。
相较于成年人，婴儿发育早期拥有独特的小胶质细胞亚群［22］，靶向调控小胶质细胞可能在神经修复中发挥重要作用。临床上已有醋酸格拉替雷药物可以通过激活抑炎型小胶质细胞治疗多发性硬化症［23］，激活抑炎型小胶质细胞可能有助于减轻UCB导致的神经炎症、减少神经元死亡并为神经再生提供适当的微环境。
综上所述，激活CMA可以增加溶酶体对p65和NLRP3蛋白的降解，从而减轻UCB诱导的炎症反应，提高BV2细胞存活率。然而，CMA如何通过调控NF-κB信号通路来影响NLRP3的表达、拮抗胆红素神经毒性，有待进一步研究。
基金资助
国家自然科学基金项目（81971426）；重庆市技术创新与应用发展专项重点项目（CSTB2022TIAD-KPX0147）。
利益冲突声明
所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献
华子瑜、潘知繁、李玲构建课题思路、设计实验方案，潘知繁、李玲、李思宇、张燕开展实验研究，华子瑜、潘知繁、李玲分析实验数据、撰写并修改手稿。所有作者都已阅读并批准了手稿的内容。
参 考 文 献
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