Abstract
目的
获得靶向瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）通道的多肽抑制剂。
方法
基于已有的靶向TRPV1通道的多肽激动剂红头蜈蚣毒素（RhTx）进行理性设计，在其氨基末端增加带正电荷的氨基酸，并在细胞上使用膜片钳电生理验证设计的多肽对TRPV1通道的抑制作用。
结果
理性设计了8条Nplus-RhTx多肽，在膜片钳电生理记录中发现其中4条可以抑制TRPV1的辣椒素激活，4条Nplus-RhTx多肽的半数有效抑制浓度分别为（188.3±4.7）、（193.6±18.0）、（282.8±11.9）和（299.5±6.4）µmol/L。
结论
通过对RhTx多肽的氨基端进行理性设计改变其性质，可获得靶向TRPV1的多肽抑制剂。
Keywords: 瞬时受体电位香草酸亚型1, 离子通道, 多肽, 理性设计, 电生理
Abstract
Objective
To design and synthesize peptide inhibitors targeting transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) ion channel, and to validate their function.
Methods
Based on previous studies on the relation of molecular structure and function of red head toxin (RhTx), a series of peptides were rationally designed and synthesized, with positive charged amino acids linked to the N terminus of RhTx. These Nplus-RhTx peptides were functionally validated by patch-clamp recordings in live cells.
Results
Among the 8 synthesized Nplus-RhTx peptides, four inhibited TRPV1 ion channel activated by capsaicin with IC50 of (188.3±4.7), (193.6±18.0), (282.8±11.9) and (299.5±6.4) µmol/L, respectively.
Conclusion
It is feasible to develop TRPV1 peptide inhibitors by using rational design based on N terminal residues of RhTx.
Keywords: Transient receptor potential vanilloid 1, Ion channels, Peptides, Rational design, Electrophysiology
疼痛严重影响人们的身心状态和生活质量，同时给社会带来极大的医疗负担。据统计，仅在美国就有约1亿人遭受各种疼痛的折磨，由此造成的经济负担约6000亿美元，超过了癌症和糖尿病经济负担的总和［1］。传统的镇痛药物主要有阿片类药物（如吗啡等）和非甾体类抗炎药（如阿司匹林等）。阿片类药物的镇痛效果良好，但具有成瘾性；非甾体类抗炎药虽不具有成瘾性，但其镇痛效果一般，且不适合长期服用。因此，迫切需要基于疼痛感受的机制开发新型镇痛药物。
TRPV1离子通道是一种非选择性阳离子通道［2］，在脊髓背根神经节的感觉神经元中高度表达。许多伤害性刺激可以激活TRPV1离子通道，如大于42 ℃的高温、细胞外的低pH等［2］。中国红头蜈蚣、东亚钳蝎等产毒动物的毒液中含有能激活TRPV1的多肽毒素，故其蜇咬能引起剧烈疼痛［3-4］。而当TRPV1被敲除后，辣椒素、高温等引起的小鼠疼痛行为明显下降或消失［5］；TRPV1通道抑制剂在小鼠中也有明显的镇痛效果［6-7］，提示TRPV1通道可能是开发镇痛药物的靶点。前期研究发现，中国红头蜈蚣的毒液中存在多肽毒素RhTx，其含有两对二硫键，折叠成一定的三维构象，从而可以很好地激活TRPV1通道［3］。研究还发现，相比RhTx，RhTx类似物RhTx2的氨基端多了4个氨基酸，从而使其具有激活TRPV1后诱导快速失活的功能［8］。通过对RhTx多肽进行理性设计，删除RhTx氨基端中具有较高结构可变性的3个氨基酸，可获得s-RhTx［9］。s-RhTx不能直接激活TRPV1，而是发挥正向变构调节剂的作用增强辣椒素与胞外酸化对TRPV1的激活，增加通过TRPV1的钙离子内流，引起表达TRPV1的痛觉感受神经元末梢的可逆性消除，从而发挥长效镇痛作用，且不改变动物体温。由于RhTx羧基端带电的氨基酸对其发挥激动效果必不可少，羧基端4个点突变（D20A、K21A、Q22A和E27A）与通道的结合能力下降从而导致激活效果几乎消失［3］；而正向变构调节剂s-RhTx羧基端K22是其发挥活性的关键残基［9］，表明羧基端对于RhTx系列多肽与TRPV1的结合至关重要。因此，在保留羧基的基础上，通过调整RhTx的氨基端氨基酸序列，可能可以实现对RhTx功能的调控。
本研究假设RhTx多肽的氨基端可以设置多个侧链带正电的氨基酸，将其通过具有较高结构可变性的多肽链连接到RhTx或RhTx2上，形成Nplus-RhTx，利用RhTx或RhTx2能结合TRPV1通道的孔区外侧的特点，将带正电的氨基端氨基酸富集于TRPV1通道孔区附近，进而利用TRPV1作为阳离子通道的特性，使这些带正电氨基酸进入孔区，阻碍阳离子流入，从而发挥通道抑制剂的作用。本研究化学合成了八种Nplus-RhTx多肽，并在膜片钳电生理上测量其对TRPV1的作用效果，为将来靶向TRPV1通道的新型镇痛药物设计提供了思路。
1. 材料与方法
1.1. 细胞、试剂与仪器
HEK293T细胞购于美国菌种保藏中心（ATCC）；DMEM培养基为美国Sigma公司产品；胎牛血清为德国Noverse公司产品；脂质胺2000为美国Invitrogen公司产品；opti-MEM为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；辣椒素为MedChemExpress（中国）公司产品。带有PatchMaster软件的HEKA EPC10放大器为德国HEKA公司产品；快速溶液切换器（RSC-200）为法国Bio-Logic公司产品。
1.2. Nplus-RhTx多肽的化学合成、氧化复性和分析验证
线性Nplus-RhTx多肽由吉尔生化（上海）有限公司合成，粗还原肽通过RP-HPLC进一步纯化。一旦通过MALDI-TOF-MS和HPLC确定目标肽的纯度高于95%，即合并峰并冻干。将线性还原肽溶解在0.1 mol/L Tris盐酸缓冲液（pH 7.0）中，含有0.1 mol/L氯化钠、5 mmol/L还原型谷胱甘肽和0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽，在28 ℃下进行氧化和折叠，并通过分析RP-HPLC和MALDI-TOF-MS监测其复性情况。
1.3. 细胞培育和转染
HEK293T细胞在DMEM培养基中用10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素在37 ℃和含5%二氧化碳的培养箱中培养。转染前24 h将细胞接种在玻璃盖玻片上。瞬时转染时将4 μL脂质体2000和4 μg质粒DNA加入opti-MEM中，混匀后室温静置20 min。将混合液体加入到35 mm细胞培养皿中。转染后24~48 h进行电生理实验。
1.4. 膜片钳技术记录TRPV1通道的电流
采用以往研究中常用的方法进行膜片钳记录［10］。使用带有PatchMaster软件的HEKA EPC10放大器进行膜片钳记录。记录电极由硼硅酸盐玻璃制备，并经过火抛光至约4 mΩ的电阻。对于全细胞记录，串联电阻补偿60%。浴液和记录电极内液中含有130 mmol/L氯化钠、10 mmol/L葡萄糖、0.2 mmol/L EDTA和3 mmol/L HEPES（pH 7.2）。电流信号以10 kHz采样，并以2.9 kHz滤波。所有记录均在室温（22 ℃）下进行，最大温度变化为1 ℃。
为了在膜片钳记录期间灌流含有辣椒素（TRPV1通道的经典激动剂）［11］或多肽的溶液，使用基于重力灌流系统的快速溶液切换器。在记录过程中，将带有细胞膜片的记录电极头部直接放置在灌流管出口的正前方。由于辣椒素激活TRPV1的饱和浓度为10 µmol/L［10］，因此在形成全细胞封接后，灌流10 µmol/L辣椒素来激活TRPV1通道。
1.5. 数据处理
采用IgorPro 5.05处理全细胞膜片钳记录的数据。所有统计资料均以均数±标准误（ ± ）表示，浓度效应曲线用希尔方程拟合并得到IC50。
2. 结果
2.1. Nplus-RhTx多肽的化学合成、氧化复性和质谱分析结果
八种Nplus-RhTx多肽的氨基酸序列见表1。这些多肽的线性化序列通过化学合成后，由于其中含有与RhTx类似的四个半胱氨酸残基，预期形成两对二硫键，故在28 ℃下对线性的Nplus-RhTx多肽进行氧化和折叠。氧化折叠后的八种多肽在RP-HPLC中均形成了单一峰；MALDI-TOF-MS也显示复性后的多肽分子量相符，见表2、图1，提示已获得了正确的Nplus-RhTx多肽。
表1.
RhTx、RhTx2多肽、s-RhTx和八种Nplus-RhTx多肽的氨基酸序列
| 序号 | 多肽名称 | 氨基酸序列 |
|---|---|---|
| 1 | RhTx | LNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
| 2 | RhTx2 | NSEYLNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
| 3 | s-RhTx | PCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
| 4 | Nplus-RhTx_RN38 | RNGNGNGNGNG LNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
| 5 | Nplus-RhTx_RR39 | RRNGNGNGNGNG LNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
| 6 | Nplus-RhTx_RN42 | RNGNGNGNGNG NSEYLNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
| 7 | Nplus-RhTx_RR43 | RRNGNGNGNGNG NSEYLNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
| 8 | Nplus-RhTx_KN38 | KNGNGNGNGNG LNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
| 9 | Nplus-RhTx_KK39 | KKNGNGNGNGNG LNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
| 10 | Nplus-RhTx_KN42 | KNGNGNGNGNG NSEYLNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
| 11 | Nplus-RhTx_KK43 | KKNGNGNGNGNG NSEYLNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE |
RhTx、RhTx2、连接部分和氨基端带正电氨基酸分别用紫色、红色、蓝色和黑色标记. RhTx：红头蜈蚣毒素.
表2.
八种Nplus-RhTx多肽测得的分子量
| 序号 | 多肽名称 | 理论分子量 | 实测平均分子量 |
|---|---|---|---|
| 1 | Nplus-RhTx_RN38 | 3977.45 | 3978.18 |
| 2 | Nplus-RhTx_RR39 | 4133.64 | 4133.71 |
| 3 | Nplus-RhTx_RN42 | 4470.93 | 4471.67 |
| 4 | Nplus-RhTx_RR43 | 4627.11 | 4627.44 |
| 5 | Nplus-RhTx_KN38 | 3950.77 | 3950.80 |
| 6 | Nplus-RhTx_KK39 | 4078.59 | 4078.92 |
| 7 | Nplus-RhTx_KN42 | 4443.89 | 4443.75 |
| 8 | Nplus-RhTx_KK43 | 4572.07 | 4572.59 |
图1. 八种Nplus-RhTx多肽的基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱图和反相高效液相色谱图.
左边为基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱图，右边为反相高效液相色谱图. RhTx：红头蜈蚣毒素.
2.2. Nplus-RhTx多肽对TRPV1通道的抑制作用
在细胞外侧灌流含有多种Nplus-RhTx多肽的10 µmol/L辣椒素溶液后，发现加入Nplus-RhTx_RN38、Nplus-RhTx_RR39、Nplus-RhTx_KN42或Nplus-RhTx_KK43多肽后TRPV1的电流发生明显的浓度依赖的下降，而加入另外四种Nplus-RhTx多肽则对TRPV1通道无此效果。提示前四种Nplus-RhTx多肽对TRPV1通道有抑制作用。
通过测量有抑制作用的四种Nplus-RhTx多肽对TRPV1通道辣椒素激活电流幅度的抑制比例，计算得到Nplus-RhTx_KK43、Nplus-RhTx_KN42、Nplus-RhTx_RN38和Nplus-RhTx_RR39的IC50分别为（188.3±4.7）、（193.6±18.0）、（282.8±11.9）和（299.5±6.4）µmol/L。且当膜电位被钳制在－80 mV时，Nplus-RhTx多肽的抑制效果强于+80 mV下的效果（图2），与设计相吻合。
图2. 四种Nplus-RhTx多肽抑制由辣椒素引发的TRPV1电流时程图及其希尔方程拟合的浓度效应曲线图.
左图为Nplus-RhTx多肽由辣椒素引发的TRPV1电流时程图，右图为希尔方程拟合该多肽的浓度效应曲线图. 红色线段和蓝色线段分别表示加入辣椒素和多肽的时长. 蓝色线段上方数字为加入多肽的浓度（μmol/L）. RhTx：红头蜈蚣毒素；TRPV：瞬时受体电位香草酸亚型.
3. 讨 论
本研究通过在RhTx的氨基端加入不同的带正电荷氨基酸，获得八种Nplus-RhTx多肽。在化学合成并氧化复性这些多肽后，通过膜片钳电生理实验验证了其中四种能明显抑制TRPV1通道的辣椒素激活，符合研究设计。
但是，这些Nplus-RhTx多肽尚有诸多不足，需要进一步优化。首先，其对TRPV1抑制的IC50偏大，Nplus-RhTx多肽的IC50是RhTx家族其他成员（RhTx、RhTx2和s-RhTx）的数倍［3， 9］，因此需要优化Nplus-RhTx多肽的序列才有可能进一步进行转化应用开发。其次，虽然靶向TRPV1通道的小分子抑制剂已经在多种动物疼痛模型上展示出了镇痛效果，但Nplus-RhTx作为多肽在动物体内的代谢、药效等尚需进一步通过动物实验来确认。
目前，多肽类药物的发展方兴未艾。在镇痛药物中，靶向电压门控钙离子通道的芋螺毒素已经被开发为镇痛药物齐考诺肽（Ziconotide）［12］。TRPV1通道作为疼痛感受器，其多种小分子抑制剂在不同动物疼痛行为模型均展示出良好的镇痛效果，但至今尚未有靶向TRPV1的小分子抑制剂获批上市［7］。本研究理性设计获得的Nplus-RhTx系列多肽将为靶向TRPV1的新型镇痛分子开发提供新思路。
Acknowledgments
研究得到国家自然科学基金（32122040，31971040）、中国博士后创新人才支持计划（BX20230323）支持
Acknowledgments
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32122040,31971040) and China Postdoctoral Program for Innovative Talents (BX20230323)
［缩略语］
瞬时受体电位香草酸亚型（transient receptor potential vanilloid，TRPV）；红头蜈蚣毒素（red head toxin，RhTx）；高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）；反相HPLC（reversed phase- HPLC，RP-HPLC）；基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）；4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸［4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES］；半数有效抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）
利益冲突声明
所有作者均声明不存在利益冲突
Conflict of Interests
The authors declare that there is no conflict of interests
参考文献（References）
- 1.STEGLITZ J, BUSCEMI J, FERGUSON M J. The future of pain research, education, and treatment: a summary of the IOM report “Relieving pain in America: a blueprint for transforming prevention, care, education, and research”[J]. Transl Behav Med, 2012, 2(1): 6-8. 10.1007/s13142-012-0110-2 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.CATERINA M J, SCHUMACHER M A, TOMINAGA M, et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway[J]. Nature, 1997, 389(6653): 816-824. 10.1038/39807 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.YANG S, YANG F, WEI N, et al. A pain-inducing centipede toxin targets the heat activation machinery of nociceptor TRPV1[J]. Nat Commun, 2015, 6: 8297. 10.1038/ncomms9297 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.YANG S, YANG F, ZHANG B, et al. A bimodal activation mechanism underlies scorpion toxin-induced pain[J/OL]. Sci Adv, 2017, 3(8): e1700810. 10.1126/sciadv.1700810 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.CATERINA M J, LEFFLER A, MALMBERG A B, et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor[J]. Science, 2000, 288(5464): 306-313. 10.1126/science.288.5464.306 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.GAVVA N R, BANNON A W, HOVLAND D N JR, et al. Repeated administration of vanilloid receptor TRPV1 antagonists attenuates hyperthermia elicited by TRPV1 blockade[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2007, 323(1): 128-137. 10.1124/jpet.107.125674 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.GAVVA N R. Setbacks in the clinical development of TRPV1 antagonists[J]. Open Drug Discov, 2009, 1: 1-35. 10.2174/1877381800901010001 [DOI] [Google Scholar]
- 8.ZHU A, AIERKEN A, YAO Z, et al. A centipede toxin causes rapid desensitization of nociceptor TRPV1 ion channel[J]. Toxicon, 2020, 178: 41-49. 10.1016/j.toxicon.2020.02.016 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.ZHANG H, LIN J J, XIE Y K, et al. Structure-guided peptide engineering of a positive allosteric modulator targeting the outer pore of TRPV1 for long-lasting analgesia[J]. Nat Commun, 2023, 14(1): 4. 10.1038/s41467-022-34817-1 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.YANG F, XIAO X, CHENG W, et al. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel[J]. Nat Chem Biol, 2015, 11(7): 518-524. 10.1038/nchembio.1835 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.YANG F, XIAO X, LEE B H, et al. The conformational wave in capsaicin activation of transient receptor potential vanilloid 1 ion channel[J]. Nat Commun, 2018, 9(1): 2879. 10.1038/s41467-018-05339-6 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.SAFAVI-HEMAMI H, BROGAN S E, OLIVERA B M. Pain therapeutics from cone snail venoms: from Zico-notide to novel non-opioid pathways[J]. J Proteomics, 2019, 190: 12-20. 10.1016/j.jprot.2018.05.009 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]