多模化仿生应力调节膀胱平滑肌细胞的生物学功能

Abstract

Previous studies have shown that growth arrest, dedifferentiation, and loss of original function occur in cells after multiple generations of culture, which are attributed to the lack of stress stimulation. To investigate the effects of multi-modal biomimetic stress (MMBS) on the biological function of human bladder smooth muscle cells (HBSMCs), a MMBS culture system was established to simulate the stress environment suffered by the bladder, and HBSMCs were loaded with different biomimetic stress for 24 h. Then, cell growth, proliferation and functional differentiation were detected. The results showed that MMBS promoted the growth and proliferation of HBSMCs, and 80 cm H₂O pressure with 4% stretch stress were the most effective in promoting the growth and proliferation of HBSMCs and the expression level of α-smooth muscle actin and smooth muscle protein 22-α. These results suggest that the MMBS culture system will be beneficial in regulating the growth and functional differentiation of HBSMCs in the construction of tissue engineered bladder.

0. 引言

越来越多的证据表明，力学环境或应力对组织和器官的发育至关重要。在组织工程心血管的研究中发现，缺乏适当的应力会导致细胞从支架脱落、细胞去分化等现象，而给予适宜的应力刺激后，细胞生长活力增加，细胞功能更加完善^[1-3]。膀胱发育也需要应力。在胎儿期，膀胱每小时充盈伴随压力升高，然后通过持续几秒的收缩，排空膀胱^[4-5]。若转流膀胱尿液，让膀胱失去尿液周期性的充盈与排空，会造成膀胱细胞生长停滞、膀胱壁变薄^[6]。因此可以看出，应力对组织或器官的发育起着重要作用。

运用应力促进组织器官发育及功能成熟已在组织工程骨骼系统及心血管系统中得到广泛深入的研究^[7-9]。然而，应力对组织工程膀胱的作用还未得到足够重视^[10]。膀胱的结构与骨骼、心血管相差巨大，且日常体内所处的应力环境也不同，比如：骨骼承受的应力强度巨大，但产生形变仅有0.1%，而膀胱内压一般不超过40 cm H₂O，但会产生很大的形变；心血管系统主要受到剪切力及压力的调节，而膀胱受到的压力远小于血管，但却承受着巨大的牵张应力。因此，不能简单地将其它系统中的研究成果直接应用到组织工程膀胱的研究中。此外，现有的生物反应器施加应力比较单一，不能很好地模拟膀胱所受到的复合应力^[11-12]。故，有必要构建一套适合组织工程膀胱的应力培养系统，即多模化仿生应力（multi-modal biomimetic stress，MMBS）培养系统，该系统能同时或交替加载压力、牵张应力及剪切力。本研究将运用MMBS培养系统模拟膀胱体内所承受到的复合应力，以研究这些应力对人膀胱平滑肌细胞（human bladder smooth muscle cells，HBSMCs）的生物学功能的影响，为研究应力如何促进组织工程种子细胞生长和功能成熟提供基础。

1. 材料与方法

1.1. 材料与仪器

细胞培养相关耗材：HBSMCs（ScienCell，美国）；胎牛血清与杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）（Hyclone，美国）；胰蛋白酶（GIBCO，美国）。检测基因转录相关试剂：提取总RNA试剂、反转录试剂盒及荧光聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司，中国）；PCR引物（上海生工公司，中国）。检测细胞生长及增殖相关试剂与设备：细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）及碘化丙啶（碧云天，中国）；5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）细胞增殖检测试剂盒（翌圣生物科技，中国）；4'，6-二脒基-2苯基吲哚（赛维尔生物，中国）；流式细胞仪（Gallios，Beckman Coulter，美国）。检测蛋白表达相关抗体：抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde -3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（Cell Signaling Technology，美国）；抗α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）和平滑肌蛋白22-α（smooth muscle protein 22-α，SM22-α）抗体（Abcam，英国）。

1.2. 细胞培养

HBSMCs置于含10%胎牛血清的DMEM（含0.1 mg/L链霉素和100 U/mL青霉素）中贴壁培养，放入37 ℃、5% CO₂体积分数及饱和湿度的培养箱中。选取3～7代生长活力良好、形态正常的HBSMCs进行实验。

1.3. MMBS培养系统的构建与运用

1.3.1. 构建MMBS培养系统

为了模拟生理状态下膀胱受到的周期性压力和牵张应力，本实验采用自主设计的生物反应器，即MMBS培养系统，如图1所示。该系统通过水泵提供动力，使培养舱内的压力升高，导致弹性膜的扩张，随着压力逐渐降低，弹性膜逐渐恢复正常，模拟膀胱从空虚到充盈再到空虚的应力过程。通过测量体积监测舱内液体体积的变化来评估膜形变大小，即牵张应力=体积监测舱内流出液体的体积/体积监测舱原有液体体积 × 100%。

图 1.

MMBS culture system

MMBS培养系统

1.3.2. MMBS的加载模式及实验分组

MMBS培养舱置于37 ℃，5% CO₂孵箱里，如图1所示。在培养舱内种植一定数量的HBSMCs（1 × 10⁵ 个/mL），并静置培养6 h，以确保细胞充分贴壁后再施加MMBS。应力加载方式如图2所示：每4 h循环一次，模拟膀胱从空虚到充盈再到空虚的过程，在前3 h，培养舱内压力（以符号α表示）及牵张应力（以符号β表示）分别缓慢上升，并维持0.5 h，然后在0.5 h内下降至0；共完成6个周期的MMBS加载。体内膀胱内压上限为40 cm H₂O，结合预实验及前期牵张应力研究结果，选择了40 cm H₂O的压力梯度来进行实验分组^[13]。α取值为0、40、80、120 cm H₂O；对应β取值0%、2%、4%、6%。即，实验共分4组：① 静态培养组（以下简称：0组）：α及β均取值为0；② 40 cm H₂O压力 + 2%牵张应力组：α取值为40 cm H₂O，β取值为2%；③ 80 cm H₂O压力+4%牵张应力组：α取值为80 cm H₂O，β取值为4%；④ 120 cm H₂O压力 + 6%牵张应力组：α取值为120 cm H₂O，β取值为6%。

图 2.

MMBS loading mode

MMBS加载模式

1.4. MMBS对HBSMCs生长及增殖的影响

1.4.1. MMBS对HBSMCs生长的影响

对HBSMCs加载MMBS持续24 h，然后使用胰蛋白酶消化细胞，并制成5×10⁵ 个/mL的细胞悬液。根据CCK-8试剂说明，在96孔板中每孔加入200 μL细胞悬液，37 ℃中孵育培养4 h，然后加入20 μL CCK-8试剂，再在37 ℃中孵育培养2 h。最后，使用全自动酶标仪在波长450 nm下测吸光度A值。

1.4.2. MMBS对HBSMCs增殖的影响

将HBSMCs与硅胶膜复合后，置于无血清的DMEM中饥饿过夜。经过加载MMBS后，使用流式细胞术检测细胞周期，并使用流式周期分析软件ModFit 3.2（Verity Software House，美国）进行结果分析，以细胞增殖指数衡量细胞增殖活性。另外，经过加载MMBS后的细胞继续静态培养48 h，然后EdU染色检测细胞增殖：首先EdU染色HBSMCs，紧接着4'，6-二脒基-2苯基吲哚染色细胞核，最后在荧光显微镜下观察染色结果并采集图片。

1.5. MMBS对HBSMCs功能分化成熟的影响

1.5.1. 荧光PCR检测功能分化成熟基因的转录

参照1.3.2小节，实验分组为：① 0组；② 40 cm H₂O压力+2%牵张应力组；③ 80 cm H₂O压力 + 4%牵张应力组（以下简称为：MMBS组）；④ 120 cm H₂O压力 + 6%牵张应力组。对HBSMCs完成MMBS作用后，提取总RNA。随后，根据反转录试剂盒试剂说明书合成互补DNA。最后，使用荧光PCR检测α-SMA和SM 22-α基因的转录水平^[14]。

1.5.2. 蛋白免疫印迹检测功能分化成熟标志物的蛋白表达

根据荧光PCR的检测结果，参照1.3.2小节和1.5.1小节，实验分组为：① 0组；② MMBS组。收获HBSMCs后，使用蛋白免疫印迹检测α-SMA和SM 22-α的表达水平，然后用图像处理软件ImageJ 1.46（National Institutes of Health，美国）分析条带灰度。

1.6. 统计学方法

采用统计分析软件SPSS 25.0（International Business Machines Corporation，美国）进行统计学分析。数据均以x±s表示。两组组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，差异应具有统计学意义，检验水准为0.05。

2. 结果

2.1. MMBS促进HBSMCs生长与增殖

经过24 h的MMBS加载后，使用CCK-8检测HBSMCs的生长情况，结果如图3所示，MMBS具有促进HBSMCs生长的效应，其中，80 cm H₂O压力+4%牵张应力组显示其促进作用最明显。与0组相比，相对吸光度A值升高了（2.66 ± 0.30）倍，[MD = 1.7（0.9，2.4），P < 0.01]。

图 3.

Effects of MMBS on the growth of HBSMCs

MMBS对HBSMCs生长的影响

根据CCK-8检测结果，实验分为0组及MMBS组，采用流式细胞技术检测HBSMCs周期变化，结果如图4所示，MMBS组的细胞增殖指数从（29.19 ± 4.52）%升高至（53.09 ± 5.57）%，[MD = 23.9（12.4，35.4），P < 0.01]。

图 4.

Effects of MMBS on the proliferation of HBSMCs

MMBS对HBSMCs的增殖影响

如图5所示，经MMBS加载的HBSMCs在静态培养48 h后仍保持明显的增殖活性。

图 5.

Effects of MMBS on the proliferation of HBSMCs detected by EdU staining

EdU染色检测MMBS对HBSMCs的增殖影响

根据以上结果可得出结论：80 cm H₂O压力 + 4%牵张应力组的参数，是最佳的MMBS加载参数，最有效地促进HBSMCs的生长和增殖。

2.2. MMBS促进HBSMCs功能分化成熟标志物的表达

荧光PCR检测α-SMA及SM22-α基因的转录水平，结果如图6所示，MMBS促进这两个基因的转录，尤其是在80 cm H₂O压力 + 4%牵张应力作用下，SM22-α及α-SMA基因的转录水平分别上升了（4.15 ± 1.23）倍，[MD = 3.1（1.1，5.2），P < 0.01]及（7.83 ± 1.27）倍，[MD = 6.8（5.1，8.5），P < 0.01]。

图 6.

Effects of MMBS on the transcription of SM22-α and α-SMA gene

MMBS对SM22-α及α-SMA基因转录的影响

^* P < 0.05

^* P < 0.05

进一步检测蛋白水平表达，如图7所示，MMBS促进了α-SMA及SM22-α蛋白的表达。与0组相比，MMBS组的SM22-α及α-SMA蛋白表达分别上升（1.57 ± 0.15）倍，[MD = 0.6（0.2，0.9），P < 0.01]及（1.72 ± 0.22）倍，[MD = 0.7（0.3，1.2），P = 0.01]。

图 7.

Effects of MMBS on the protein expression level of SM22-α and α-SMA

MMBS对SM22-α及α-SMA蛋白表达的影响

^* P < 0.05

^* P < 0.05

3. 讨论

种子细胞、支架材料和调控因素是组织工程的三大要素，在适宜的条件下，通过体外种子细胞与支架材料的复合培养，最终移植到体内进行器官或组织功能的修复。其中，获取大量有功能的种子细胞是实现组织工程的关键先决条件。因此，如何快速、大量扩增细胞及促进细胞分化成熟，成为制约泌尿系统组织工程发展的需首要解决的问题之一^[15-16]。研究发现，由于缺乏相应的应力刺激，细胞在体外经过多代培养后，生长活力降低，甚至出现去细胞分化等现象^[17-19]。

在组织工程领域骨骼系统及心血管系统相关的研究发现，应力具有改善细胞活力及促进细胞分化的作用，但目前在泌尿系统膀胱方面相关研究比较少。越来越多证据表明，模拟体内应力环境有益于种子细胞增殖、生长、分化及功能的维持。因此，构建生物反应器，模拟体内生物应力环境，达到调控种子细胞生物学行为，已成为组织工程器官的研究热点^{[17, 20-21]}。例如，在组织工程心血管系统研究中发现应力具有优化组织结构及功能的效应^{[7, 22]}。类似地，在组织工程骨骼系统的研究中也发现，机械应力对体外构建的骨骼及骨组织是有益的^[8-9]。膀胱与心脏、血管及骨骼一样，其发育也需要应力的调节^{[6, 23]}。为探索应力对膀胱组织工程的作用，研究者们开始了一些初步的探索。在国外，一研究小组构建了一个气压生物反应器，该反应器在一定程度上模拟了膀胱的内压力，但缺乏牵张应力的作用。此外，该压力由压缩气体产生，而膀胱实际体内压力主要由液体充盈产生^[24]。因此，模拟膀胱内应力的研究仍需要进一步探索。为在体外模拟日常状态下膀胱所受的力学环境，本研究小组在前期研究中成功建立了两套应力加载培养系统，其中一套是牵张应力加载培养系统BioDynamic^®，能加载不同强度的轴向牵张应力。在牵张应力的研究发现，对HBSMCs加载周期性牵张应力后，细胞排列更加有序，同时HBSMCs由分泌表型向收缩表型转换^[14]。另一套是压力施加系统，能施加不同强度的压力。在压力研究中发现，一定大小的周期性压力对HBSMCs增殖有促进作用^[25-27]。综合上述研究结果发现，不同种类的应力施加模式可产生不同的生物学效应。显然，促进种子细胞生长，同时促进或维持细胞功能分化成熟，单靠牵张应力或压力施加培养系统是无法实现的。

上述生物反应器加载应力单一的缺陷，可以通过自主设计的MMBS培养系统加以弥补，如图1所示。该系统可以将压力、剪切力及非轴向牵张应力同时或单独、顺序或交替加载，从而更好地模拟膀胱所处的应力环境。如图3～图5所示，MMBS促进了HBSMCs生长及增殖，80 cm H₂O压力联合4%牵张应力是促进HBSMCs生长及增殖的最佳应力加载参数。这些最佳应力加载参数的研究将有利于为解决在构建组织工程器官过程中所遇到的细胞生长活力低下等问题提供有效的方法，找到适合组织工程种子细胞生长和增殖的力学培养微环境。

在组织工程领域，细胞的分化和功能对于构建功能性组织工程器官至关重要。血管再生医学领域的研究表明，通过控制干细胞或成体细胞向平滑肌细胞的分化，可以促进血管组织的再生和修复^[28]。膀胱是一个动态运动器官，能储存尿液，同时也能收缩排空。维持膀胱这些生理功能依赖于正常分化的HBSMCs。α-SMA和SM22-α是HBSMCs中常用的两种标志物，它们在细胞功能中起着重要作用^[29]。α-SMA是平滑肌肌动蛋白的一种亚型，在肌肉收缩和细胞骨架的维持中发挥关键作用，α-SMA的表达反映了细胞的收缩能力和肌肉功能^[30]。另一方面，SM22-α是一种结构蛋白，在细胞的收缩和运动过程中发挥作用，SM22-α的表达也能反映细胞的收缩能力和肌肉功能^[31]。如图6～图7所示，本研究发现MMBC可以促进α-SMA和SM22-α的表达，使得去细胞分化等问题得到了一定程度上的解决。这一发现奠定了HBSMCs功能分化成熟研究的基础，并将最终帮助构建具有功能性的组织工程膀胱。

与早期的结果相比较，该系统不仅能更好地模拟真实膀胱所受到的应力，还能用较小强度的应力调节HBSMCs的生物学功能^[25]。以往需要达到200 cm H₂O的压力才能促进细胞增殖，而本研究仅需要80 cm H₂O，加载MMBS的细胞在停止力学刺激48 h后依然保持着明显的增殖活性。此外，不适的应力可导致组织或器官功能障碍，例如膀胱出口梗阻及神经源性膀胱产生的病理性应力可导致膀胱功能受损，而高血压会引起心血管疾病等^[32-35]。该系统能产生的压力范围为0～200 cm H₂O，根据需要增加模块还可以增加压力。因此，该系统不仅能模拟生理状况下的应力，还能模拟一些病理状态下的应力，为一些力学相关的组织重塑性疾病提供研究模型。

本实验尚存一些不足。由于本实验为细胞实验，为验证结果的可靠性，下一步将进行体内动物实验。受实验设备的限制，牵张应力的产生是依赖压力作用在弹性生物膜上产生的，因此后续的研究需增加牵张应力的独立加载控制装备。此外，由于研究时间的限制，应力加载时长仅为24 h，所以后续研究需要对应力加载时间进行延长。

4. 结论

MMBS培养系统成功地模拟了膀胱所受的复合应力，并能促进HBSMCs的生长、增殖和功能的分化。利用该系统来调节细胞生物学功能，有助于确定适宜组织工程种子细胞生长和增殖的力学培养微环境，为解决构建组织工程器官时所遇到的细胞生长活力低下和细胞失去分化成熟等问题提供了有效的研究方法。此外，该系统还可以模拟一些病理状态下的应力，为研究力学相关的组织重塑性疾病提供研究模型。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：韦堂墙主要负责实验的设计、执行、数据的分析及论文的撰写；陈林主要负责实验的指导及数据的分析；胡海峰负责数据收集及整理；杨进主要负责实验的设计、实验指导、论文写作指导及修改。

Funding Statement

国家自然科学基金项目（81900617）；四川省科学技术厅项目（2022NSFSC1592）；成都市科技局项目（2020-YF05-01441-SN）；成都大学临床医学院项目（Y202324）

National Natural Science Foundation of China; Natural Science Foundation from the Department of Science and Technology of Sichuan Province; Research Projects from Chengdu Science and Technology; Research Projects from Clinical Medical College of Chengdu University