Abstract
目的
探究熊果苷（Arb）对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的保护作用及其机制。
方法
将24只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、Arb低剂量给药组（25 mg/kg）和Arb高剂量给药组（50 mg/kg），6只/组。通过腹腔注射CCl4建立肝纤维化小鼠模型，灌胃给药持续6周后取材。取血清进行生化指标检测，取肝组织进行HE染色、天狼猩红染色和免疫组化染色；q-PCR检测肝组织纤维化相关指标a-SMA，Pdgfb，Col1α1，Timp-1基因以及炎症相关指标Ccl2和Tnf-a基因的mRNA水平；Western blot法检测肝组织α-SMA蛋白表达水平。Transwell迁移实验使用Arb处理THP-1和RAW264.7细胞24 h后，DAPI染色检测迁移细胞数目。体外实验使用Arb处理LX-2细胞24 h，Western blot法检测Akt、p65、Smad3及其磷酸化p-Akt、p-p65、p-Smad3和α-SMA的蛋白水平。
结果
与模型组小鼠相比，Arb给药组小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平降低（P < 0.05），肝组织损伤和胶原沉积减轻（P < 0.001），肝脏巨噬细胞浸润程度和α-SMA蛋白表达水平也降低（P < 0.001）。Arb降低CCl4诱导的小鼠肝脏a-SMA，Pdgfb，Col1α1，Timp-1，Ccl2和Tnf-a基因的mRNA水平（P < 0.05）。Transwell迁移实验显示，Arb可抑制THP-1和RAW264.7细胞的迁移募集作用。体外实验显示，Arb可抑制LX-2细胞Akt、p65和Smad3的磷酸化，并且降低α-SMA的蛋白表达水平。
结论
Arb可通过减少巨噬细胞募集和浸润，同时干预Akt/NF-κB和Smad信号通路抑制肝星状细胞活化，从而改善小鼠肝脏炎症及纤维化。
Keywords: 熊果苷, 炎症, 肝纤维化, 巨噬细胞募集, 肝星状细胞
Abstract
Objective
To investigate the protective effect of arbutin against CCl4-induced hepatic fibrosis in mice and explore the underlying mechanisms.
Methods
Twenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into control group, model group, and low- and high-dose arbutin treatment (25 and 50 mg/kg, respectively) groups. Mouse models of liver fibrosis were established by intraperitoneal injection of CCl4, and arbutin was administered daily via gavage for 6 weeks. After the treatments, serum biochemical parameters of the mice were tested, and liver tissues were taken for HE staining, Sirius Red staining and immunohistochemical staining. RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of α-SMA, Pdgfb, Col1α1, Timp-1, Ccl2 and Tnf-a, and Western blotting was performed to detect α-SMA protein expression in the liver tissues. In the cell experiment, the effect of arbutin treatment for 24 h on THP-1 and RAW264.7 cell migration and recruitment was examined using Transwell migration assay and DAPI staining; The changes in protein levels of Akt, p65, Smad3, p-Akt, p-p65, p-Smad3 and α-SMA in arbutintreated LX-2 cells were detected with Western blotting.
Results
Arbutin treatment significantly lowered serum alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels, alleviated liver tissue damage and collagen deposition, and reduced macrophage infiltration and α-SMA protein expression in the liver of the mouse models (P < 0.05 or 0.001). Arbutin treatment also significantly reduced CCl4-induced elevation of a-SMA, Pdgfb, Col1α1, Timp-1, Ccl2 and Tnf-a mRNA levels in mice (P < 0.05). In the cell experiment, arbutin treatment obviously inhibited migration and recruitment of THP-1 and RAW264.7 cells and lowered the phosphorylation levels of Akt, p65 and Smad3 and the protein expression level of α-SMA in LX-2 cells.
Conclusion
Arbutin ameliorates liver inflammation and fibrosis in mice by inhibiting hepatic stellate cell activation via reducing macrophage recruitment and infiltration and suppressing activation of the Akt/NF-κB and Smad signaling pathways.
Keywords: arbutin, inflammation, liver fibrosis, macrophage recruitment, hepatic stellate cells
由各种慢性肝病所引起的实质性损伤和炎症反应的持续激活会导致肝纤维化的发生。肝纤维化是一个由多种细胞和分子共同参与的病理过程，在肝纤维化进程中，肝脏肌成纤维细胞被激活，导致细胞外基质降解失衡并逐渐沉积，最终形成肝纤维化[1]。肝纤维化不仅会影响到肝病预后，甚至会成为肝细胞癌发生的关键因素。因此，改善肝病预后和降低肝癌发生风险的抗肝纤维化治疗显得尤为重要[2]。然而目前临床上仍缺乏特异性、针对性的药物和手段治疗肝纤维化[3]。巨噬细胞在肝脏损伤时会被募集到肝脏，在肝脏内刺激肝星状细胞（HSC）活化并产生胶原，在肝纤维化发生发展的过程中起关键作用[4]。HSC是一类常驻于肝脏内的间充质细胞，其活化是肝纤维化发生的中心环节。在肝纤维化进程中，静止的HSC转分化为增殖、迁移的肌成纤维细胞，分泌细胞外基质，表现出促纤维化特性。对HSC活化的研究已成为探索抗肝纤维化靶点和揭示药物治疗机制的关键[5]。
熊果苷（Arb）是一种源于杜鹃花科熊果的糖苷类化合物[6]。Arb作为熊果叶的主要药效成分，具有抗炎、抗菌、抗溃疡的药理作用，临床上可用于尿路感染及肠道炎症的辅助治疗[7, 8]。近年来有研究表明Arb具有抗炎作用，能显著降低促炎性细胞因子，及其他炎症相关的基因，治疗脂多糖刺激BV2小胶质细胞活化引起的炎症[9]。研究发现Arb通过PI3K/Akt/Nrf2通路抑制炎症和凋亡减轻脂多糖诱导的急性肾损伤[10]。此外有研究发现，Arb对α-萘异硫氰酸酯（ANIT）诱导的肝损伤具有保护作用[11]。但肝纤维化作为肝损伤后常见的病理过程，Arb是否对肝纤维化具有治疗作用，仍缺乏相关报道。
CCl4诱导的肝纤维化动物模型中存在更全面的生理和细胞水平的变化，包括肝细胞坏死凋亡、星状细胞活化、肝窦内皮细胞毛细血管化和巨噬细胞募集等，可作为筛选抗肝纤维化药物的有效动物模型[12]。本研究在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型上，研究Arb对肝脏纤维化的治疗作用，并在体外细胞实验上初步探索其作用机制。
1. 材料和方法
1.1. 材料
1.1.1. 实验动物与细胞
C57BL/6小鼠由广东省实验动物中心提供，饲养于广东药科大学实验动物中心SPF级环境中，12 h光暗循环条件下，自由饮食饮水。24只实验小鼠随机分为4组：Oil对照组、CCl4模型组、Arb低剂量组和Arb高剂量组，6只/组，饲养至体质量约25 g（7~8周）开始实验。人单核细胞株THP-1和人肝脏星形细胞株LX-2在37 ℃，5% CO2及饱和湿度培养箱环境中用DMEM培养基+10%FBS+1%双抗（青霉素和链霉素）培养。小鼠巨噬细胞株RAW264.7在37 ℃，5% CO2及饱和湿度培养箱环境中用1640培养基+10%FBS+1% 双抗（青霉素和链霉素）培养。
1.1.2. 实验试剂
熊果苷（南京道斯夫）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；四氯化碳、玉米油（上海阿拉丁公司）；苏木素染液（雷根生物公司）；CCK-8试剂盒、伊红染液（Biosharp）；α-SMA抗体、CD68抗体（Boster公司），GAPDH抗体（HC301，北京全式金生物技术公司），P-NF-κB p65抗体（沈阳万类生物科技有限公司），NF-κB p65抗体（北京博奥森生物技术有限公司），p-Smad3抗体、Smad2/3抗体、Akt抗体（Cell Signaling Technology），p-Akt抗体（Proteintech）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Scientific）；显影液、SYBR Green（Bio-Red）；逆转录试剂盒（TakaRa）；DAB Substrate kit（Thermo）；脱脂奶粉[生工生物工程（上海）股份有限公司]。
1.1.3. 实验仪器
电泳组合（Bio-Rad），高速离心机（Thermo），光学显微镜（Olympus），LC480荧光定量PCR仪（Roche），化学发光仪（上海勤翔公司）。
1.2. 实验方法
1.2.1. 动物模型构建
选取健康雄性C57BL/6小鼠24只随机分为4组，对照组（Oil组）、模型组（CCl4组）、Arb低剂量给药组（Arb-L组）和Arb高剂量给药组（Arb-H组）。Oil组腹腔注射玉米油5 mL/kg，每周2次；CCl4组腹腔注射20% CCl（4 Oil∶CCl4=4∶1）5 mL/kg，2次/周；Arb-L组和Arb-H组腹腔注射CCl4 5 mL/kg，2次/周，并每日使用Arb灌胃，其中低剂量25 mg/kg，高剂量50 mg/kg。造模时间持续6周，造模结束后，麻醉小鼠，取材。动物实验经广东药科大学实验动物伦理委员会批准（伦理号：gdpulacspf2022061）。
1.2.2. 细胞给药
用精密天平称量Arb粉末，在超净台中加入DMSO溶解完全。将LX-2细胞接种于六孔板中培养24 h，使用无血清DMEM饥饿8 h。随后分别给予含0、1、2.5、5、10 μmol/L Arb的无血清DMEM培养基，处理24 h后收取细胞蛋白，检测相关指标。
1.2.3. CCK-8细胞活性检测
Arb给药作用THP-1和LX-2细胞24 h后严格遵照Cell Counting Kit-8说明书，对各组THP-1和LX-2细胞进行细胞活性检测。
1.2.4. 小鼠血清生化检测
根据AST、ALT试剂盒说明检测吸光度并计算血清中AST、ALT的含量。
1.2.5. 小鼠肝组织HE染色
石蜡切片置于65 ℃烘箱中烘1 h；二甲苯浸泡脱蜡2次，20 min/次；无水乙醇浸泡2次，15 min/次；95%乙醇浸泡10 min；90%乙醇浸泡5 min；80%乙醇浸泡5 min；自来水浸泡5 min；将切片放置在苏木精染液中7 min，自来水下清洗片子10 min；硫酸乙醇酸化1 s，自来水冲洗10 min；伊红染液染色30 s，蒸馏水洗去浮色，将切片依次放置在75%乙醇、85% 乙醇、95%乙醇、无水乙醇和二甲苯中进行脱水处理各5 s。使用中性树脂封片，置于光学显微镜下，观察肝组织病理变化并拍摄收集图片。
1.2.6. 小鼠肝组织天狼猩红染色
石蜡切片置于65 ℃烘箱中烘1 h；二甲苯浸泡脱蜡2次，20 min/次；无水乙醇浸泡2次，15 min/次；95%乙醇浸泡10 min；90%乙醇浸泡5 min；80%乙醇浸泡5 min；自来水浸泡5 min；天狼星红染液避光染色1 h，0.5%冰醋酸涮洗2 min，将切片依次置于75%乙醇、85% 乙醇、95%乙醇、无水乙醇和二甲苯中进行脱水处理各5 s。使用中性树脂封片，显微镜下观察结果并拍摄收集图片。图片使用ImageJ软件分析，并对结果进行统计分析。
1.2.7. 小鼠肝组织免疫组化
石蜡切片按上述步骤进行脱蜡，随后使用柠檬酸盐溶液加热进行抗原修复，冷却至室温，再依次使用3%过氧化氢浸泡10 min和1%牛血清白蛋白（BSA）封闭1 h。4 ℃孵育一抗α-SMA（1∶200）或CD68（1∶200）过夜。次日使用PBS洗3次，5 min/次，随后二抗（1∶200）室温孵育1 h。最后，用二氨基联苯胺（DAB）显微镜下滴染着色，用苏木精复染30 s，自来水洗5 min，0.5%盐酸乙醇分化1 s，自来水洗10 min。随后将切片依次置于75%乙醇、85% 乙醇、95%乙醇、无水乙醇和二甲苯中进行脱水处理各5 s。使用中性树脂封片，显微镜下观察结果并拍摄收集图片。图片使用ImageJ软件分析，并对结果进行统计分析。
1.2.8. Western blot检测
称取各组小鼠20~25 mg肝组织，并加入500 μL含1% PMSF的RIPA缓冲液，裂解后得到总蛋白。按照BCA蛋白测定试剂盒说明书检测总蛋白的浓度。总蛋白中加入蛋白上样缓冲液，于100 ℃金属浴3 min变性。用10% SDS-PAGE电泳分离变性蛋白质，4 ℃条件下以恒转电流转移到PVDF膜上。将PVDF膜放入5%脱脂奶粉中，于室温下摇床封闭1 h，TBST洗膜后分别于以下抗体4 ℃摇床孵育过夜：Akt（1∶1000），p-Akt（1∶1000），p65（1∶1000），p-p65（1∶1000），Smad2/3（1∶1000），p-Smad3（1∶1000），α-SMA（1∶1000），GADPH（1∶1000）。次日，TBST洗膜后加入二抗（1∶5000）室温孵育2 h。将PVDF膜置于全自动化学发光图像分析系统中显影，Image J软件扫描并计算蛋白相对表达量。
1.2.9. q-PCR检测
取各组小鼠肝组织20~25 mg，加入TRIzol试剂，裂解后得到总RNA。按TAKARA反转录试剂盒说明书操作，扩增条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，循环40个周期。结果根据各组Ct值，使用2-△△Ct法计算目的基因与内参基因β-actin的相对表达量。引物序列见表 1。
表 1.
引物序列
Primer sequences used in RT-qPCR
| Genes | Primer | Sequence (5′-3′) |
| a-SMA | Forward | GTCCCAGACATCAGGGAGTAA |
| Reverse | TCGGATACTTCAGCGTCAGGA | |
| a-SMA | Forward | GCAACTCGGACCTGGTCATAA |
| Reverse | CGGCCCGTGATGAGAAACT | |
| Pdgfb | Forward | CATCCGCTCCTTTGATGATCTT |
| Reverse | GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT | |
| Ccl2 | Forward | ATTGGGATCATCTTGCTGGT |
| Reverse | CCTGCTGTTCACAGTTGCC | |
| Col1α1 | Forward | GCTCCTCTTAGGGGCCACT |
| Reverse | CCACGTCTCACCATTGGGG | |
| Tnf-a | Forward | CCCTCACACTCAGATCATCTTCT |
| Reverse | GCTACGACGTGGGCTACAG | |
| β-actin | Forward | GGCTGTATTCCCCTCCATCG |
| Reverse | CCAGTTGGTAACAATGCCATGT |
1.2.10. 细胞Transwell实验
THP-1细胞（人单核细胞系）使用佛波酯（PMA）诱导24 h，待细胞贴壁后，0.25% 胰酶消化细胞，种入六孔板。RAW264.7细胞0.25%胰酶消化后种入六孔板。先使用无血清培养基饥饿细胞8 h，后分别给予DMSO和含1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的Arb处理24 h。24孔板下加入750 μL含10% FBS的培养基，上室加入细胞悬液，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h。培养结束后使用DAPI染色15 min，置于显微镜下观察。
1.3. 统计学分析
染色结果图片均使用Image J软件分析，所有数据均使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，多组比较时采用单因素方差分析，P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1. Arb对THP-1和LX-2细胞增殖活力的影响
与0 μmol/L组相比，不同浓度的Arb给药对THP-1和LX-2细胞的增殖活力无明显影响（P > 0.05，图 1）
图 1.
Arb对THP-1细胞和LX-2细胞增殖活力的影响
Effect of arbutin (Arb) treatment for 24 h on viability of THP-1 (A) and LX-2 cells (B).
2.2. Arb减轻CCl4诱导的小鼠肝损伤
HE染色结果显示，对照组小鼠的肝小叶结构清晰，肝细胞结构正常，排列整齐，且以中央静脉为中心呈现放射状、无明显炎症细胞浸润；模型组小鼠肝细胞排列分布紊乱，出现大范围炎性细胞浸润和肝细胞坏死。与模型组相比，Arb给药减轻CCl4诱导的肝组织结构损伤和炎症反应（图 2A）。模型组小鼠血清ALT和AST水平升高（P < 0.001），Arb低、高剂量组与模型组相比，血清ALT水平降低（P < 0.001），血清AST水平也降低（P < 0.05，图 2B）。
图 2.
熊果苷减轻四氯化碳诱导的肝损伤
Arb ameliorates CCl4-induced liver injury in mice. A: Representative images of HE staining of the liver tissues in the 4 groups. B: Serum levels of ALT and AST in mice in the 4 groups. ###P < 0.001 vs oil group; *P < 0.05, ***P < 0.001 vs CCl4 group.
2.3. Arb改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化
天狼猩红染色和免疫组化染色结果显示，CCl4诱导的模型组小鼠肝脏出现明显的胶原沉积（P < 0.001）和α-SMA蛋白表达增加（P < 0.001），Arb低、高剂量给药组的小鼠肝脏内胶原沉积和α-SMA蛋白表达相较于CCl4组均减少（P < 0.001，图 3A）。q-PCR结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肝组织中Pdgfb、Timp-1、a-SMA和Col1α1基因的mRNA表达水平均增加（P < 0.001）；与模型组相比，Arb低、高剂量给药组的小鼠肝组织内Pdgfb、Timp-1、a-SMA和Col1α1的mRNA表达水平减少（P < 0.05，图 3B）。Western blot结果显示，模型组小鼠肝脏α-SMA蛋白表达水平增加，Arb给药干预可减少小鼠肝脏内α-SMA蛋白的表达（图 3C）。
图 3.
熊果苷改善四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化
Arb attenuates CCl4-induced liver fibrosis in mice. A: Sirius Red and immunohistochemical staining for α-SMA in the liver tissues. B: mRNA levels of Pdgfb, Timp-1, a-SMA and Col1α1 in the liver tissues detected by RT-qPCR. C: Western blotting for α-SMAin the liver tissue. ###P < 0.001 vs oil group; *P < 0.05, ***P < 0.001 vs CCl4 group.
2.4. Arb减少CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝脏巨噬细胞浸润
CD68免疫组化染色结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肝组织中巨噬细胞标记物CD68表达增加（P < 0.001）；而与模型组相比，Arb给药可有效减少肝组织中CD68表达水平，减少肝脏巨噬细胞募集（P < 0.001，图 4A）。q-PCR结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肝组织中Tnf-a和Ccl2的mRNA表达水平增加（P < 0.001）；与模型组相比，Arb各剂量给药后肝组织中Tnf-a和Ccl2的mRNA表达水平出现不同程度的降低（P < 0.05，图 4B）。
图 4.
熊果苷减少了四氯化碳诱导的小鼠肝内巨噬细胞募集
Arb reduces CCl4-induced macrophage infiltration in mouse liver. A: Immunohistochemistry for CD68 in the liver tissues. B: mRNA levels of Tnf-a and Ccl2 in the liver tissues. ###P < 0.001 vs oil group; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs CCl4 group.
2.5. Arb抑制巨噬细胞迁移募集
细胞Transwell实验结果显示，Arb给药后可以有效抑制THP-1和RAW264.7巨噬细胞的迁移作用，并且呈现剂量依赖性（图 5）。
图 5.
熊果苷抑制THP-1细胞和RAW264.7细胞的迁移作用
Arb inhibits migration of THP-1 and RAW264.7 cells (DAPI staining).
2.6. Arb抑制LX-2细胞Akt、p65和Smad3磷酸化和α-SMA表达
Western blot结果显示，Arb显著抑制了LX-2细胞中Smad3、Akt和p65的蛋白磷酸化，并下调了α-SMA的蛋白表达，且呈剂量依赖性（图 6）。
图 6.
熊果苷减少Akt/NF-κB和Smad相关通路蛋白的磷酸化并抑制LX-2细胞活化
Arb reduces phosphorylation of Akt/NF-κB and Smad signaling pathway proteins and inhibits LX-2 cell activation. The protein levels of Akt, p-Akt, p65, p-p65, Smad3, p-Smad3 and α-SMA were determined by Western blotting. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs Control group.
3. 讨论
肝纤维化是慢性肝病患者常见的病理过程，其发生进程中常伴随长期的炎症损伤、微循环障碍和细胞外基质积累等[13]。其中巨噬细胞的募集是炎症反应的重要环节，并且是引发肝纤维化的关键因素[14]。巨噬细胞特异性生物标志物和靶向巨噬细胞的药物有望用于非酒精性脂肪肝炎和肝纤维化的诊断和治疗[14]。小鼠CCl4腹腔注射模型在生理水平上与人体肝纤维化病理状况相似，表现出肝脏内多种细胞的严重失调，如巨噬细胞募集和HSC活化等[15]。因此本研究采用CCl4诱导的肝纤维化模型研究Arb改善肝纤维化的作用与机制。
Arb在0~10 μmol/L对THP-1和LX-2细胞的增殖活性无显著性影响，提示在24 h的作用时间下，0~10 μmol/L是Arb的安全浓度。基于以上实验结果，本研究选取研究选用0、1、2.5、5和10 μmol/L作为实验药物浓度，以24 h作用时间作为体外细胞模型条件。
当肝脏损时，肝细胞内的ALT和AST从细胞中进入血液，因此ALT和AST的血清含量水平被认为是临床判断肝损伤的重要指标[16]。血清检测与HE染色的结果显示，与CCl4组相比，Arb给药显著改善了小鼠的肝脏损伤，并且减少了炎性细胞浸润。在慢性肝病进程中，富含胶原Ⅰ和Ⅲ的细胞外基质不断积累，导致肝纤维化，而细胞外基质的主要分泌来源是活化的HSC[17]。因此，HSC的活化是肝纤维化的主要原因，α-SMA是肝脏内激活的HSC标志物，其阳性表达在汇管区纤维间隔及靠近纤维间隔的肝窦成纤维细胞胞浆[18]。实验结果显示，Arb给药组的α-SMA表达和胶原沉积较CCl4组明显减少，提示Arb具有改善肝纤维化的效果。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/CCL2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与肝脏受损后的巨噬细胞浸润及炎症反应有着直接联系，此外α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原蛋白（col1）、组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）和血小板衍生生长因子的表达与HSC活化和肝纤维化发生密切相关[19]。在给予Arb治疗后，可以发现小鼠肝脏内上述指标对应的基因α-SMA，Pdgfb，Col1α1，Timp-1，Ccl2和Tnf-a的mRNA水平相较于模型组有明显的下调。综合以上结果说明，Arb可以减轻肝脏内炎症反应，同时抑制HSC的活化，并减少肝内的胶原沉积，改善肝纤维化，但其作用机制尚不明确。
既往研究表明巨噬细胞的募集是肝纤维化启动的关键环节，CD68是巨噬细胞的标志物[20]。巨噬细胞会在肝脏炎症反应过程中分泌多种细胞因子，进而激活HSC的相关信号通路使其活化[21]。治疗性抑制巨噬细胞的募集可以有效改善肝脏炎症及纤维化[22]。细胞迁移实验的结果表明，Arb可以抑制巨噬细胞的迁移作用，提示Arb可能通过减少巨噬细胞向肝脏损伤部位的募集，减轻肝脏内炎症反应，进而改善肝纤维化。
靶向HSC活化的相关通路并抑制其转分化为成纤维细胞，是一种有效的抗纤维化策略[23]。以往研究显示，多条信号通路参与调控HSC的活化增殖，其中PI3K/Akt/NF-κB信号通路和Smad信号通路是与HSC活化增殖及肝纤维化发生发展密切相关的信号途径[24, 25]。Akt信号通路不仅可以通过影响MMP和TIMP的平衡阻碍细胞外基质的降解，还可以调节HSC的增值与凋亡，表明Akt信号通路从多个方面参与了肝纤维化的形成[26]。Smad通路在肝纤维化过程中会被激活，其中Smad3是促进肝纤维化的最为关键的通路蛋白[27]。Smad3不仅在许多成纤维基因（如collagens，α-SMA等）的表达中起着关键作用，还可以激活TIMP-1和抑制MMP-1阻碍细胞外基质的降解，最终促进肝纤维化的发生[27]。Wu等发现槲皮素可以通过调节Akt通路和Smad通路，减少HSC活化，改善肝纤维化[28]。Arb减少HSC活化、抗肝纤维化的作用机制是否与调节Akt和Smad通路有关，目前尚不清楚。因此本研究使用人肝星状细胞系LX-2细胞作为体外研究的模型，在蛋白水平上做了验证，发现Arb处理可以有效抑制α-SMA的表达，同时可显著下调Akt、p65和Smad3的蛋白磷酸化水平，表明Arb抑制了Akt/NF-κB通路和Smad通路并减少了HSC的活化。
综上所述，本研究揭示Arb可能通过减少肝脏巨噬细胞募集和抑制HSC活化相关的Akt/NF-κB和Smad信号通路，从而改善肝纤维化。
Biography
曹家樊，在读硕士研究生，E-mail: caojiafan1320@163.com
Funding Statement
国家自然科学基金（82070590）；广东省基础与应用基础研究重大项目（2019B030302005）
Supported by National Natural Science Foundation of China (82070590)
Contributor Information
曹 家樊 (Jiafan CAO), Email: caojiafan1320@163.com.
兰 天 (Tian LAN), Email: lantian012345@163.com.
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