苗药四大血减轻大鼠的类风湿性关节炎：基于下调基质金属蛋白表达

Abstract

目的

探究贵州苗医验方“四大血”（SX）对胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠关节骨、软骨破坏及滑膜血管新生的作用机制。

方法

将42只SD大鼠均分为空白组（Nor）、模型组（Mod）、雷公藤多苷片阳性对照组（GTW，40 g/kg）和SX高、中、低剂量组（SX 40、20、10 g/kg），7只/组。通过皮下注射牛型Ⅱ胶原来建立CIA大鼠模型，并且通过每天经口灌胃的方式给予治疗，持续3周。采用AI评分分别于造模前，灌胃前1周，灌胃后1周，灌胃2周，灌胃3周观察大鼠后足关节病变情况。HE染色法观察大鼠关节滑膜病理变化，ELISA法检测TNF-α、IL-1β，Real-time PCR检测滑膜组织中NF-κB p65、MMP1、MMP2、MMP9 mRNA表达水平，Western blot检测滑膜组织中NF-κB p65、基质金属蛋白1（MMP1）、MMP2、MMP9蛋白表达水平。网络药理学获取SX外用途径治疗类风湿性关节炎（RA）中的重要靶蛋白，经拓扑分析后筛选出核心靶蛋白。

结果

GTW组和SX高、中、低剂量组足跖肿胀度及关节炎指数评分均小于Mod组（P<0.05）。光镜下观察大鼠关节滑膜病理组织切片，Mod组可见较多软骨细胞坏死，软骨下层骨组织受侵蚀，并有新生毛细血管形成；而GTW组和SX高、中、低剂量组中，软骨及骨损伤均有不同程度地降低，新生血管数量减少，随SX剂量增高，治疗效果呈逐渐增强的趋势。与Mod组相比，GTW组和SX高、中、低剂量组滑膜组织TNF-α、IL-1β、NF-κB p65、MMP1、MMP2、MMP9 mRNA和蛋白表达量有不同程度地降低（P<0.05）。经网络药理学分析得到外用SX治疗RA中的核心靶蛋白—MMPs。

结论

SX可以改善CIA大鼠关节骨和软骨的破坏、减缓滑膜血管新生，其机制可能为调节MMP基因表达的TNF-α/IL-1β/NF-κB-MMP1、2、9信号转导途径，下调MMPs表达水平，此外可初步推断MMPs在除口服治疗途径以外仍发挥关键作用。

类风湿性关节炎（RA）是一种致残率较高的慢性自身免疫性疾病，滑膜组织侵犯和滑膜增生是RA发展的重要病理改变之一，可进而导致软骨和骨的破坏^{[1, 2]}。目前其发病机制尚不完全清楚^[3]。滑膜成纤维细胞（FLSs）在其发病机制中起主导作用^[4]。前期课题组证明在RA中异常活化的RA-FLSs表现出类似于肿瘤样特性，可经历“肿瘤样”增殖、侵袭，并可迁移到未受影响的关节，附着在软骨和骨上，侵入细胞外基质（ECM）^[5]。而ECM是维持骨组织完整性的重要结构成分。在正常的生理过程中，关节软骨基质蛋白的合成和降解处于动态平衡状态; 然而，在RA患者中，这种平衡被破坏。关节软骨中的蛋白聚糖、胶原蛋白和ECM附属蛋白的损失，永久性地改变了组织的生物力学特性，最终导致滑膜关节衰竭^[6]。在RA患者中，基质金属蛋白酶（MMPs）降解ECM被认为是关节破坏所必需的^[7]。MMPs是生物体中一种重要的蛋白水解酶。在细胞因子的刺激下，滑膜细胞和血管内皮细胞产生多种基质金属蛋白酶，打破了细胞外基质的产生和降解之间的平衡，这是RA的重要发病机制之一^[8]。而根据相关研究显示MMP-1、MMP-2、MMP-9能直接降解骨和软骨^[7]，并能刺激内皮细胞, 使血管再生形成血管翳^{[8, 9]}。

MMP的活性受到NF-κB信号转导途径的调控。当身体受到外部因素的刺激时，NF-κB信号通路被激活，导致下游MMP过表达，并与其他炎症因子一起参与炎症反应，加速关节运动，其中一个结果是软骨的破坏^[10]。其中，肿瘤坏死因子-α、白介素-1β（IL-1β）在组织炎症、自身免疫中发挥关键作用，是一种强炎症细胞因子。TNF-α抑制剂在临床上已被用于平衡高TNF水平导致的RA关节炎症^[11]。目前可用的TNF抑制剂有依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗和certolizumab pegol。TNF-α抑制剂可显著改善RA的治疗效果^[12]。TNF-α、IL-1β可通过启动子与转录因子结合经由核因-κB（NF-κB）信号转导途径激活MMP基因^[13]，使关节和滑膜成纤维细胞等分泌MMP-1、MMP-2、MMP-9等^[14]，从而参与疾病进程^[15]。多种MMPs如MMP-1、MMP-9和受促炎性细胞因子的诱导性分泌而在滑膜成纤维细胞中表达上调，被认为在RA关节软骨退化中起关键作用，可能参与RA患者的关节损伤^[16]。因此基于MMP表达的信号通路探索骨与软骨的破坏与血管新生的作用将为RA的发生发展提供关键线索。

目前，以非甾体类抗炎药、糖皮质激素为主的治疗药物起效慢，且毒副作用较大^[17]，而生物药物(如托珠单抗)和口服Janus激酶抑制剂（如托法替尼）虽已被研制出来并应用于临床，但这些新药非常昂贵，且并不是对所有RA患者都有效^[18-20]，因此进一步探究和开发新的治疗药物是十分迫切的。中药被证实在改善RA的临床症状和稳定病情等方面展现出独特优势，可以弥补西药的不足，具有多靶点、多途径、多层次治疗RA的特点，且其参与类风湿关节炎的治疗也有较高的认可度^[21-23]。贵州特色苗医药方“四大血”（SX）是由鸡血藤、五花血藤、见血飞、黑骨藤四种藤本药材组成，作为苗族地区流传的通气散血的代表方剂，是治疗RA的优势药物，但其作用机制不清，尚处于经验用药阶段^[24]。课题组前期研究结果显示，通过SX水煎液可减轻胶原诱导性关节炎大鼠（CIA）关节骨和软骨的破坏，抑制关节滑膜组织炎症，减少血管生成改善血管新生等病理表现，并由网络药理学结果显示基质金属蛋白家族中的MMP1、MMP2、MMP9是口服治疗途径中四大血的主要靶点^[25]，因此本研究通过构建CIA大鼠模型以TNF-α、IL-1β/NF-κB/MMPs信号通路为靶点，探究SX对CIA大鼠关节骨和软骨及滑膜血管增生的干预机制，为临床用药提供更多的科学依据。在灌胃训练中，我们发现操作不当会导致大鼠患处皮肤与药液接触，同时我们了解到目前存在治疗RA的其他外用药方^{[26, 27]}，故本小组利用网络药理学模拟分析并预测SX经皮渗透治疗RA的作用机制，为进一步探索SX的其他临床应用提供理论基础。

1. 材料和方法

1.1. 实验材料

1.1.1. 实验动物与药物

42只雄性SPF级SD大鼠（伦理审查编号：2200095），8周龄，体质量为180~220 g，贵州医科大学实验动物中心提供，合格证号[SYXK（黔）2018-001]。SX由五花血藤、鸡血藤、见血飞、黑骨藤按15∶22∶15∶8比例组成，药材均由贵州中医药大学中医学院苗医药教研室提供，并经田振华副教授鉴定，雷公藤多苷片购至黄石飞云制药公司（批号：20080301）。

1.1.2. 主要试剂与仪器

不完全弗氏佐剂（Sigma），牛Ⅱ型胶原（Chondrex），TNF-α及IL-1β试剂盒（上海巧伊生物科技有限公司），一抗NF-κB、MMP1、MMP2、MMP9（华安生物），二抗（Bioworld），PCR逆转录试剂盒（宝日医生物技术有限公司），水平电泳槽DYY-Ⅲ31D（北京六一仪器厂），酶标仪（BIO-TEK），Quanity One凝胶成像分析系统（BIO-RAD），DYY-5型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.2. 方法

1.2.1. 分组与造模

42只SPF级雄性SD大鼠，体质量为180~200 g，随机分为空白组（Nor）、模型组（Mod）、“四大血”高剂量组（SX 40 g/kg）、中剂量组（SX 20 g/kg）、低剂量组（SX 10 g/kg）和雷公藤多苷片对照组（GTW40 g/kg），7只/组。适应性饲养1周后造模，将2 mg/mL牛Ⅱ型胶原与等量不完全弗氏佐剂于冰上混合，充分乳化后，以1滴乳化剂于水中不扩散为准，大鼠麻醉后，取乳化后的混合物0.2 mL于尾根部皮下注射进行初次免疫，1周后于足跖皮下加强免疫1次，通过关节炎指数（AI）评分判定造模情况，其中，达到4分及4分以上，则判定造模成功。

1.2.2. 药物制备与给药方案

五花血藤、鸡血藤、见血飞、黑骨藤，按照15∶22∶15∶8比例配制，共取2000 g，加适量水煮3次（时间分别为1 h、30 min、30 min），合并浓缩液500 mL，生药浓度为4 g/mL，4 ℃冰箱备用。第2次造模结束后开始给药，给药方案：SX高、中、低剂量组灌胃给药浓度分别为40、20、10 g/kg（按生药计）；GTW组给药浓度为40 g/kg，Nor组和Mod组用等量0.9%氯化钠注射液灌胃，1次/d，连续21 d。

1.2.3. 各组大鼠AI、关节肿胀率测算

每日定期观察大鼠情况，拍照记录关节红肿、关节畸形情况，初次注射乳化剂当天起，采用AI评分分别于造模前1周，灌胃前1周，灌胃后1周，灌胃2周，灌胃3周观察大鼠后足关节病变情况。AI评分标准如下：0分（无红肿）；1分（关节有红色斑点或轻度肿胀）；2分（关节病变中度红肿）；3分（关节除中度红肿外，伴有轻度功能障碍）；4分（关节重度红肿，僵直甚至畸形，严重功能障碍）；将2只后踝关节的病变程度累计积分，计算关节炎指数，每只大鼠AI评分最高为8分，AI评分越高表示关节病变越严重。初次免疫起，每隔1周，采用大鼠足部容积测量仪测量大鼠双后足肿胀度，足肿胀度计算公式如下：ER（%）=（V1-V2）/V2× 100%（其中V2为造模前的容积，V1造模后的容积）。

1.2.4. 标本采集

给药3周后，麻醉各组大鼠，真空采血管进行心脏取血，静置10 min后4 ℃，3000 r/min离心10 min，分离血清用于ELISA实验；取脾脏和胸腺组织并称量各组织质量，计算脾腺指数，胸腺指数（脾指数）=胸腺（脾）质量（g）/体质量（g）×100%；并取各组大鼠炎性后腿，一部分使用4%多聚甲醛固定，用于HE染色，另一部分使用生理盐水冲洗后置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blotting及Real-time PCR检测相关蛋白表达水平。

1.2.5. 滑膜组织病理学观察

将固定于4%多聚甲醛中的膝关节滑膜组织进行石蜡包埋、切片、贴片、染色，并使用光学显微镜观察周围组织病理变化。

1.2.6. Western blot检测NF-κB、MMP-1、MMP-2、MMP-9蛋白表达

使用RIPA裂解液提取滑膜组织总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳，PVDF转膜，封闭，加入对应的一抗NF-κB（1∶1000）、MMP-1（1∶1000）、MMP-2（1∶1000）、MMP-9（1∶1000）、β-actin（1∶5000），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤5 min/次，共6次，加入二抗（1∶5000），室温摇床缓慢摇动1.5 h，TBST洗涤5 min/次，共6次，凝胶成像仪上进行蛋白条带检测，Image Pro Plus 6.0软件分析蛋白表达量。

1.2.7. Real-time PCR检测滑膜组织中NF-κB、MMP1、MMP2、MMP9 mRNA表达

使用Trizol Reagent试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，GAPDH作为内参，采用2^-ΔΔCt法对结果进行分析，扩增程序为：95 ℃ 300 s；循环反应，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，循环40次。引物序列如表 1。

表 1.

引物序列

Sequence of primers for RT-PCR

Primer	Sequence
NF-κB
Forward	5'-ATGGCAGACGATGATCCCTAC-3
Reverse	5'-CGGAATCGAAATCCCCTCTGTT-3'
MMP1
Forward	5'-AAAATTACACGCCAGATTTGCC-3'
Reverse	5'-GGTGTGACATTACTCCAGAGTTG-3'
MMP2
Forward	5'-TACAGGATCATTGGCTACACACC-3'
Reverse	5'-GGTCACATCGCTCCAGACT-3'
MMP9
Forward	5'-TCCTGGTGCTCCTGGCTCTA-3'
Reverse	5'-GTGTCCGTGAGGTTGGAGGTT-3'

1.2.8. 网络药理学方法

1.2.8.1. 苗药“四大血”的活性成分及潜在靶基因的预测

首先在中药系统药理学分析平台（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库（http://organchem.csdb.cn），获取化合物吸收、分布、代谢、排泄(ADME)参数，然后根据Alogp=2~3^{[28, 29]}、DL>0.18的标准^[30]，筛选出表皮渗透性较佳的成分（图 1），然后再利用有机小分子生物活性数据数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)对化合物的二维结构、标准SMILES和PubChemID进行标定；将化合物的标准SMILES上传至瑞士生物信息研究所靶点预测工具（http://www.swisstargetprediction.ch）预测其潜在靶基因。

图 1.

各组大鼠足肿胀度

Hind limb joint swelling of the rats in each group. A-F: Normal control group, CIA model group, GTW group, Sidaxue (SX) 40 g/kg group, SX 20 g/kg group, and SX 10 g/kg group, respectively.

1.2.8.2. 获取RA的靶基因及交集基因筛选

从GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMID数据库（https://omim.org/）中获取类风湿性关节炎的靶基因，导出按照Relevance score的值，从高到低对Gene Symbol进行排列。将筛选出的药物成分靶基因与RA靶基因求交集，其交集基因即为外用四大血治疗类风湿性关节炎作用的潜在靶点。

1.2.8.3. 蛋白互作网络构建及核心蛋白筛选

将通过1.2.1.2得到的潜在靶点导入STRING平台（https://string-db.org/）获取PPI网络图，使用Cytoscape3.8.0软件构建PPI网络，利用软件中的Analyze Network功能进行拓扑分析，获得各节点的中心度值（degree），并根据degree值筛选出核心蛋白。

1.3. 统计学分析

应用SPSS 23.0软件进行数据分析，数据采用均数±标准差表示，各组间数据比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义，所有实验都是独立重复3次。

2. 结果

2.1. SX对各组大鼠关节肿胀度的影响

第2次造模结束后，与Nor组相比，各组大鼠双后肢均出现明显红肿，毛发干枯现象，行动迟缓甚至无法直立行走，连续给药3周后，与Mod组相比，各给药组足肿度均降低，其中GTW组、SX 40 g/kg足肿度降低最显著（P<0.001，表 2、图 1）。

表 2.

SX对CIA大鼠双后肢足肿胀度的影响

Effect of Sidaxue on swelling of bilateral hind limb joints in rats with collagen-induced arthritis (Mean±SD, n=7)

Group	1week before the animal model-making	1week before the intragastric administration	1week after intragastric administration	2weeks after intragastric administration	3weeks after intragastric administration
Nor: Normal control group; Mod: CIA model group; GTW: Tripterygium glycosides group; SX: Sidaxue group. **P<0.01, ***P<0.001 vs the Nor group; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs the Mod group; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01, ▲▲▲P<0.001 vs GTW group.
Nor	1.326±0.087	1.364±0.084	1.415±0.063	1.465±0.067	1.534±0.093
Mod	1.287±0.073	1.735±0.081***	1.736±0.056***	1.769±0.078***	1.789±0.082**
GTW	1.336±0.071	1.665±0.075	1.526±0.086###	1.474±0.076###	1.515±0.085###
SX 10g/kg	1.287±0.068	1.721±0.067	1.689±0.089▲▲	1.657±0.062##▲▲▲	1.645±0.159#▲▲▲
SX 20g/kg	1.331±0.062	1.734±0.036	1.656±0.067#	1.653±0.049###▲	1.554±0.124##▲▲
SX 40g/kg	1.292±0.036	1.684±0.093	1.546±0.078###	1.464±0.061###	1.531±0.079##

2.2. SX对各组大鼠关节AI评分的影响

AI评分可以客观反映出大鼠发病的情况，连续给药3周后，与Nor组相比，Mod组大鼠AI评分明显增高（P<0.001），而与Mod组相比，GTW组和SX 40 g/kg组的AI评分明显下降（P<0.001、P<0.01），而其余给药组差异无统计学意义（表 3）。

表 3.

SX对CIA大鼠关节AI评分的影响

Effect of Sidaxue on arthritis index score in rats with collagen-induced arthritis (Mean±SD, n=7)

Group	1 week before CIA modeling	1 week before drug administration	1 week after administration	2 weeks after administration	3 weeks after administration
***P<0.001 vs the Nor group; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs the Mod group.
Nor	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00
Mod	3.75±0.51***	3.62±0.53***	3.62±0.46***	3.50±0.53***	3.62±0.518***
GTW	3.55±0.65	3.53±0.55	2.50±0.53#	1.25±0.43##	0.37±0.58###
SX 10g/kg	3.85±1.51	3.63±0.58	3.25±0.62	2.62±0.51	1.87±0.64
SX 20g/kg	3.58±0.55	3.51±0.52	2.87±0.64	1.87±0.64	1.25±0.42
SX 40g/kg	3.87±0.63	3.67±0.51	2.62±0.58	1.50±0.53#	0.50±0.53##

2.3. SX对CIA大鼠脾脏及胸腺的质量分数的影响

连续给药3周后，与Nor组相比，Mod组胸腺和脾脏指数均升高（P<0.001），与Mod组相比，其中，GTW组、SX 40 g/kg组胸腺和脾脏指数均明显降低（P<0.001），SX 20 g/kg胸腺和脾脏指数有所下降（P<0.05、P<0.01），且SX 40 g/kg组与GTW组相比，差异无统计学意义（图 2）。

图 2.

SX对CIA大鼠脾脏及胸腺的质量分数的影响

Effect of Sidaxue on mass fraction of the spleen and thymus in rats with collagen-induced arthritis (n=7). ^***P<0.001 vs the Nor group; ^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001 vs Model group; ^▲P<0.05, ^▲▲▲P<0.01 vs GTW group.

2.4. SX对CIA大鼠滑膜组织病理学的影响

光镜下观察组织病理变化显示，连续给药3周后，Nor组关节软骨结构完整，骨层清晰，关节面光滑，软骨细胞分布均匀，滑膜组织未见炎性细胞浸润及纤维组织增生；Mod组滑膜细胞坏死，坏死区域见多量炎性细胞浸润；GTW组滑膜组织衬里层完整清晰，衬里下层见少量炎性细胞浸润；SX 40 g/kg、SX 20 g/kg组关节腔内滑膜组织充血明显减轻，未见明显炎性细胞浸润。SX 10 g/kg组软骨组织中度增生，软骨细胞生长活跃，炎性细胞浸润程度较Mod组有所减轻（图 3）。

图 3.

SX对各组大鼠滑膜组织病理改变的影响

Effect of Sidaxue on synovial pathology of the rats (HE staining, original magnification: ×100). A-F: Normal control group, CIA model group, GTW group, SX 40 g/kg group, SX 20 g/kg group, and SX 10 g/kg group, respectively.

2.5. 血清TNF-α、IL-1β含量

给药第21天时，与Nor组比较，Mod组血清TNF-α、IL-1β含量升高（P<0.05）；与Mod组比较，GTW、SX40 g/kg组血清IL-1β含量下降（P<0.05），SX 40 g/kg、GTW组血清TNF-α含量下降明显（P<0.05，图 4）。

图 4.

SX对CIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影响

Effect of Sidaxue on serum TNF-α and IL-1β levels in rats with collagen-induced arthritis (Mean±SD, n=7). ^*P<0.01 vs the Nor group; ^#P<0.05 vs the Mod group.

2.6. SX对CIA大鼠中NK-κB、MMP1、MMP2、MMP9 mRNA表达水平的影响

给药3周后，取大鼠膝关节滑膜组织进行RT-PCR实验，结果显示，与Nor组相比，Mod组中NF-κB mRNA表达水平增高（P<0.01）；而与Mod组相比，SX 40 g/kg组与GTW组中NF-κB的mRNA表达水平降低（P<0.01、P<0.05），而SX 20 g/kg、SX 10 g/kg组差异无统计学意义（图 5A）。进一步检测MMP1、MMP2、MMP9 mRNA表达，结果显示，与Nor组相比，Mod组中MMP1、MMP2、MMP9 mRNA表达均增高（P<0.001、P<0.001、P<0.01），而与Mod组相比，SX 40 g/kg、SX 20 g/kg组MMP1、MMP2、MMP9 mRNA表达均降低，其中，SX 40 g/kg组降低更显著（P<0.001、P<0.001、P<0.01），而SX 10 g/kg组差异无统计学意义（图 5B~D）。

图 5.

SX对CIA大鼠中NF-κB、MMP1、MMP2、MMP9 mRNA表达水平的影响

Effect of Sidaxue on mRNA expression levels of NF-κB, MMP1, MMP2 and MMP9 in the synovium of the rats with collagen-induced arthritis (n=7). ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs the Nor group; ^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001 vs the Mod group.

2.7. SX对CIA大鼠中NF-κB、MMP1、MMP2、MMP9蛋白表达水平的影响

给药3周后，与Nor组相比，Mod组中NF-κB的蛋白表达水平增高（P<0.01）；而与Mod组相比，SX进一步检测促血管生长因子MMP1、MMP2、MMP9蛋白表达，结果显示，与Nor组相比，Mod组中MMP1、MMP2、MMP9蛋白表达水平增高（P<0.001、P<0.001、P<0.01）；与Mod组相比，SX 40 g/kg、SX 20 g/kg组MMP1、MMP2、MMP9表达均降低，其中，SX 40 g/kg组降低更显著（P<0.001），SX 10 g/kg中MMP1、MMP2、MMP9蛋白表达差异无统计学意义（图 6A~D）。40 g/kg组下调NF-κB蛋白表达（P<0.01，P<0.001），SX 10 g/kg组NF-κB的蛋白表达差异无统计学意义（图 6）。

图 6.

SX对CIA大鼠中NF-κB、MMP1、MMP2、MMP9蛋白表达水平的影响

Effect of Sidaxue on expression level of NF-κB, MMP1, MMP2 and MMP9 proteins in the synovium of the rats with collagen-induced arthritis (n=7). ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs the Nor group; ^##P<0.01, ^###P<0.001 vs the Mod group.

2.8. 网络药理学分析

2.8.1. 网络药理学中苗药“四大血”的活性成分和潜在靶基因的预测

筛选出类药性及表皮渗透性俱佳的杠柳甙元（MOL005658）、大豆苷元（MOL000390）、刺芒柄花素（MOL000392）、茵芋碱（MOL002663）等20个有效成分，并预测出其潜在164个靶基因。

2.8.2. 获取类风湿性关节炎的靶基因及交集基因筛选

运用GeneCards、OMIM数据库检索RA靶点，整理后得到靶点2620个。与药物靶点取交集共得到42个交集基因，即为四大血治疗类风湿性关节炎作用的潜在靶点。2.8.3蛋白互作网络构建及关键靶点结果分析结果显示，PPI网络有37个节点（图 7A）。利用Analyze Network进行拓扑分析，获得各节点的中心度值（表 3），并筛选出度值排名前13的靶蛋白，即核心蛋白（图 7B）。

图 7.

蛋白互作网络构建及关键靶点分析

Protein-protein interaction network (A) and analysis of the key targets (B).

3. 讨论

RA是一种以关节滑膜为主要靶器官的慢性自身免疫性疾病，属于中医“痹病”的范畴，以雷公藤为代表的中药在治疗RA方面取得了较好的效果^[31]。国内的一项对照试验研究表明雷公藤制剂与甲氨蝶呤（MTX）联用效果优于MTX单用，并且其单一疗法对于控制RA活动性效果不逊于MTX单一法^{[32, 33]}。SX是一种传统苗医验方复方药, 符合中药“君、臣、佐、使”的原则，本研究表明, SX能明显改善CIA大鼠AI指数评分胀，缓解免疫器官的过度反应，减少各炎性介质的产生，证实了SX抗炎、消肿、抗风湿的功效。

MMPs属于锌依赖性和钙依赖性内肽家族，通常由滑膜成纤维细胞释放^{[34, 35]}。有研究表明^[36]在静息FLS中，只观察到低水平的组成型MMP表达。MMPs酶可以降解细胞外基质的所有成分。胶原酶MMP-1因其在胶原降解过程中具有限速作用，在RA中起主要作用。其他MMPs如MMP-2、MMP-9的表达在关节炎中也升高，并降解关节的非胶原基质成分。此外有研究表明，MMP-9在关节滑膜血管新生的过程中具有重要作用，MMPs可通过分解内皮细胞的细胞外基质，刺激血管内皮细胞游走、转移，促进血管新生，参与血管翳形成^[37]。Chen等^[38]提出阻断MMPs可能是开发RA新疗程的潜在策略。有研究通过抑制JNK/P38/AP-1途径，下调MMPs的表达，使CIA小鼠具有较低程度的组织病理学评分、炎症、滑膜增生、关节软骨和骨破坏，软骨和滑膜组织中MMP-1、MMP-3和MMP-13的表达水平也显著降低^[39]。在本实验研究中，通过观察镜下组织HE病理切片，检测MMP1、MMP2、MMP9 mRNA和蛋白表达，表明MMPs在正常结缔组织中，生理性表达较低，但在RA病理条件下显著增加，并可引起滑膜血管增生、软骨及骨损害等病理变化。而SX可降低MMPs水平，减轻大鼠足趾炎症，抑制新生血管形成，改善滑膜关节衰竭。

RA的特征是免疫和非免疫细胞从外周循环迁移到滑膜和滑膜关节液中，导致促炎细胞因子水平升高，最显著的是TNF-α、IL-1β、IL-6等。这些细胞因子激活的信号转导通路似乎调节了MMP基因的表达^[34]。本实验测得Mod组血清TNF-α、IL-1β含量升高，与之MMPs表达上升，而SX能下调其含量使MMPs表达下降。研究表明，细胞因子TNF-α、IL-1β可通过启动子与转录因子结合经由核因子-κB（NF-κB）等信号转导途径激活MMP基因^[40]。NF-kB是细胞因子诱导的转录因子，在控制关节炎中MMP的表达中起关键作用。NF-kB是p50和p65亚基（61-63）的二聚体，当与NF-kB抑制剂（IkB）结合时，在细胞质中无活性。当TNF-α结合到TNF-fr/IL-β结合到IL-R。IKK向IKBα添加磷酸盐。IkB被磷酸化，并在蛋白体中被靶向破坏。p50和p65亚基从IkB分离并转运到细胞核，在那里它们与靶向基因启动子的位点结合（共识序列=GGGACTTTCC）并激活转录。MMP-1、MMP-3和MMP-9的启动子含有NF-kB的典型结合位点，NF-kB的激活是这些基因转录诱导的必要条件^[41]。NF-kB在关节炎中的重要性已被动物模型证明，缺乏p50亚基的小鼠对胶原诱导的关节炎具有难治性。Wang等^[6]证明激活NF-κB通路促进RA患者MMP-9水平升高，从而加速骨侵蚀过程，增加RA患者的疾病严重程度。而运用NF-κB抑制剂BAY 11-7082可显著降低MMP-9水平。本研究RT-PCR和Western blot实验结果显示给予SX治疗后，大鼠滑膜组织中TNF-α、IL-1β含量明显降低，对下游靶基因NF-κB的激活效应减弱，使NF-κB表达量降低，进而抑制MMP1、MMP2、MMP9表达，减轻了炎症反应，减缓滑膜血管增生，减少软骨和骨破坏。

综上所述，本研究提示，SX可以改善CIA软骨和骨的破坏及滑膜血管增生，其机制可能与抑制TNF-α/IL-1β/NF-κB/MMP信号通路，下调NK-κB、TNF-α、IL-1β、MMP1、MMP2、MMP9表达有关。提示SX可作为治疗RA的合适候选药物，以预防RA滑膜关节衰竭等不良后果。

本研究针对下游分子的选择及信号通路的探索进行了创新，而实验方法的选择仍延续了前人经验，出现了一定滞后性。中医外治疗法治疗RA，具有“简、便、验、廉”的特色优势，毒副作用较小^[42]，是课题组过去未涉足过的领域，我们将在后续研究中继续基于网络药理学模拟预测的数据，探究其外用下的作用机制，并比较其与口服、以及口服联合外用的效果差异，为丰富SX的研究提供理论基础和科学依据。

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李云飞，E-mail: 18785065316@163.com

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国家自然科学基金（82060776）；2021年省级大学生创新创业计划训练项目[S202110660045]

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