Abstract
目的
研究舌黏膜癌变过程中基因组甲基化特征，探讨舌癌中DNA甲基化的规律。
方法
用50 mg/L的4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）饮水诱导C57BL/6J小鼠舌黏膜癌变，分别取第0、12、28周的舌黏膜（分别代表正常、癌前病变和癌变）进行基因芯片检测和甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-Seq），在人舌黏膜组织和人舌癌细胞系中，用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和飞行质谱检测验证转化生长因子贝塔信号蛋白1（SMAD1）的表达和启动子的甲基化。
结果
28周较12周和0周舌黏膜的胞嘧啶鸟嘌呤岛（CGI）甲基化水平均升高，12周时启动子甲基化水平高于0周。在0、12和28周期间，208个差异表达基因与启动子中的差异甲基化呈负相关。与正常黏膜相比，细胞系中SMAD1的mRNA上调，同时启动子甲基化水平降低。
结论
舌黏膜癌变中伴随DNA甲基化修饰异常，舌癌中SMAD1高表达伴启动子低甲基化。
Keywords: 舌癌, 发病机制, 甲基化, 动物模型, 甲基化DNA免疫沉淀测序, 差异表达基因
Abstract
Objective
This study aims to assess the role of DNA methylation changes in tongue cancer through a comprehensive analysis of global DNA methylation alterations during experimental lingual carcinogenesis.
Methods
C57BL/6J mice were subjected to 16-week oral administration of 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO, 50 mg/L). Lingual mucosa samples, being representative of normal tissue (week 0) and early (week 12) and advanced (week 28) tumorigenesis, were harvested for microarray and methylated DNA immunoprecipitation sequencing (MeDIP-Seq). The mRNA and promoter methylation of transforming growth factor-beta-signaling protein 1 (SMAD1) were evaluated with real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction and Massarray in human lingual mucosa and tongue cancer cell lines.
Results
The cytosine guanine island (CGI) methylation level observed at 28 weeks surpassed that of both 12 weeks and 0 weeks. The promoter methylation level at 12 weeks exceeded that at 0 weeks. Notably, 208 differentially expressed genes were negatively correlated to differential methylation in promoters among 0, 12, and 28 weeks. The mRNA of SMAD1 was upregulated, concurrent with a decrease in promoter methylation levels in cell lines compared to normal mucosa.
Conclusion
DNA methylation changed during lingual carcinogenesis. Overexpression of SMAD1 was correlated to promoter hypomethylation in tongue cancer cell lines.
Keywords: tongue cancer, pathogenesis, methylation, animal model, methylated DNA immunoprecipitation sequencing, differentially expressed genes
2019年全世界超过37万例口腔和唇癌新病例被确诊，病例数在恶性肿瘤中排第13位[1]，舌部是口腔癌高发部位[2]。因解剖屏障薄弱、丰富的淋巴引流和对侧扩散等因素，舌癌的局部控制较其他口腔癌困难。为提高舌癌疗效，必须寻找可靠的治疗靶点。
本研究用4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquinoline 1-oxide，4NQO）诱导C57BL/6小鼠舌黏膜发生癌变，实验的12周和28周可作为研究舌黏膜癌变的早期和中晚期的时间点[3]。哺乳动物DNA中胞嘧啶鸟嘌呤（cytosine guanine，CpG）二核酸的胞嘧啶环C5共价连接甲基基团形成5-甲基胞嘧啶，该甲基化修饰在基因组中广泛存在，抑制基因表达。基因启动子区DNA甲基化会抑制相关基因的表达，在肿瘤发生过程中，甲基化的异常与抑癌基因和癌基因的表达异常相关[4]。Towle等[5]用患者正常黏膜、异常增生和肿瘤标本研究口腔癌中不同阶段病变的DNA甲基化变化，发现口腔癌中多个基因存在甲基化异常，这些基因在无翼型小鼠乳腺癌病毒整合位点家族成员（wingless-type MMTV integration site family member，WNT）和微管相关蛋白激酶激活蛋白激酶（microtubule-associated protein kinase-activated protein kinase，MAPK）信号通路中富集。Lai等[6]应用4NQO及槟榔碱诱导小鼠发生舌癌，用非商业化的鼠胞嘧啶鸟嘌呤岛（cytosine guanine island，CGI）芯片检测后，发现了34个高甲基化的基因。转化生长因子贝塔信号蛋白1（transforming growth factor-beta-signaling protein 1，SMAD1）是转录调节因子，参与转化生长因子-β信号通路、肿瘤异常转录、Hippo信号通路，在发育、分化和组织稳态中发挥重要作用[7]。
本实验对舌黏膜癌变过程中的不同组织，采用检测通量更高的甲基化DNA免疫沉淀测序（methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP-Seq）技术来检测DNA甲基化的变化，以探讨DNA甲基化在舌癌发病机制中的作用。前期研究[8]发现，SMAD1是舌癌发病的核心基因之一，SMAD1表达在癌变黏膜较正常黏膜中升高，且其启动子区甲基化水平降低。为验证上述结果，本研究在临床正常舌黏膜和舌癌细胞系中检测了SMAD1的mRNA表达和启动子区甲基化。
1. 材料和方法
1.1. 实验动物
25只雌性C57BL/6小鼠，无特定病原体动物（specific pathogen free，SPF）级，体质量为18~20 g，鼠龄30~50 d，购自广东省医学实验动物中心。
1.2. 舌黏膜组织及细胞系
人正常舌黏膜组织3例，其中2例来自舌炎性溃疡活检取材组织，1例来自外伤后外离体舌黏膜，男女比2∶1，取自云南大学附属医院口腔颌面外科和昆明医科大学第一附属医院整形外科。舌癌细胞系CAL27、UCSF-OT-1109、SCC-9购自美国典型培养物保藏中心。
1.3. 实验试剂及设备
4NQO（Sigma公司，美国），用1,2丙二醇配置成500 mg/L，避光保存于4 °C冰箱备用。1,2丙二醇分析纯（汕头市西陇化工股份有限公司），光学显微镜（Nikon公司，日本），TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国），小鼠全基因组芯片、GeneSpring GX软件包（Agilent公司，美国），凯杰DNA提取试剂盒、绿色荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）混合液（Qiagen公司，德国），基因组DNA样本试剂盒、HiSeq 2000测序仪（Illumina公司，美国），Bioruptor超声波粉碎仪、抗5-甲基胞嘧啶抗体（Diagenode公司，美国），NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific公司，美国），GeneAmp® PCR仪（Applied Biosystems公司，美国），LightCycler®480Ⅱ实时荧光定量PCR仪、384孔光学板（Roche公司，瑞士），低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），核酸自动提取仪（北京百泰克生物技术有限公司），ABI veriti-384型实时定量PCR仪（ABI公司，美国），384-well SpectroCHIP® bioarray芯片、MassARRAY Nanodispenser RS 1000型点样机、MassARRAY Analyzer 4.0质谱仪、EpiTYPER™试剂盒、MassARRAY EpiTYPER™软件（Agena公司，美国），NaHSO3（Zymo公司，美国）。
1.4. 小鼠舌癌诱导
将25只C57BL/6小鼠分为3组：蒸馏水对照组（n=5），1,2丙二醇对照组（n=5），实验组（n=15），实验组用蒸馏水稀释1,2丙二醇配置的4NQO至终浓度50 mg/L作为饮用水，供自由饮用至16周，16周后换为蒸馏水继续喂养，参考文献[3]建立小鼠舌癌模型，在饲养0、12、28周分别处死实验组动物各5只。对照组均于28周处死所有小鼠，苏木精-伊红染色后镜下观察所有小鼠舌黏膜细胞形态，观察舌癌诱导结果。
1.5. 小鼠舌癌黏膜的基因芯片检测和MeDIP-Seq
实验组0、12、28周处死小鼠各3只，取舌黏膜样品共9份，TRIzol试剂提取总RNA，1 µg总RNA扩增标记后与小鼠全基因组芯片杂交。结果经软件处理，在9个样本的至少6个样本中被检测到的基因进行下一步分析，差异表达基因定义为基因表达在两组间差异为2倍（log2≥2.0）并且P≤0.05。将基因芯片检测结果上传基因表达综合（gene expression omnibus，GEO）数据库（GSE101469）进行聚类分析。
同时在0、12、28周时取这3只小鼠的舌黏膜样品共9份，检测舌黏膜CGI、基因启动子区和基因体DNA的甲基化情况。按以下步骤进行：Qiagen Dneasy试剂盒提取纯化基因组DNA，超声破碎仪将DNA分解为200~900 bp片段。根据Genomic DNA Sample试剂盒操作，将DNA片段接上接头。连接接头的DNA片段与抗-5甲基胞嘧啶的抗体进行免疫沉淀，测序。甲基化评估用甲基化DNA免疫沉淀评分（methylated DNA immunoprecipitation score，MeDIP-score）的均数±标准差表示，定义为每千个碱基对扩展读数的值，MeDIP-score小于4.19定义为未甲基化，介于4.19~41.01定义为部分甲基化，大于41.01为甲基化，不同区域的评分倍数变化≥1.5并且P≤0.05认为甲基化修饰存在差异。将以上MeDIP-Seq结果上传GEO数据库（GSE102488）进行聚类分析。启动子区根据CpG密度分为高、中、低CpG密度启动子。高CpG密度启动子是指在−700~200 bp的DNA区间包含500 bp的片段，此片段（G+C）占比≥0.55，CpG的观察/预期比率≥0.6；低CpG密度启动子是指在−700~200 bp的DNA区间没有500 bp的片段，其CpG的观察/预期比率≥0.4。中CpG密度启动子是指不能被归入上述两类的启动子。
1.6. 人正常舌黏膜和舌癌细胞系中SMAD1 mRNA表达和启动子区甲基化飞行质谱检测
在人正常舌黏膜和舌癌细胞系CAL27、UCSF-OT-1109和SCC-9中检测SMAD1 mRNA的表达。操作步骤如下：TRIzol试剂提取总RNA，定量采用两步法（逆转录和聚合酶链反应）。逆转录体系包括0.5 µg RNA，2 µL的基因组DNA去除混合液，加无核酸酶的蒸馏水至8 µL，在GeneAmp® PCR仪中42 °C反应2 min；第二步加入2 µL的5×HiScript®ⅡQ RT SuperMixⅡa依照下述条件继续进行：25 °C 10 min、50 °C 30 min、85 °C 5 min。产物用无核酸酶的蒸馏水稀释10倍−20 °C保存。实时PCR在LightCycler®480Ⅱ实时荧光定量PCR仪中进行，反应体系包括：1 µL的互补DNA（complementary DNA，cDNA），5 µL的绿色荧光定量PCR混合液，正、反向引物各0.2 µL，3.6 µL无核酸酶的蒸馏水；反应条件：95 °C 5 min，随后40个循环95 °C 10 s，60 °C 30 s。每1个样本重复3次。每次反应后，分析溶解曲线确定目的PCR产物的产生。SMAD1引物：正向CAACCAAGAGTTTGCTCAGCTA，反向TTCACGAAGCTCATCCGAAT。mRNA表达量与内参三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）标准化，用2−ΔΔCt法计算。将正常黏膜SMAD1表达设定为1，舌癌细胞表达量大于1为高表达，反之则低表达。
飞行质谱检测人正常舌黏膜和舌癌细胞系CAL27、UCSF-OT-1109和SCC-9中SMAD1启动子区甲基化，操作步骤如下。根据SMAD1序列用EpiDesigner软件进行引物设计：正向AGGTTTTGGAATTTGATTGGTAGTT，反向CCCCTAAAACTAATCCCTATCCC。Qiagen Dneasy试剂盒提取纯化基因组DNA，NaHSO3处理待检测DNA样品，低速短暂离心备用。PCR反应体系：ddH2O 4.90 µL，10×PCR缓冲液0.80 µL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）0.80 µL，PCR酶0.10 µL，正向引物反向引物各0.20 µL，DNA模板1.00 µL。按以下条件：94 °C 4 min，之后45个循环94 °C 20 s，56 °C 30 s，72 °C 1 min。随后72 °C 3 min，4 °C储存。虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）反应体系如下：无核酸酶的蒸馏水1.70 µL，SAP 酶0.30 µL，PCR产物5.00 µL。384孔反应板的每个孔中加入7 µL SAP反应液，SAP反应程序如下：37 °C 20 min，85 °C 5 min，4 °C储存。T切/核酸酶A消化反应体系如下：无核酸酶的蒸馏水3.21 µL，5倍T7聚合酶缓冲液0.89 µL，T Cleavage Mix 0.22 µL，二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）0.22 µL，T7 RNA & DNA聚合酶0.40 µL，核酸酶A 0.06 µL，PCR/SAP混合物2.00 µL。37 °C孵育3 h。在384孔6 mg浅板里均匀填充树脂并放置10 min使其晾干，向384孔板的每个孔中加16 µL水，将384孔板轻扣在Dimple板上，翻转后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中，将384孔板用封口膜密封后置于翻板离心机中室温旋转混匀30 min。飞行质谱Nanodispenser RS 1000型点样仪将纯化后的产物移至384孔SpectroCHIP芯片上，将点样后的芯片使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight，MALDI-TOF）质谱仪分析，检测结果使用EpiTYPER™软件获取原始数据和圆点图。
1.7. 统计学分析
采用SPSS 25.0软件进行统计分析，数据进行u检验。
2. 结果
2.1. 4NQO诱导结果
用4NQO诱导了小鼠12、28周时，舌黏膜出现了不典型增生和鳞癌变化（图1）。正常黏膜为复层角化上皮，表面为角化层，细胞排列规则，基底膜连续。12周时上皮层次紊乱，细胞核浓染，细胞多行性。28周时可见鳞状上皮增生，侵入肌肉组织，癌细胞呈团块或条索状排列。
图 1. 4NQO诱导C57BL/6小鼠舌黏膜癌变 苏木精-伊红染色 × 200.
Fig 1 Lingual carcinogenesis in C57BL/6 mice by 4NQO hematoxylin and eosin staining × 200
A：0周；B：12周；C：28周。
2.2. 小鼠舌癌黏膜基因芯片检测和MeDIP-Seq结果
聚类分析结果表明，饲养0、12、28周小鼠舌黏膜组织甲基化展现出不同的类型，三者间展示了不同的甲基化的方式（图2）。MeDIP-Seq共检测到16 023个CGI，基因内岛1 474个，启动子岛11 220个，基因间岛3 315个（图3）。饲养0、12、28周时，小鼠舌黏膜CGI的MeDIP-score的均值±标准差分别为11.57±38.18、11.76±35.38、12.67±45.60。28周较0、12周时CGI的MeDIP-score升高，差异有统计学意义（28周对比0周，µ=2.34，P<0.02；28周对比12周，µ=1.995 6，P<0.05）。12周较0周CGI的MeDIP-score的差别无统计学意义（µ=0.462 3，P>0.50）（图4）。
图 2. 饲养0、12、28周9个舌黏膜样本中16 023个CGI甲基化聚类分析结果.
Fig 2 Methylation patterns of nine samples fed at the 0, 12, and 28 weeks that were analyzed using hierarchical clustering of results from 16 023 CGI
饲养0、12、28周小鼠舌黏膜各3个标本的CGI甲基化进行两两比较，标本名称显示在图上方；红色为高甲基化，绿色为低甲基化。
图 3. 舌癌黏膜癌变CGI甲基化构成.
Fig 3 Numbers of methylated, partially methylated and unmethylated CGI
图 4. 饲养0、12和28周小鼠舌黏膜DNA CGI的MeDIP-score.
Fig 4 MeDIP-score of CGIs among mucosal DNA of mice fed at the 0, 12 and 28 weeks
本研究检测到了小鼠26 601个启动子的甲基化（图5），其中高、低和中CpG密度启动子分别为9 581、6 005和11 015个。饲养0、12、28周时，小鼠舌黏膜DNA启动子MeDIP-score的均值±标准差分别为5.32±16.98、5.65±15.65、5.37±17.52，12周较0周启动子的MeDIP-score升高，差异有统计学意义（µ=2.3451，P<0.02）（图6）。
图 5. 舌黏膜癌变启动子区甲基化构成.
Fig 5 Numbers of methylated, partially methylated and unmethylated promoters
图 6. 饲养0、12和28周小鼠舌黏膜样本启动子区的MeDIP-score.
Fig 6 MeDIP-score of promoters among samples of mice fed at the 0, 12 and 28 weeks
本研究检测到小鼠舌黏膜21 625个基因体甲基化，高、低和中CpG密度基因体分别为8 852、5 278和7 495。饲养0、12、28周时小鼠舌黏膜DNA基因体的MeDIP-score分别为5.58±14.80、5.79±13.35、5.83±17.25，三者间差异无统计学意义。
12周比0周74个基因上调，其启动子区甲基化降低；17个基因下调，其启动子区甲基化升高。28周比0周66个基因上调，其启动子区甲基化降低；3个基因下调，其启动子区甲基化升高。28周比12周43个基因上调，其启动子区甲基化降低；5个基因下调，其启动子区甲基化升高（表1）。
表 1. 饲养0、12和28周小鼠舌黏膜存在208个启动子区差异甲基化的差异表达基因.
Tab 1 208 differentially expressed genes were negatively correlated to differential methylation in promoters among lingual mucosae of mice fed at the 0, 12 and 28 weeks
| 序号 | 12周对比0周 |
28周对比0周 |
28周对比12周 |
|||
| 上调基因 | 下调基因 | 上调基因 | 下调基因 | 上调基因 | 下调基因 | |
| 1 | Cul4a（−3.4/0.049） | Ghrl（1.6/0.049） | Oip5（−5.8/0.049） | Trim34a（3/0.04） | Rbbp4（−4.8/0.047） | Trim34a（2.8/0.03） |
| 2 | Ppie（−8.4/0.048） | Rhox8（2.3/0.044） | Rcn2（−11.2/0.048） | Ddx26b（2.8/0.009） | Pla2g7（−3.9/0.047） | Dmbt1（19.9/0.03） |
| 3 | Olfr533（−3.1/0.048） | Kcnd3（4.5/0.03） | Gpc4（−4.2/0.048） | Tmem143（49.8/0.001） | Cwh43（−47.8/0.046） | F5（2.8/0.03） |
| 4 | Baz1a（−10.9/0.047） | Lig1（1.5/0.04） | Sgk2（−25/0.047） | Olfr312（−14/0.044） | Nipal3（5.9/0.027） | |
| 5 | Cyhr1（−100/0.045） | Mapt（29/0.04） | Tbp（−5.2/0.046） | Sprr2j-ps（−4.8/0.04） | Akap6（2.1/0.018） | |
| 6 | Rnf181（−4.3/0.044） | Gal3st2（4.4/0.04） | Elovl1（−33.7/0.018） | Mcm8（−12.8/0.04） | ||
| 7 | Hist1h2aa（−5.2/0.044） | Tbc1d12（4/0.03） | Tiparp（−10.2/0.044） | Ifitm1（−21.7/0.04） | ||
| 8 | Gcc1（−2.0/0.043） | Rabgap1（9/0.03） | Cenpm（−100/0.043） | Hist1h3g（−100/0.04） | ||
| 9 | Lrba（−2.7/0.041） | Vmn2r88（20.8/0.027） | Ube2c（−4.9/0.043） | Gpatch4（−13/0.034） | ||
| 10 | Heph（−4.1/0.039） | Mirg（4/0.027） | Rpa3（−12.1/0.043） | Tmprss11g（−8.2/0.034） | ||
| 11 | Gm7120（−1.7/0.038） | Fndc5（1.9/0.025） | Psmc6（−100/0.043） | Fam213a（−100/0.034） | ||
| 12 | Ikbkg（−17.5/0.013） | Gm10487（3.1/0.02） | Ranbp6（−100/0.042） | Spp1（−6.4/0.034） | ||
| 13 | Dsc3（−1.8/0.032） | 1700047M11Rik（6.6/0.018） | Hip1r（−100/0.042） | Cxcl13（−38.9/0.033） | ||
| 14 | 2810403A07Rik（−5.9/0.032） | Fgf17（2.6/0.015） | Golga7（−100/0.02） | Alg10b（−53.4/0.033） | ||
| 15 | Taf1b（−11.8/0.031） | Lsm6（3.7/0.01） | Hist1h3g（−100/0.038） | Ska1（−2.5/0.02） | ||
| 16 | Cdc40（−41/0.03） | Ciita（6.4/0.009） | Ifitm1（−27/0.006） | Snord116（−2.9/0.02） | ||
| 17 | Zfand1（−100/0.029） | Cdh2（8.9/0.001） | Gnal（−100/0.032） | Npm1（−53/0.019） | ||
| 18 | Pknox1（−10/0.026） | Acot10（−49.5/0.035） | Mrpl47（−12/0.019） | |||
| 19 | Phkb（−10.6/0.026） | Vprbp（−41.7/0.035） | Nhlrc3（−17.6/0.019） | |||
| 20 | Slc26a6（−100/0.025） | Tuba1c（−51.8/0.034） | Lpin2（−7.3/0.016） | |||
| 21 | Gria3（−2.1/0.022） | Ap1ar（−16.5/0.033） | Sult1b1（−54.5/0.015） | |||
| 22 | Ufd1l（−4.6/0.022） | Gm21944（−14/0.033） | Ip6k3（−100/0.014） | |||
| 23 | Wipf1（−7.7/0.021） | Cdk7（−100/0.032） | Gmnn（−3.3/0.014） | |||
| 24 | Trim2（−4.6/0.017） | Ttc9（−11.6/0.032） | Rnu12（−16/0.011） | |||
| 25 | Atad3a（−41.9/0.011） | Atxn3（−100/0.027） | Fcf1（−7.2/0.01） | |||
| 26 | Mkl2（−10.2/0.01） | Prkrir（−100/0.026） | Bok（−100/0.01） | |||
| 27 | Zfp808（−4.2/0.009） | Il19（−8.6/0.026） | Tekt1（−14.3/0.009） | |||
| 28 | Gpr39（−17.2/0.008） | Ube2j1（−100/0.025） | 4932412D23Rik（−100/0.008） | |||
| 29 | Zfp759（−4.3/0.006） | Sdcbp2（−100/0.024） | Gal3st2（−100/0.007） | |||
| 30 | Tgm7（−5.3/0.006） | Pdpk1（−4.4/0.024） | Gm14326（−6.3/0.007） | |||
| 31 | Ptprb（−3.7/0.004） | Mcm8（−12.3/0.024） | Stfa1（−15/0.007） | |||
| 32 | Pibf1（−7.2/0.002） | Myo1b（−35.3/0.022） | Gm5878（−8.7/0.005） | |||
| 33 | Wdr54（−4.1/0.002） | Cyhr1（−6.6/0.021） | Gm3285（−100/0.005） | |||
| 34 | Tubgcp5（−52.8/0.002） | Glrx（−25/0.021） | Cd80（−20/0.004） | |||
| 35 | Farsa（−12.6/0.05） | 2810403A07Rik（−13.6/0.021） | Fzd3（−9.7/0.003） | |||
| 36 | Golga5（−5.1/0.05） | Vstm5（−100/0.021） | Wdr91（−25.6/0.003） | |||
| 37 | Gsdmc（−2.8/0.05） | Kif2c（−31/0.02） | Ifi202b（−34/0.002） | |||
| 38 | Rbl1（−32.7/0.04） | Dsg3（−34/0.019） | Fam81a（−7.5/0.002） | |||
| 39 | Map3k3（−100/0.04） | Eogt（−100/0.019） | A630089N07Rik（−100/0.001） | |||
| 40 | Gm14920（−2.8/0.04） | Tmem242（−100/0.018） | Mmp3（−10.6/0.001） | |||
| 41 | Tyk2（−16.3/0.04） | Mapk9（−100/0.017） | Ptar1（−100/0.001） | |||
| 42 | Ror1（−2.5/0.04） | Mars2（−17/0.017） | Mybl2（−16/0.001） | |||
| 43 | Esd（−3/0.04） | Klrc1（−100/0.015） | Atp2b2（−100/0.001） | |||
| 44 | Ccpg1（−4.2/0.04） | Snx24（−100/0.015） | ||||
| 45 | 2510003E04Rik（−8.5/0.03） | Sowahc（−13.3/0.013） | ||||
| 46 | Tspan32（−2.5/0.03） | Gcc1（−5.9/0.012） | ||||
| 47 | Pawr（−6.8/0.03） | Ikzf5（−3.9/0.011） | ||||
| 48 | Atp8b1（−8.8/0.03） | Slc26a3（−10.9/0.011） | ||||
| 49 | Tiam1（−1.9/0.03） | Vps35（−100/0.01） | ||||
| 50 | Igtp（−4/0.028） | Sp8（−22.9/0.01） | ||||
| 51 | Suv39h2（−8.9/0.027） | Strbp（−5.7/0.009） | ||||
| 52 | Pabpc4（−1.8/0.026） | Steap4（−100/0.009） | ||||
| 53 | Elovl1（−2/0.024） | Smad1（−5.4/0.009） | ||||
| 54 | Mageh1（−4.9/0.021） | Thbs1（−5/0.008） | ||||
| 55 | Ywhag（−9/0.021） | Lrba（−7.2/0.007） | ||||
| 56 | Nhsl1（−4.9/0.02） | Slc2a1（−47.9/0.006） | ||||
| 57 | Gfod1（−11.9/0.018） | Trmt61b（−100/0.006） | ||||
| 58 | Ppp1r13l（−15.1/0.016） | Camk2a（−7.9/0.005） | ||||
| 59 | Ube2d3（−4.9/0.014） | Tubgcp5（−6.2/0.005） | ||||
| 60 | Tomm40（−100/0.014） | Crhr1（−13.5/0.002） | ||||
| 61 | Net1（−21.3/0.014） | Olfr920（−100/0.002） | ||||
| 62 | Ispd（−5.9/0.013） | Rassf3（−6.3/0.001） | ||||
| 63 | Fuca2（−4.1/0.013） | Scoc（−100/0.001） | ||||
| 64 | Idi2（−2.4/0.012） | Trim2（−54/0.001） | ||||
| 65 | Nid1（−12.4/0.011） | Smad4（−100/0.001） | ||||
| 66 | Tnpo1（−4.7/0.008） | Tnfaip6（−100/0） | ||||
| 67 | Ap3s1（−5.8/0.006） | |||||
| 68 | Fcrl5（−4.1/0.006） | |||||
| 69 | Cav1（−37.9/0.006） | |||||
| 70 | Eif4a2（−7.6/0.004） | |||||
| 71 | Thpo（−40.8/0.002） | |||||
| 72 | Ddx60（−100/0.002） | |||||
| 73 | Serpinb12（−46/0.002） | |||||
| 74 | F3（−3/0.001） | |||||
注：括号里的数值为甲基化变化倍数/P值，差异倍数为负数表示甲基化降低，正数为甲基化升高。
2.3. 人正常舌黏膜和舌癌细胞系中SMAD1 mRNA表达和启动子区甲基化飞行质谱检测结果
与正常舌黏膜（SMAD1的mRNA表达量为1）相比，舌癌细胞系中SMAD1的mRNA表达为2.69（图7）。正常黏膜和舌癌细胞启动子区甲基化飞行质谱检测结果显示，其甲基化程度分别为0.082 1±0.089 4和0.055 5±0.080 0（图8），二者间差异存在统计学意义（µ=2.66，P<0.01）（图9）。
图 7. 人舌黏膜、舌癌细胞SMAD1 mRNA表达.
Fig 7 Expression of SMAD1 mRNA in human normal mucosa and tongue cancer lines
图 8. 人舌黏膜、舌癌细胞SMAD1启动子区甲基化飞行质谱检测结果.
Fig 8 MassARRAY results of SMAD1 promoter methylation of human normal mucosa and tongue cancer lines
C11、C12、D09分别为舌癌细胞系CAL27、UCSF-OT-1109、SCC-9；D10、D11、D12为人正常舌黏膜。甲基化圆点图标尺颜色越浅代表甲基化程度越低。基因的序列标尺上方是碱基位置，下方是CpG的标识及大致位置。
图 9. 舌癌细胞SMAD1启动子区甲基化较正常黏膜降低.
Fig 9 Methylation of SMAD1 promoter in tongue cancer cell lines was lower than that in human normal mucosa
检测数据为相对定量比值。
3. 讨论
DNA甲基化是最常见的表观修饰，主要存在以下的功能：防止异常转录起始；抑制转录的延伸；调节可变剪切；增强子甲基化[9]。本实验通过4NQO诱导小鼠舌黏膜癌变，研究正常、癌前、癌变3个阶段CGI、启动子和基因体甲基化和相关基因表达变化。聚类分析结果显示正常、癌前、癌变舌黏膜DNA甲基化修饰的方式不同，结果与其他学者[5]研究相似，说明DNA甲基化修饰可能是癌变机制的组成部分，从一定程度上反映了癌变的进程。癌前病变与正常黏膜甲基化聚类差异展现了甲基化修饰变化出现在黏膜癌变的早期阶段，与Foy等[10]的结果相似。本研究发现，舌癌CGI的甲基化较正常组织和癌前病变升高，这说明在舌黏膜癌变的过程中，DNA甲基化的修饰不仅存在类别的差异，还存在程度的变化。DNA甲基化修饰变化也出现在其他疾病和病理生理过程中。
在哺乳动物发育中，DNA甲基化会经历2次较大波动，第一次是在生殖细胞期，从原始生殖细胞的去甲基化到出现具有性别特征的甲基化生殖细胞；第二次是在受精后，甲基化消失到出现具有胚胎特征的甲基化修饰[11]。健康人群基因组甲基化总体上随年龄降低，这种降低存在个体差异[12]。因此DNA甲基化在生命进程中又被称为甲基化迁移或甲基化钟[13]。在肠癌、乳腺癌、胶质瘤、子宫内膜癌、胃癌及肾癌[14]–[15]等肿瘤中，特定CGI甲基化被认为是肿瘤表观遗传标志，与肿瘤侵袭及预后有关。与舌癌中CGI甲基化升高不同，Rechache等[16]发现，肾上腺皮质恶性肿瘤中甲基化较良性肿瘤及正常组织降低，这反映了肾上腺皮质恶性肿瘤与舌癌间CGI甲基化修饰的差异。CGI甲基化变化在不同肿瘤中的差异，说明不同肿瘤中CGI甲基化可能存在特异性，CGI甲基化修饰变化与舌癌发病机制间的内在关系还需进一步研究。
本研究发现，癌前病变启动子区甲基化较正常组织升高，癌前病变的部分甲基化启动子的数量较正常组织增加，说明在癌前病变阶段存在基因表达的抑制。肿瘤的发生是抑癌基因的表达抑制和癌基因的表达上调共同变化，进而复杂演进的结果，癌前病变舌黏膜启动子区甲基化的升高，提示抑癌基因表达的抑制可能是舌癌早期的重要的基因学变化。有研究表明，肿瘤中启动子区甲基化升高不仅与肿瘤发生有关，还会影响肿瘤的化疗耐药。Chang等[17]发现，在伴EB病毒感染的胃癌中，启动子区甲基化升高，体现了该型肿瘤的特征。Geli等[18]发现，副神经节肿瘤中启动子甲基化升高与恶性表型有关。Fazal等[19]发现，睾丸生殖细胞肿瘤的DNA甲基化与顺铂耐药相关。
相关研究[20]表明，基因体的甲基化和基因表达正相关，但其功能尚待进一步明确。Huang等[21]发现，小肠上皮细胞在癌变早期基因体甲基化升高，而在癌变时表现为低甲基化，表明基因体甲基化对肿瘤进展有重要作用。在高表达B细胞淋巴瘤6蛋白（B-cell lymphoma 6 protein，BCL6）的淋巴瘤中，BCL6第一个内含子CGI甲基化，阻止转录因子CTCF的结合，解除对增强子的抑制，促进BCL6表达导致肿瘤形成[22]。肾癌和肺腺癌中淋巴瘤特异基因CARD11基因体甲基化与其高表达相关，CARD11激活mTOR通路，抑制自噬，促进肿瘤发展[23]。本研究基因体甲基化在正常、癌前病变和舌癌中无明显差别，说明不同肿瘤基因体甲基化存在差异。
本研究在正常（0周）、癌前病变（12周）、舌癌（28周）三组间，获得了183个基因表达上调同时其启动子区甲基化降低，25个基因表达下调同时其启动子区甲基化升高。本研究采用差异基因和启动子区甲基化差异表达的交集筛选目标基因，与其他研究标准不同，因此结果也并非一致[24]–[25]。本研究的筛选方法有助于缩小目标基因的范围，获得更加可靠的目标基因。
综上，舌黏膜癌变基因启动子区甲基化与基因表达相关性研究，为寻找与舌黏膜癌变的发病机制相关基因提供了新的视野。
Funding Statement
[基金项目] 云南省科技厅-昆医联合专项［202001AY070001-253，2018FE001（-216）］
Supported by: Joint Special Project of KUM by Yunnan Provincial Science and Technology Department [202001AY070001-253, 2018FE001(-216)]
Footnotes
利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。
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