益生菌促进伤口愈合的作用机制的研究进展

Abstract

Slow wound healing has been a troublesome problem in clinic. In China, traditional methods such as antibiotics and silver sulfadiazine are used to treat skin wound, but the abuse use has many disadvantages, such as chronic wounds and pathogen resistance. Studies have shown that the microorganisms with symbiotic relationship with organisms have benefits on skin wound. Therefore, the way to develop and utilize probiotics to promote wound healing has become a new research direction. In this paper, we reviewed the studies on the bacteriotherapy in the world, described how the probiotics can play a role in promoting wound healing through local wound and intestine, and introduced some mature probiotics products and clinical trials, aiming to provide foundations for further development of bacteriotherapy and products.

0. 引言

伤口，是指由外界（机械、物理、化学等）致伤因素及机体内部生理异常（如局部血供障碍和免疫功能障碍等）所引起的人体皮肤正常解剖结构以及组织功能的破坏^[1]，其发病率高、护理费用也较高。有研究表明，全球每年用于伤口护理的费用高达130～150亿美元^[2]。伤口愈合，则是指机体组织对损伤刺激所产生的生理反应，正常的伤口愈合是由止血期、炎症期、组织增殖期和组织成熟或重塑期所构成的动态过程，此过程需要各种生长因子和细胞因子的综合调控，各种因素的失衡都会导致伤口愈合缓慢，是临床治疗中的棘手问题。目前，临床上大多采用抗生素等传统药物来治疗皮肤伤口。但已有研究表明，在急性伤口中使用含抗生素的软膏和不含抗生素的软膏相比，伤口愈合的效果并无差异；而在慢性伤口中伤口处微循环的减少，会使口服或静脉注射的抗生素无法在感染部位达到有效抗菌浓度，并且当局部使用抗生素时，通常由于抗生素种类和浓度的选择错误，不仅会引起过敏性皮炎的发生，还会导致慢性伤口生物膜中抗生素耐药性菌株的增加以及黏液表型发生变异，从而进一步延迟伤口愈合。随着对微生物组学的深入研究，人们发现微生物与人体的健康关系密切，其中病原微生物及其形成的生物膜，通常会通过延长伤口的炎症期减缓伤口的愈合进程，相反若在创面上引入益生菌，则可通过竞争性排除病原体、释放生物活性物质以及调节伤口处的炎症反应等途径来促使急慢性创面愈合，同时其还具有不同于抗生素的广谱抗菌作用。因此，益生菌疗法有望成为临床促进伤口愈合的重要手段之一。本文主要按照伤口愈合的生理进程来探讨益生菌在各阶段所发挥的促愈合机制，并结合了肠道益生菌如何通过调节全身反应来促进皮肤伤口愈合，以及相关的益生菌产品和临床试验等内容，更系统地展现了益生菌在未来临床应用方面的可行性，旨在为普通伤口的抗生素替代治疗和慢性伤口的对因治疗提供相关依据。

1. 益生菌应用于局部伤口以促进伤口愈合

正常的伤口愈合主要包括止血期、炎症期、组织增殖期、组织成熟或重塑期，共四个阶段。通常在止血期过后，机体会利用炎症反应来清除伤口部位的病原体和异物，然后再通过抑制过度炎症反应来抵抗炎症反应的有害作用，最后依靠组织增殖及成熟来完成伤口的愈合。现已表明，益生菌能在其中的多个阶段中发挥重要的促愈合作用。

1.1. 预防和清除生物膜

生物膜，是指由多种细菌、真菌、病毒以及原生动物所构成的复杂的、动态的微生物群落^[3]。Attinger等^[4]研究表明，高达90%的慢性伤口含有生物膜，其可通过影响机体正常的细胞功能、炎症细胞反应、皮肤先天免疫反应以及伤口愈合的修复阶段，进而延缓伤口的愈合进程^[5]。慢性伤口上一旦形成生物膜，几乎很难被有效清理，因此如何有效预防和清除生物膜，已经成为治疗慢性伤口的首要问题。

在糖尿病和烧伤等慢性伤口的早期，通常由于微循环异常，会导致伤口处有益于炎症反应的营养物质不能及时运输，早期病原微生物无法被及时清除，最终形成生物膜。对此，益生菌可通过直接或间接抑制病原体生长的方式来预防生物膜的形成。

直接抑制病原体的作用机制有：① 直接产生抗菌物质来抑制病原体的增殖。如，乳酸菌和双歧杆菌等益生菌菌株，主要是通过产生有机酸来对革兰氏阴性细菌起到抗菌作用^[6]；痤疮角膜杆菌可通过将油转化为脂肪酸，使皮肤表面酸化来保护皮肤免受病原微生物的侵害^[7]；路邓葡萄球菌则是通过产生路邓素（一种新型含噻唑烷的环肽类抗生素），阻止金黄色葡萄球菌的定植^[8]。② 与病原体形成共聚集复合物，阻止病原体黏附于上皮细胞。如，长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和德氏乳杆菌等多种益生菌均具有与常见的伤口病原体（金黄色葡萄球菌和白色念珠菌等）共聚集的能力^[9-10]。③ 部分益生菌对上皮细胞受体具有高亲和力，可将病原体从上皮细胞或黏膜表面置换移除。如，副干酪乳杆菌所产生的细胞外多糖可以使其竞争性地黏附在上皮细胞表面，从而取代已经定植的致病菌^[11]。

益生菌的间接抑制作用主要是指，其可通过刺激机体产生各种免疫防御性物质，来阻止病原体的入侵或清除已经存在的病原微生物，从而达到预防生物膜形成的作用。主要作用机制包括：① 通过激活T细胞诱导伤口组织产生各种细胞因子。如，适量的白色念珠菌可以诱导抗原特异性辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）的活化，清除定植在局部组织中的非共生真菌^[12]。② 通过刺激肥大细胞、上皮细胞和脂肪细胞来调节抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）的产生。如，Claudel等^[13]提到表皮链球菌可以通过先天免疫系统激活Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）信号通路，诱导表皮角质形成细胞和皮肤共生微生物分泌AMP，该反应对于促进致病菌的根除以及促进伤口愈合非常重要。③ 通过增加表达并调节体内外紧密连接蛋白的定位来增强上皮屏障功能，限制病原体的侵袭。如，现已证明鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌，都可以通过增加感染了金黄色葡萄球菌的角质形成细胞中“咬合蛋白（occludin）”、“闭合蛋白（claudin）”和“闭锁小带蛋白1（zonula occludens 1）”三种紧密连接蛋白的表达，从而防止病原体的侵袭^[14]。

此外，益生菌还能通过增强机体对病原体的免疫敏感性来预防生物膜的形成。其主要机制是帮助机体识别潜在致病菌，并对淋巴细胞进行准确定位。一方面皮肤正常菌群可以利用一种称为模式识别受体的机制：即通过分泌含有核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding and oligomerization domain，NOD）的蛋白质，与革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的肽聚糖结合，进一步帮助皮肤共生体识别潜在的病原体并启动先天免疫系统进行消除^[15]；另一方面植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等还能通过表达CXC趋化因子配体12 (C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）来对淋巴细胞产生趋化作用，并通过调节白细胞的运动，帮助它们重新定位到感染区域，从而改善高血糖或外周缺血小鼠伤口的闭合进程^[16]。

另外，在含有生物膜的慢性伤口中，微生物之间通常会利用群体感应系统（quorum sensing，QS），并根据细胞群的密度来调控自身基因的表达，从而起到稳固生物膜、抵抗宿主防御以及产生毒力因子的作用。对此，益生菌能够干扰此途径，达到清除生物膜并减少其毒害作用的目的^[17]。如，Ramos等^[18]研究发现，植物乳杆菌及其上清液可以通过干扰铜绿假单胞菌QS信号分子（酰基高丝氨酸内酯）的产生，来抑制弹性蛋白酶、绿脓菌素和鼠李糖脂等毒力因子的表达，从而阻止了病原微生物的黏附以及生物膜的生长。而，山羊葡萄球菌则能产生山羊葡萄球菌自诱导肽，并可通过抑制金黄色葡萄球菌的QS下调各种毒力因子的表达^[19]。另外，Monnappa等^[20]研究发现，在培养基上添加10%的蛭弧菌上清液后，不仅阻止了至少75%的金黄色葡萄球菌形成生物膜，还能够避免已形成生物膜的扩散。其机制主要是通过蛭弧菌所产生的细胞外蛋白酶（丝氨酸蛋白酶）来清除金黄色葡萄球菌的生物膜，并降低其毒力。

1.2. 控制过度炎症反应

正常伤口的促炎抗感染作用是伤口愈合过程中不可或缺的一步，通常持续几天后会转化到组织增殖阶段。然而，在含有生物膜的慢性伤口和糖尿病溃疡等炎性伤口中，由于其促炎作用一直存在，就会使得伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞M1持续聚集，释放过量的氧气、蛋白酶以及炎症因子参与降解伤口愈合的关键蛋白质，延缓伤口愈合^[21]， 这也是造成慢性伤口难愈合的另一个主要因素。而益生菌除了可以清除病原微生物、生物膜及异物，起到抗感染作用外，同时也被证明可以通过阻止不适当的炎症反应和缩短炎症阶段来促进炎性伤口的愈合。

TLRs，是一种存在于细胞内外的模式识别受体，可以识别病原体或受损细胞中的特异性配体，并通过激活先天免疫系统诱导炎症细胞因子表达^[22]。有研究表明，在糖尿病溃疡的伤口组织中，TLRs通常会过表达，特异性配体的持续刺激会导致TLRs信号通路过度激活，从而引起过度的炎症反应以致伤口愈合缓慢。对此益生菌可通过TLRs信号传导的负调节机制，起到治疗炎性伤口和平衡皮肤免疫反应的作用。如，Lai等^[23]发现葡萄球菌（如表皮链球菌）产生的脂磷壁酸和硫代葡萄糖酸，可以作为角质形成细胞上Toll样受体2（TLRs-2，TLR2）的特异性配体，并可通过诱导负调节因子（肿瘤坏死因子受体相关因子1）的表达，来选择性地抑制Toll样受体3（TLRs-3，TLR3）信号转导机制，进一步抑制伤口处白介素6和肿瘤坏死因子α的产生。此过程在抑制皮肤炎症程度方面发挥着重要的作用。另外，虽然高浓度的金黄色葡萄球菌是有害的，但适量的金黄色葡萄球菌可通过产生少量超抗原，来降低皮肤组织中白介素（如白介素17）的水平，抑制先天免疫应答和先天免疫细胞的活化，进而导致皮肤伤口化脓和炎症减少，促进伤口愈合^[24]。综上，炎症反应的刺激和抑制之间通常存在某种平衡，因此在选用益生菌疗法时，应以减少炎症的有害影响，同时不会增加伤口的感染风险为主，按照病因并依据伤口组织的炎性程度来把握其种类的选择。

1.3. 促进组织增殖和成熟

在炎症期之后，益生菌主要可通过两个方面来促进皮肤伤口组织增殖和成熟，从而促进伤口的愈合。一是，通过益生菌自身来直接发挥其促愈合作用。如，Tsai等^[25]给小鼠伤口表面覆盖含有经热杀灭的植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的凝胶制剂，并检测伤口组织成纤维细胞中胶原蛋白和丝氨酸棕榈酰转移酶小亚基A的表达情况。他们发现，植物乳杆菌和副干酪乳杆菌凝胶制剂在伤口愈合的早期（第5 d），就可通过促进胶原蛋白的合成来起到滋润伤口的作用；此外其还能促进伤口组织再上皮化，并可通过抑制肌成纤维细胞的过量累积，来防止皮肤的过度纤维化。而Linehan等^[26]提到，表皮葡萄球菌可以通过树突状细胞的抗原呈递作用来增加皮肤中细胞毒性T淋巴细胞的表达，并可诱导伤口组织再上皮化以及改善肉芽组织的形成，从而加速皮肤伤口闭合。二是，通过益生菌的代谢产物来间接发挥其促愈合作用。如，人类皮肤微生物群中的各种葡萄球菌均具有编码芳香族氨基酸脱羧酶的基因，其产生的芳香族氨基酸脱羧酶可以将芳香族氨基酸转化为色胺、苯乙胺和酪胺等痕量胺^[27]，可通过干扰宿主细胞特异性痕量胺受体，或作为β肾上腺素能受体的拮抗剂，来阻断β肾上腺素能受体，从而加速了角质形成细胞的迁移并促进伤口愈合^[28]。而Luqman等^[29]则进一步证明，与不能产生痕量胺的菌株相比，表皮葡萄球菌可以通过产生痕量胺来加速小鼠伤口闭合。此外，经体外研究发现，鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌所产生的裂解液，还可通过增加角质形成细胞单层划痕培养基中CXC趋化因子配体2 (C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2）及CXC趋化因子受体2（C-X-C chemokine receptor 2，CXCR2)的表达，来促进划痕处角质形成细胞的增殖和迁移，提高上皮化率，起到促进伤口愈合的作用^[30]。

2. 益生菌应用于肠道调节以促进伤口愈合

益生菌除了可以在伤口局部发挥其促愈合作用外，还能通过口服应用于肠道，从而调节全身反应来促进皮肤伤口愈合。其主要依靠刺激中枢神经系统、调节免疫反应以及促进营养物质吸收等三种生理途径来发挥其促愈合作用。

2.1. “肠道－脑－皮肤轴”调节

有研究表明，肠道益生菌及其代谢物可以形成神经活性分子来调节肠道黏膜中神经内分泌细胞的分泌活性，并可通过“肠道－脑－皮肤轴”来改善皮肤伤口愈合障碍患者的全身健康^[31]。如，Poutahidis等^[31]和Varian等^[32]发现，食用添加有罗伊氏乳杆菌的饮用水或含有罗伊氏乳杆菌菌株裂解物的膳食可直接调节肠道微生物群落，并通过刺激肠道上的迷走神经来内源性上调下丘脑中催产素的表达，进一步激活胸腺和外周淋巴细胞中的调节性T细胞，来抑制先天免疫系统所引起的过度炎症损伤。此外，食用罗伊氏乳杆菌还能通过刺激“下丘脑－垂体－肾上腺轴”，改善皮肤中由压力和应激所引起的炎性损伤，促进伤口组织中肉芽组织的成熟以及胶原蛋白在真皮中的沉积，使受试动物皮肤伤口愈合的速度加快近两倍。另外，饮用由乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等多种益生菌发酵牛奶所产生的开菲尔（Kefir）饮料，同样也能通过“肠道－脑—皮肤轴”来改善受试者的皮肤状况。如，Alves等^[33]研究表明，当连续八周摄入开菲尔后，受试者不仅皮肤经表皮失水量相对减少，而且其角质层水合作用也相应增加，这些都与皮肤屏障功能的增强直接相关；此外，还提到食用开菲尔可同时防止病原微生物感染，具有抗炎和抗氧化的能力。

2.2. 免疫调节

有研究表明，机体存在的部分免疫功能障碍通常与其肠道微生物群落的紊乱密切相关，因此食用特定的益生菌可调节肠道微生物群的组成或代谢活性，进一步调节先天性和适应性免疫反应，从而达到促进皮肤伤口愈合的作用^[34]。如，副干酪乳杆菌可以通过增加双歧杆菌和乳酸杆菌来调节肠道微生物群的组成，并可显著增加辅助性T细胞1（T helper cell 1，Th1）依赖性免疫反应，达到增强皮肤屏障功能以及降低皮肤敏感性的作用^[34]。而食用罗伊氏乳杆菌除了可刺激下丘脑—垂体激素来间接激活调节性T细胞外，还能促进血清中抗炎细胞因子白介素10的上调，以及促炎细胞因子白介素17A的下调，从而诱导人叉头框蛋白P3直接激活调节性T细胞，这不仅能增强皮肤黏膜的厚度以及上皮屏障的修复能力，还可促进机体免疫耐受，最大程度地减少过度炎症反应对伤口边缘组织所造成的损伤^[35]。

2.3. 促进营养物质的吸收

口服引入的益生菌还能通过调节肠道微环境来促进有益于皮肤伤口愈合的营养物质的吸收，特别是维生素、矿物质以及参与组织修复的酶的辅助因子等。如乳酸杆菌可以合成短链脂肪酸，并可通过降低肠道内的pH值来提高矿物质的溶解度^[36]；而罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌则可增加肠道内乳酸的产生，从而促进肠道对维生素D和维生素E的吸收^[37]。此外乳酸杆菌、棒状芽孢杆菌和红球菌还可通过产生维生素B12来增加机体对其的吸收和利用^[38]。

3. 改良益生菌产品及临床试验

目前，虽然对于益生菌如何促进伤口愈合大多还处在探索其作用机制的研究阶段，但随着人们对其进一步的开发应用，也相继展开了一些临床试验以及对临床应用方面具有参考价值的益生菌产品开发。如，Ming等^[39]研制了一种新型的活益生菌水凝胶敷料，该研究将罗伊氏乳杆菌用乳液聚合的方式封装在了水凝胶微球中，并通过甲基丙烯酸的修饰以及透明质酸的共价交联，进一步于水凝胶网络中固定。这样水凝胶支架不仅可以保护罗伊氏乳杆菌免受免疫系统的攻击，还避免了其他微生物的定植以及因过度释放益生菌对伤口造成的潜在伤害。今后也可借鉴将该种材料应用于其它益生菌中，不仅能正常释放对伤口愈合有益的生物活性物质，还可以起到生物屏障以及缓释控释的作用。潘杉等^[40]提到，哈尔滨高科技白天鹅药业集团生产了一种用于防治中、小面积Ⅱ度烧伤烫伤创面感染的喷雾剂，其主要是通过在伤口中植入枯草芽孢杆菌活菌并形成菌膜后，利用生物拮抗作用对烧伤创面发挥生物屏障和抑菌的功能，从而避免了金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌等病原微生物定植所引发的感染。Peral等^[41]则是直接将植物乳杆菌培养物铺在了纱布垫上，并完全覆盖在慢性静脉溃疡患者和普通患者的腿部伤口处，经检测发现，受试患者伤口中嗜中性粒细胞的凋亡和坏死程度相对减少，而肌成纤维细胞和内皮细胞的出现相对增多，这些都表明了其主要是通过降低伤口处的细菌负荷以及促进肉芽组织的形成，来加速皮肤伤口的愈合进程。此外，另一项通过对80名烧伤患者分别用植物乳杆菌与磺胺嘧啶银进行对照治疗的研究发现，在Ⅱ度烧伤患者中，植物乳杆菌疗法对71%的患者有效，其相比于磺胺嘧啶银73%的治疗率，两者疗效基本一致；而在Ⅲ度烧伤患者中，植物乳杆菌对83%的患者起到了促愈合作用，磺胺嘧啶银却仅为71%。由此可见，植物乳杆菌不仅可以作为磺胺嘧啶银的替代疗法，用于促进各种急慢性伤口愈合，还能在Ⅲ度烧伤患者中显现出相对更好的疗效^[42]。另外，Mohseni等^[43]发现益生菌疗法在糖尿病足患者中还能发挥出潜在的促愈合作用。该研究通过对60例患有Ⅲ级糖尿病足的患者分别给予安慰剂和益生菌（嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和双歧杆菌）治疗后发现，对比安慰剂疗法，治疗组（益生菌疗法）的糖尿病足患者不仅其溃疡长度、宽度和深度均显著减少，而且糖尿病足患者的血糖、总胆固醇、高敏C反应蛋白、血浆一氧化氮、抗氧化能力和丙二醛的水平也有所改善。而Peral等^[41]也同样发现，使用植物乳杆菌疗法还可使90%的糖尿病足患者的溃疡面积减少50%。Kasatpibal等^[44]通过对检索文献纳入的2 952 名患者进行荟萃（meta）分析后表明，益生菌除了可单独使用来发挥其促愈合效应外，还能与益生元组合形成合生元，通过促进皮肤共生菌的生长以及增强宿主免疫力来限制病原微生物的易位；而且术前和术后同时使用合生元，不仅能明显减少术后手术部位感染、肺炎以及脓毒症的发生，还可缩短住院时间和抗生素给药时间；此外，他们还将益生菌与抗生素结合使用，同样也能起到加速伤口愈合的作用。

4. 总结与展望

目前，国内仍使用抗生素和磺胺嘧啶银等传统药物来控制皮肤伤口的感染，但其不规范以及不恰当的使用通常会加剧伤口的恶性化，因此寻找新的替代疗法成了当前临床治疗中的关键性问题。本文则主要以皮肤伤口的对因治疗为主，介绍了益生菌如何通过伤口局部和肠道来促进各类急慢性皮肤伤口愈合，给未来益生菌药品的开发和应用提供了相关的理论依据。然而，益生菌属于微生物，促进益生菌的有利作用并减少其有害反应是其应用于伤口治疗的关键问题，因此人们仍需对其应用于机体后所产生的有利和有害反应展开进一步的研究。当前益生菌作为新型的治疗方法，仍有很多产品处在研究阶段，但随着人们对宿主与微生物间相互作用机制的进一步了解，益生菌疗法定会成为临床上促进伤口愈合的治疗方法之一。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：本文由董嘉利撰写，董嘉利完成文献检索及文章草稿、修改，王雪静梳理文章逻辑，对文章做出指导并进一步修改，王东对文章进行客观审校。所有作者都为本文的进一步修改做出了贡献。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（82104975）；省级大学生创新训练基金（S202110716053）；陕西中医药大学校级课题（2020GP20）

National Natural Science Foundation of China; China Provincial Innovation Training Fund for College Students; Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine School-level Projects