Abstract
目的
探索血浆中脂质代谢分子与颈动脉粥样硬化斑块、传统心血管危险因素的关系及可能的膳食相关因素。
方法
从参加2012年“亚临床动脉粥样硬化队列10年随访研究”的北京市石景山区1 312名社区人群中，按照入排标准(年龄 < 70岁、无临床心血管病及其他疾病等)筛选出85名有2个以上颈动脉软斑块或混合斑块者，以及相匹配的89名无斑块对照者；然后从中各随机抽取10名分别作为病例组和对照组。颈动脉斑块采用GE Vivid i超声仪(8L探头)确定。采用高效液相色谱-质谱联用法对脂质代谢分子进行检测，检测指标包括113种脂质代谢分子。传统心血管危险因素使用统一的标准问卷进行采集，膳食相关因素采用膳食使用频率和重量问卷进行采集。采用Wilcoxin秩和检验分析病例组和对照组脂质代谢分子的差异，在对照组中，采用Spearman相关法描述有统计学意义的脂质代谢分子与传统心血管危险因素、膳食因素的相关关系。
结果
在113种脂质代谢分子中检测出的53种脂质分子中，C24：0鞘磷脂，C22：0、C24：0神经酰胺，C18：0磷脂酰乙醇胺，C18：2 (Cis) 磷脂酰胆碱，C18：0磷脂酰胆碱等在颈动脉粥样硬化斑块病例组显著高于无斑块对照组。对照组相关分析发现，C24：0鞘磷脂与低密度脂蛋白胆固醇呈显著正相关(r=0.636，P < 0.05)，C18：2 (Cis) 磷脂酰胆碱与收缩压呈显著正相关(r=0.733，P < 0.05)，C18：0磷脂酰乙醇胺与高敏C反应蛋白呈显著正相关(r=0.782，P < 0.01)，C22：0、C24：0神经酰胺及C18：0磷脂酰乙醇胺与蔬菜摄入量呈显著负相关(r=-0.679，P < 0.05；r=-0.711，P < 0.05；r=-0.808，P < 0.01)，C24：0神经酰胺与豆类食品摄入量呈显著负相关(r=-0.736，P < 0.05)。
结论
血浆C24：0鞘磷脂、C22：0和C24：0神经酰胺、C18：0磷脂酰乙醇胺、C18：2和C18：0磷脂酰胆碱等脂质代谢分子升高可能是人类动脉粥样硬化斑块的新危险因素，这些分子可能与血脂、血压或炎症水平及蔬菜、豆制品摄入有关，但关联的性质需要在更大样本人群中验证。
Keywords: 脂质代谢分子, 动脉粥样硬化, 相关分析, 危险因素
Abstract
Objective
To explore the relationship between lipid metabolism molecules in plasma and carotid atherosclerotic plaques, traditional cardiovascular risk factors and possible dietary related factors.
Methods
Firstly, among 1 312 community people from those who participated in a 10-year follow-up study of subclinical atherosclerosis cohort in Shijingshan District, Beijing, 85 individuals with 2 or more carotid soft plaques or mixed plaques and 89 healthy individuals without plaques were selected according to the inclusive and the exclusive criteria (< 70 years, not having clinical cardiovascular disease and other diseases, etc.). Secondly, 10 cases and 10 controls were randomly selected in the above 85 and 89 individuals respectively. Carotid plaques were detected using GE Vivid i Ultrasound Machine with 8L detector. Lipid metabolism molecules were detected by high performance liquid chromatography-mass spectrometry. The detection indexes included 113 lipid metabolism molecules. Traditional cardiovascular risk factors were collected by unified standard questionnaires, and dietary related factors were collected by main dietary frequency and weight scale. The difference of lipid metabolism molecules between the case group and the control group was analyzed by Wilcoxin rank test. In the control group, the Spearman correlation method was used to analyze the correlation between statistically significant lipid metabolism molecules and traditional cardiovascular risk factors and dietary factors.
Results
Among the 113 lipid metabolism molecules, 53 lipid metabolism molecules were detected. C24:0 sphingomyelin (SM), C22:0/ C24:0 ceramide molecules, C18:0 phosphoethanolamine (PE) molecules, and C18:0/C18:2 (Cis) phosphatidylcholine (PC) were significantly higher in the carotid atherosclerotic plaque group than in the control group. The correlation analysis showed that C24:0 SM was significantly positively correlated with low density lipoprotein cholesterol (LDL-C, r=0.636, P < 0.05), C18:2 (Cis) PC (DLPC) was significantly positively correlated with systolic pressure (r=0.733, P < 0.05), C18:0 PE was significantly positively correlated with high sensitivity C-response protein (r=0.782, P < 0.01), C22:0, C24:0 ceramide and C18:0 PE were negatively correlated with vegetable intake (r=-0.679, P < 0.05;r=-0.711, P < 0.05;r=-0.808, P < 0.01), C24:0 ceramide was also negatively correlated with beans food intake (r=-0.736, P < 0.05) in the control group.
Conclusions
The increase of plasma C24:0 SM, C22:0, C24:0 ceramide, C18:0 PE, C18:2 (Cis) PC (DLPC), C18:0 PC (DSPC) may be new risk factors for human atherosclerotic plaques. These molecules may be related to blood lipid, blood pressure or inflammatory level and the intake of vegetables and soy products, but the nature of the association needs to be verified in a larger sample population.
Keywords: Lipid metabolism molecules, Atherosclerosis, Correlation analysis, Risk factors
目前，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)研究的瓶颈问题是其发病机制尚不明确。已知的AS危险因素包括胆固醇水平异常、高血压、糖尿病、吸烟、肥胖、家族史和不健康饮食等[1-4]，然而，这些危险因素如何导致AS发生的机制尚未明确。解释AS发生机制的假说有脂质沉积学说、炎症学说、压力(机械)损伤学说等，这些假说涉及一系列生物分子的复杂反应，包括胆固醇、低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白、细胞因子(C反应蛋白，细胞间黏附分子-1，集落刺激因子-1，肿瘤坏死因子，白介素-1、6、10、18)、一氧化氮、信号传导分子等[5-8]，这些分子在AS的发展过程中起着重要作用。既往研究多集中于已经发生的斑块，对AS发生发展起始阶段的关键作用生物分子的研究尚少见。脂质代谢异常在AS发生发展过程中有至关重要的作用，目前在人类血液中发现的脂质代谢分子包括鞘磷脂、神经酰胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇5大类，但到底何种脂质代谢分子是AS的关键因素尚不清楚[9-10]。因此，本研究通过中美心肺流行病学合作研究石景山社区人群的小样本预实验，探索人群血浆中脂质代谢分子与AS斑块及心血管危险因素的关系。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
2018年1月，从参加2012年“亚临床动脉粥样硬化队列10年随访研究”的北京市石景山区1 312名社区人群中，按照入排标准筛选出85名有2个以上颈动脉软斑块或混合斑块者，以及相匹配的89名无斑块对照者；然后从中各随机抽取10名分别作为病例组和对照组。本研究开始前已经北京大学生物医学伦理委员会审查批准(IRB00001052-12053)，所有研究对象均签署知情同意书。
入选标准：(1) 年龄低于70岁；(2) 心电图正常；(3) 有采集传统心血管危险因素和膳食数据；(4) 有两个及以上颈动脉粥样硬化软斑块或者混合斑块(仅限病例组)。
排除标准：(1) 有心肌梗死、心绞痛、中风史者；(2) 其他疾病史者[包括急性结缔组织病(两周内)、结缔组织病(类风湿、系统性红斑狼疮、风湿热等)、癌症、肝疾病、肾病、慢性呼吸系统疾病、风湿性心脏病、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、其他慢性疾病]；(3) 调查前两周内有手术史者；(4) 调查前10年内有心血管手术史者；(5) 有颈动脉斑块(仅限对照组)者。
1.2. 脂质测定仪器及试剂
Eksigent LC100和AB SCIEX Triple TOF 5600液质联用仪器购自美国SCIEX公司，XBridge Peptide BEH C18 (3.5 μm，2.1×100 mm)色谱柱购自美国Waters公司，Allegra 64R Centrifuge离心机购自美国BECKMAN COULTER公司，氮气吹扫仪(VSD150-2)购自中国无锡沃信仪器有限公司，乙酸铵(含量≥99%)、甲酸(含量≥98%)购自德国Fluka公司，乙腈、水、异丙醇购自美国Thermo Fisher Scientific公司，生理盐水购自中国吉林省都邦药业股份有限公司。
1.3. 血浆样本前处理和分析方法
检测样本为2012年调查人群采集的血浆，保存于－80 ℃冰箱，于4 ℃冰箱中解冻。取10 μL血浆，依次加入10 μL混合内标溶液[含C19:0-C19:0磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)浓度为2 mg/L, C17:0-C17:0磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)浓度为10 mg/L, C12:0鞘磷脂(sphingomyelin, SM)浓度为15 mg/L, C19:0 Lyso PC浓度为2 mg/L, C19:0神经酰胺浓度为10 mg/L的异丙醇-乙腈溶液]，10 μL 0.9%(质量分数) NaCl，100 μL氯仿-甲醇(2 ∶ 1)提取液，涡旋60 s，4 ℃冰箱静置30 min，13 000 ×g离心3 min后，1 mL注射器吸取下层液50 μL于1.5 mL EP管中，氮气吹干，加入25 μL乙腈-异丙醇(1 ∶ 1)复溶，涡旋60 s后用Eksigent LC100和AB SCIEX Triple TOF 5600仪器检测其中的脂类物质，其中Eksigent LC100的设置条件为：流动相A相是10 mmol/L乙酸铵+0.1%(体积分数)甲酸+99.9%(体积分数)水，流动相B相是10 mmol/L乙酸铵+0.1%(体积分数)甲酸+49.95%(体积分数)乙腈+49.95%(体积分数)异丙醇，柱温为40 ℃，进样室温度为4 ℃，流速为0.4 mL/min，进样体积是2 μL。AB SCIEX Triple TOF 5600仪器采用负离子模式进行测定，脂质分子浓度测定先设置一系列已知浓度和分子结构的标准脂质分子样本，通过比对测定样本与标准样本的保留时间、一级质谱信号和二级质谱碎片图来绝对定量测定样本相应脂质分子浓度。本研究选择目前较为常用的113种脂质分子进行检测。
脂质分子数据处理：参照脂质标准品数据库，用PeakView 1.2软件将血浆样品中的脂质定性，用MultiQuant 2.1对定性的脂质定量，得到峰面积数据，根据所对应的标准浓度的脂质分子面积，计算所检测的每种脂质分子浓度。在分别分析每种脂质分子的基础上，所有神经酰胺分子浓度相加的和作为血浆神经酰胺浓度。
1.4. 颈动脉斑块及内中膜厚度(intima-media thickness，IMT)测量
采用GE Vivid i超声仪(8L探头)进行颈动脉超声检测。待测对象取仰卧位，头后仰，并偏向检查侧对侧。探头置于被检血管相应体表走行区，由近心端至远侧进行连续扫查。斑块定义为局部内中膜增厚≥1.3 mm或局部隆起凸入管腔≥0.5 mm，检查范围包括双侧颈总动脉主干和颈动脉窦。斑块面积为血管纵切面图像上的最大面积。最大斑块面积的定义为左、右两侧颈总动脉和窦部4个血管段最大斑块的面积。颈动脉IMT定义为血管内膜上缘与中膜下缘之间的垂直距离。颈动脉IMT测量双侧颈总动脉近段、远段(颈动脉膨大部近端)、窦部、颈内动脉近段。颈总动脉近段仅测量远侧壁，其他三段血管测量近侧壁和远侧壁，分别均匀测量3个点，即双侧共42个点，如遇到斑块占位，则避开斑块选取3个满意测量点。双侧颈动脉上述14个部位42个测量点IMT的平均值作为反映个体颈动脉内中膜平均厚度指标进行分析。根据超声回声高低，将斑块区分为：1=硬斑块(高回声)；2=混合斑块(混合回声)；3=软斑块(低回声)。颈动脉超声检查的重复性评价结果见文献[11]。
1.5. 传统心血管危险因素的测量
2012年，使用“中美心肺流行病学合作研究”方案规定的标准问卷对所有研究人群进行了调查，包括出生日期、性别、吸烟情况等。吸烟定义为每天至少吸1支烟，持续1年以上。体重指数(body mass index, BMI)=体重(kg)/身高2(m2)。血压测量的工具为水银柱血压计，在右臂进行两次间隔至少30 s的连续测量读数，两次读数的平均值被用于分析。实验室检测项目包括空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等。清晨抽取空腹12 h静脉血标本进行检测，且所有的检测都在中心实验室完成。调查了主要膳食食用频率及重量。
1.6. 质量控制
本研究依据研究方案，制定了完善的工作手册，包括问卷、身高、体质量、血压、采血、标本运输、实验室检测等标准操作规程，所有参与调查人员均经过培训后参加调查。调查数据采用EpiData3.1(EpiData Association, Odense, Denmark)建立数据库，双人双遍录入，比对完全一致后进行数据核查，所有可疑数据解决后锁定数据。统计分析程序编写运行后由高级统计师进行复核，无误后出具统计结果。
1.7. 统计学分析
采用SAS 9.4软件(SAS Institute Inc., Cary, NC)，计数资料以n(%)表示，计量资料以中位数、最小值、最大值呈现。组间(有斑块/无斑块)比较采用秩和检验。脂质指标与膳食、心血管危险因素之间的相关关系采用Spearman相关分析，P < 0.05认为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 有动脉粥样硬化斑块组与无斑块组特征比较
有动脉粥样硬化斑块组与无斑块组的年龄、性别、现吸烟率、体重指数、收缩压、舒张压、空腹血糖、低密度脂蛋白胆固醇、C反应蛋白、高血压病史率、糖尿病病史率、心绞痛/心肌梗死病史率、中风病史率、降压治疗率、降脂治疗率、降糖治疗率、抗血小板治疗率组间差异均无统计学意义(表 1)。
表 1.
动脉粥样硬化斑块组和对照组病例的人口统计学指标比较
Demographic indicators of atherosclerotic plague group and control group
| Variables | Atherosclerotic plaque group (n=10) | Control group (n=10) | P value |
| Data were expressed as n(%) or M (minimum－maximum). P value were calculated by Wilcoxin rank test. BMI, body mass index; SBP, systolic blood pressure; DBP, diastolic blood pressure; LDL-C, low density lipoprotein cholesterol; hs-CRP, high sensitivity C response protein; CVD, cardiovascular disease; MI, myocardial infarction. | |||
| Age/years | 61.68 (58.42－67.04) | 62.97 (55.92－68.62) | 0.734 |
| Male | 6 (60) | 5 (50) | 1.000 |
| Smoking | 2 (20) | 2 (20) | 1.000 |
| BMI/(kg/m2) | 24.80 (19.75－28.89) | 26.11 (18.00－29.59) | 0.473 |
| SBP/mmHg | 139.50 (111.67－184.67) | 123.67 (110.33－149.00) | 0.140 |
| DBP/mmHg | 78.50 (71.67－119.00) | 72.00 (67.00－97.67) | 0.162 |
| Glucose/(mmol/L) | 5.64 (4.38－6.79) | 5.24 (4.89－9.43) | 0.623 |
| LDL-C/(mmol/L) | 4.21 (2.08－6.00) | 3.05 (1.26－4.57) | 0.054 |
| hs-CRP/(mg/L) | 2.37 (0.57－6.75) | 1.51 (0.61－7.39) | 0.473 |
| History of CVD | |||
| Hypertension | 7 (70) | 4 (40) | 0.370 |
| Diabetes | 2 (20) | 3 (30) | >0.999 |
| Angina/MI | 0 | 0 | - |
| Stroke | 0 | 0 | - |
| Treatment | |||
| Antihypertensive | 3 (30) | 3 (30) | 1.0 |
| Lipid lowering | 0 (0) | 0 (0) | - |
| Insulin | 0 | 3 (30) | 0.211 |
| Oral hypoglycemic drugs | 2 (20) | 1 (10) | >0.999 |
| Aspirin | 3 (30) | 1 (10) | 0.582 |
2.2. 血浆脂质指标与动脉粥样硬化斑块的关系
共检测出53个血浆脂质代谢分子指标，其峰面积如图 1所示。
图 1.
脂质分子检测的峰面积
Peak area of lipid molecular detection
神经酰胺：共检测了8种神经酰胺分子，检测出7种。与无斑块组相比，有动脉粥样硬化斑块组C22:0神经酰胺(0.42 mg/L vs. 0.52 mg/L，P=0.011)、C24:0神经酰胺(1.25 mg/L vs. 1.63 mg/L，P=0.009)显著较高，其余神经酰胺分子差异无统计学意义(表 2)。
表 2.
动脉粥样硬化斑块组与对照组脂质代谢分子检测结果
Lipid metabolism molecules between atherosclerotic plaque group and control group
| Items | Lipidomics indications | Total(n=20) | Control group (n=10) | Atherosclerotic plaque group (n=10) | P value |
| Data are expressed as M (minimum－maximum) (mg/L)，Wilcoxin rank test, P < 0.20. | |||||
| Ceramide | C24:0 ceramide | 1.39 (0.75－3.03) | 1.25 (0.75－2.14) | 1.63 (1.27－3.03) | 0.009 |
| C22:0 ceramide | 0.45 (0.21－1.02) | 0.42 (0.21－0.57) | 0.52 (0.43－1.02) | 0.011 | |
| C24:1 ceramide | 0.62 (0.27－1.32) | 0.49 (0.27－0.70) | 0.69 (0.41－1.32) | 0.054 | |
| C20:0 ceramide | 0.09 (0.04－0.20) | 0.08 (0.04－0.12) | 0.10 (0.05－0.20) | 0.076 | |
| Phosphatidylcholine (PC) | C18:2 (Cis) PC | 8.94 (3.90－15.85) | 7.31 (3.90－15.70) | 10.71 (8.27－15.85) | 0.021 |
| C18:0 PC | 0.14 (0.06－0.25) | 0.12 (0.06－0.21) | 0.16 (0.11－0.25) | 0.045 | |
| C16:1 (Δ9-Cis) PC | 1.27 (0.53－2.05) | 1.09 (0.53－2.05) | 1.62 (0.87－1.93) | 0.076 | |
| C18:0-22:6 PC | 6.76 (3.71－15.14) | 5.34 (3.71－15.14) | 7.73 (5.71－11.07) | 0.162 | |
| C20:4 (Cis) PC | 0.22 (0.06－0.45) | 0.20 (0.06－0.45) | 0.24 (0.12－0.39) | 0.186 | |
| Phosphorylethanolamine (PE) | C18:0 PE | 0.02 (0.01－0.12) | 0.01 (0.01－0.03) | 0.02 (0.01－0.12) | 0.045 |
| C18:0-C18:1 PE | 0.37 (0.14－1.35) | 0.27 (0.14－0.50) | 0.40 (0.19－1.35) | 0.121 | |
| C18:0-C18:2 PE | 1.90 (0.79－4.14) | 1.66 (0.79－4.14) | 1.99 (1.15－3.17) | 0.121 | |
| Sphingomyelin (SM) | C24:0 SM | 12.19 (6.62－16.09) | 10.65 (6.62－15.24) | 13.35 (10.44－16.09) | 0.017 |
磷脂酰乙醇胺：共检测了21种磷脂酰乙醇胺分子，检测出12种。与无斑块组相比，有动脉粥样硬化斑块组C18:0磷脂酰乙醇胺(0.01 mg/L vs.0.02 mg/L, P=0.045)显著较高，其余分子组间差异无统计学意义(表 2)。
鞘磷脂：共检测了9种鞘磷脂分子，检测出7种。与无斑块组相比，有动脉粥样硬化斑块组C24:0鞘磷脂(10.65 mg/L vs. 13.35 mg/L, P=0.017)显著较高, 其余分子组间差异无统计学意义(表 2)。
磷脂酰胆碱：共检测69种磷脂酰胆碱分子，检测出26种。与无斑块组相比，有动脉粥样硬化斑块组C18:2 (Cis) PC [18:2(Cis) dilauroyl phosphatidylcholine, DLPC; 7.31 mg/L vs. 10.71 mg/L, P=0.021]、C18:0 PC (18:0 1, 2-dioctadecanoyl-Sn-glycero-3-phophocholine, DSPC; 0. 12 mg/L vs. 0. 16 mg/L, P=0.045)较高，其余分子组间差异无统计学意义(表 2)。
磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)：共检测了6种PI分子，检测出1种。与无斑块组相比，有动脉粥样硬化斑块组C20:4 (Lyso) 磷脂酰肌醇组间差异无统计学意义(表 2)。
2.3. 脂质指标与膳食、传统心血管危险因素之间的关系
在无斑块对照组中，C22:0神经酰胺与蔬菜呈显著负相关关系(r=-0.679，P < 0.05)，C24:0神经酰胺与大豆和蔬菜呈显著负相关关系(r=-0.736，P < 0.05；r=-0.711，P < 0.05)；DLPC与收缩压呈显著正相关关系(r=0.733，P < 0.05)；C18:0 PE与高敏C反应蛋白呈显著正相关关系，与蔬菜呈显著负相关关系(r=0.782，P < 0.01；r=-0.808，P < 0.01)；C24:0 SM与LDL-C呈显著正相关关系(r=0.636，P < 0.05)；其余相关关系未达到显著性水平(表 3)。
表 3.
健康对照组脂质分子与心血管危险因素、膳食因素的Spearman相关系数
Spearman correlation coefficient of lipid metabolism molecules with cardiovascular risk factors and dietary factors in healthy group
| Cardiovascular risk factors | C22:0 ceramide | C24:0 ceramide | C18:2 (Cis) PC (DLPC) | C18:0 PC (DSPC) | C18:0 PE | C24:0 SM |
| PC, phosphatidylcholine; PE, phosphorylethanolamine; SM, sphingomyelin; LDL-C, low density lipoprotein cholesterol; BMI, body mass index; SBP, systolic blood pressure; DBP, diastolic blood pressure; hs-CRP, high sensitivity C-response protein; *P < 0.05, **P < 0.01. | ||||||
| LDL-C | 0.188 | 0.079 | －0.091 | 0.030 | －0.115 | 0.636* |
| Smoking count | 0.147 | －0.009 | －0.277 | －0.398 | －0.138 | 0.389 |
| BMI | 0.055 | －0.006 | －0.370 | －0.115 | 0.479 | －0.006 |
| SBP | 0.576 | 0.430 | 0.733* | 0.139 | 0.261 | 0.042 |
| DBP | 0.430 | 0.236 | 0.164 | 0.200 | －0.042 | 0.188 |
| Fasting blood sugar | 0.030 | 0.103 | 0.006 | －0.292 | －0.213 | －0.389 |
| hs-CRP | 0.297 | 0.200 | 0.115 | 0.345 | 0.782** | －0.406 |
| Dietary | ||||||
| Staple food | －0.617 | －0.541 | 0.171 | －0.021 | －0.350 | 0.212 |
| Bean products | －0.334 | －0.736* | －0.057 | 0.334 | －0.145 | －0.094 |
| Chicken and duck | －0.069 | －0.130 | －0.034 | 0.021 | －0.370 | 0.384 |
| Beef, pork, and lamb | 0.113 | 0.094 | －0.044 | －0.183 | －0.378 | 0.390 |
| Fish | －0.268 | －0.268 | 0.482 | 0.389 | －0.322 | 0.409 |
| Eggs | －0.228 | －0.319 | 0.156 | 0.410 | －0.189 | －0.286 |
| Milk and dairy products | －0.308 | 0.130 | －0.260 | －0.082 | －0.185 | 0.226 |
| Vegetables | －0.679* | －0.711* | －0.162 | －0.129 | －0.808** | 0.323 |
| Fruit | －0.020 | 0.203 | －0.334 | 0.400 | 0.374 | 0.361 |
| Nut | －0.256 | －0.479 | －0.479 | 0.177 | －0.059 | 0.007 |
| Pickle | 0.000 | 0.000 | －0.355 | －0.355 | 0.355 | －0.284 |
3. 讨论
本研究通过小样本社区人群研究发现，在鞘磷脂、神经酰胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇这5大类脂质代谢分子中，在检测出的53种脂质分子中，C22:0、C24:0神经酰胺、DLPC、DSPC、C18:0磷脂酰乙醇胺、C24:0鞘磷脂在病例组(有颈动脉粥样硬化斑块)显著高于对照组(无斑块)。
神经酰胺是由神经鞘氨醇长链碱基与脂肪酸组成神经鞘氨脂质的一种，近年来发现，在AS形成起始阶段，动脉内皮细胞受到辐射、氧化损伤、炎症刺激后，通过激活鞘磷脂酶或神经酰胺合成酶使细胞内神经酰胺含量增高，神经酰胺作为第二信使再作用于细胞内的神经酰胺靶物质，从而将细胞外的信息传递到细胞内，再通过某些与神经酰胺有关的通路引起细胞损伤甚至凋亡[12]。进一步研究发现，神经酰胺及其下游代谢产物鞘氨醇及磷酸鞘氨醇，还具有影响细胞分化、增殖、迁移、黏附、LDL聚集[13]、活性氧产生和基因表达(如细胞因子)、炎症、同型半胱氨酸/肿瘤坏死因子[14]发挥效应等作用，这些细胞反应和功能参与了AS的形成和发展的分子机制。因此，神经酰胺可能是AS形成过程中的关键作用分子。一项基于20名女性人群的分子研究表明，神经酰胺或其代谢物可能会加强长链脂肪酸对炎症的不良影响[15]。基于2个艾滋病病毒队列的研究发现[16]，血浆C16:0和C24:1神经酰胺水平升高通过炎症作用促进动脉粥样硬化进展，但是C22:0和C24:0神经酰胺未发现显著性差异。另一项研究发现[17]，C22:0和C24:0神经酰胺的升高与心血管事件发生风险呈正相关。本研究基于社区人群，采用人群流行病学方法为神经酰胺致AS效应提供了初步的科学依据，研究发现C22:0、C24:0神经酰胺与混合型或软性颈动脉粥样硬化斑块显著相关，表明神经酰胺对AS的作用始于AS的早期，因此早期采取预防措施有助于提前阻断AS过程，进一步的分析表明，蔬菜和豆制品有可能会阻断神经酰胺致AS作用，但仍需大样本研究证实。
鞘磷脂是哺乳动物细胞膜中主要的鞘脂种类，也是神经酰胺的主要来源。由脂蛋白转运到动脉壁的鞘磷脂，通过影响动脉壁鞘磷脂水解酶的活性，增加神经酰胺含量，并促进脂蛋白聚集。有研究表明[18]，血浆鞘磷脂浓度与AS的发生发展相关，是冠心病的独立预测因子。本研究发现鞘磷脂C24:0与亚临床AS也存在显著相关，进一步的分析表明，这种关联可能独立于传统的心血管危险因素，因此可能是动脉粥样硬化潜在的新的危险因素，但仍需要大样本队列研究证实。
磷脂酰乙醇胺是磷脂的代谢产物，其组织含量的变化与AS有关[19]，胞苷二磷酸-乙醇胺是其合成的主要途径[20]。有细胞培养研究表明，PE可以增强C反应蛋白与酶修饰的LDL之间的连接，这可能会影响AS过程[21]。本研究发现，新AS斑块的出现与C18:0磷脂酰乙醇胺有显著性关联，进一步分析表明，C18:0磷脂酰乙醇胺与高敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)有显著正相关关系(r=0.78, P < 0.01), 表明磷脂酰乙醇胺可能通过调节炎症过程在AS发展过程中起重要作用，但是由于本研究样本量较小，这些关联仍需要通过更大样本流行病学或临床研究进一步证实。如果该关联得到证实，它将对磷脂酰乙醇胺在AS过程中的作用提供新的解释。
磷脂酰胆碱是真核细胞中最重要的磷脂之一，是哺乳动物心脏中的主要磷脂，人类心肌细胞磷脂组成中磷脂酰胆碱约占40%, 是心肌梗死的危险因素[22]。本研究发现DLPC、DSPC的较高水平与颈动脉粥样硬化显著关联，这一关联以前未见在人群研究中报道过。有研究发现, 磷脂酰胆碱能通过肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNRα)依赖通路加强脂肪细胞的脂肪分解和凋亡[23]。本研究发现DLPC与收缩压有显著性正向关联，提示DLPC可能通过影响血压值影响AS过程。有研究显示缺血性心脏病和缺血性心肌病患者与冠脉狭窄小于50%的对照组相比，磷脂酰胆碱显著降低[24]。磷脂酰胆碱与AS的关系尚未有统一的认识，未来需要更多更深入的研究。
本研究存在一定的局限性：第一，研究样本量较小，因此，研究进行了统计学效能分析，上述关联的统计学效能均低于80%，由于小样本，P值未进行调整，因此上述关联仍需要在大样本人群中进行验证，如果能在大样本队列研究证实这种关联，将可能推动脂质代谢分子成为心血管病新的病因和重要治疗靶点；第二，本研究是横断面研究，上述因果关系的推断仍需进一步在队列研究中加以验证；第三，研究使用的是全血浆，由于不同的脂蛋白组分含有不同量的神经酰胺等，此处测得的值可能会被稀释[25]，从而减弱了脂质代谢分子与AS斑块的关联程度；第四，研究仅选择目前较为常用的113种脂质代谢分子进行检测，对全部脂质分子的覆盖率仍很有限，未来仍需进行覆盖更广泛的研究。
综上所述，本研究在小样本人群中的探索显示血浆C24:0鞘磷脂、C22:0和C24:0神经酰胺、C18:0磷脂酰乙醇胺、DLPC、DSPC等与颈动脉动脉粥样斑块可能相关，且可能与血脂、血压、炎症水平及蔬菜豆制品有关，提示这些脂质代谢分子可能是AS的新危险因素，但仍需大样本队列人群研究进行验证。
Funding Statement
国家自然科学基金(30872168、81473044)
Supported by the National Natural Science Foundation of China (30872168, 81473044)
Footnotes
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明 和静：标本管理，分析数据，撰写论文；房中则：实验室检测；杨颖：颈动脉超声检测；刘静：标本管理，论文修改；马文瑶：数据录入、整理，质量控制；霍勇、高炜、武阳丰：参与研究设计，论文修改；谢高强：设计研究方案，修改和审定论文。
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