Abstract
目的
通过观察抗着丝点抗体（ACA）阳性患者体外受精-胚胎移植和自然试孕结局，探讨此类患者的生育策略。
方法
采用病例对照研究回顾性分析2016年6月至2023年6月在浙江省人民医院接受体外受精-胚胎移植治疗且有抗核抗体（ANA）谱检查结果的3955例患者的临床资料。根据ACA结果将所纳入患者分为ACA阳性组和ACA阴性组。采用倾向评分匹配方法对两组进行1∶3配对，分别比较两组体外受精的胚胎结局；并采用自身对照分析不同授精方法和是否应用免疫抑制剂对结局的影响；对ACA阳性患者体外受精失败后的自然试孕和疾病进展进行随访。
结果
ACA阳性患者34例，占总病例数的0.86%，占ANA阳性体外受精患者数的2.51%。无论是接受常规体外受精（c-IVF）还是卵胞质内单精子注射（ICSI）的患者，ACA阳性组卵母细胞成熟度和受精情况均与ACA阴性组有明显差异（均P<0.01），且ACA阳性组授精后第三日（D3）次优胚数和D3优胚数均减少（均P<0.05）。5例ACA阳性患者自身ICSI周期相比c-IVF周期双原核（2PN）率未提高（P>0.05），D3优胚数和D3次优胚数减少（均P<0.05）。12例ACA阳性患者经过免疫抑制剂治疗1~2个月后再行c-IVF/ICSI，用药前后获卵和受精情况均未改变（均P>0.05），2PN胚胎卵裂率改善（P<0.05）。ACA阳性组与ACA阴性组移植胚胎数相近，但ACA阳性组胚胎着床率、临床妊娠率显著低于ACA阴性组（均P<0.05），流产率差异无统计学意义（P>0.05）。27例ACA阳性患者体外受精失败后尝试自然试孕或人工授精，共获临床妊娠7例。
结论
血清ACA阳性会干扰卵母细胞的成熟和正常受精过程，使用ICSI和免疫抑制剂不能改善受精结局，但ACA阳性患者有可能获得自然妊娠。
Keywords: 抗着丝点抗体, 体外受精-胚胎移植, 多原核受精, 卵母细胞成熟度, 胚胎发育结局, 妊娠结局
Abstract
Objective
To analyze the pregnancy outcomes in patients with positive anti-centromere antibodies (ACA) receiving in vitro fertilization (IVF)-embryo transfer (ET) and natural conception.
Methods
A case-control study was used to retrospectively analyze the clinical data of 3955 patients who received IVF-ET therapy and had the results of antinuclear antibody (ANA) spectrum at Zhejiang Provincial People’s Hospital from June 2016 to June 2023. Patients with positive ACA and negative ACA were matched at a ratio of 1∶3 using propensity score matching. Embryo outcomes of IVF were compared between the two groups, and the impact of different fertilization methods and the use of immunosuppressants on pregnancy outcomes were analyzed using self-matching. The natural conception and disease progress were followed up for ACA-positive patients after IVF failure.
Results
The ACA-positive patients accounted for 0.86% of all IVF patients (34/3955) and 2.51% of total ANA-positive IVF patients. Regardless of whether patients received conventional IVF (c-IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI), the ACA-positive group exhibited significant differences in oocyte maturity and fertilization compared to the ACA-negative group (both P<0.01). Moreover, the ACA-positive group had a decreased number of D3 suboptimal embryos and D3 optimal embryos (both P<0.05). In 5 cases of ACA-positive patients who underwent ICSI cycles, the two pronucleus (2PN) rate did not increase compared to c-IVF cycles (P>0.05), and there was a decrease in the number of D3 high-quality embryos and D3 suboptimal embryos (both P<0.05). After 1-2 months of immuno-suppressant treatment, 12 ACA-positive patients underwent c-IVF/ICSI again, and there were no changes in egg retrieval and fertilization before and after medication (both P>0.05), but there was an improvement in the 2PN embryo cleavage rate (P<0.05). The number of embryos transferred was similar between the ACA-positive and negative groups, but the ACA-positive group had significantly lower embryo implantation rate and clinical pregnancy rate compared to the ACA-negative group (both P<0.05), with no significant differences in the miscarriage rate between the two groups (P>0.05). Twenty-seven ACA-positive patients attempted natural conception or artificial insemination after IVF failure, resulting in a total of 7 cases of clinical pregnancy.
Conclusions
Serum ACA positivity may disrupt oocyte maturation and normal fertilization processes, with no improvement observed with ICSI and immunosuppressant use. However, ACA-positive patients may still achieve natural pregnancy.
Keywords: Anticentromere antibodies, In vitro fertilization-embryo transfer, Multiple pronucleus fertilization, Oocyte maturity, Embryonic development, Pregnancy outcome
免疫相关性不孕是生殖临床研究的热点，其致病机制和治疗方案饱受争议。1987年，研究发现患者卵泡液中存在ANA等自身抗体［1］，之后越来越多的研究发现ANA与不孕不育发病和体外受精失败有关［2-9］。有学者认为女性ANA阳性会导致卵子质量降低、体外受精胚胎发育受损、优质胚胎数较少、临床妊娠率降低［10-12］；也有学者认为ANA不影响胚胎质量［13-14］。ANA类型众多，不同亚型可能对体外受精影响不同。ACA是ANA的一种，2012年Shirota等［15］首先发现其对受精不利，但未深入研究。
ACA是一类以CENP为抗原的自身抗体，存在于血液、胸腔积液、滑膜液、卵泡液等体液中［5， 16］，与CREST综合征、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化等自身免疫性疾病相关［17-22］。着丝点是细胞分裂时纺锤体微管的染色体附着位点，在有丝分裂和减数分裂过程中保护和维持姐妹染色单体的聚合［23］。CENP主要由CENP-A、CENP-B和CENP-C这三种蛋白组成。其中，抗CENP-B抗体在ACA中最常见，几乎出现在所有抗ACA抗体阳性的患者中［24］。CENP-B通过招募CENP-A和稳定CENP-C发挥作用［25］。CENP-B缺乏或功能异常将导致着丝点新生障碍，表现为染色体主缢痕区形态及功能改变、染色体与纺锤体微管连接数减少甚至无法正常连接，增加染色体不稳定性，染色体错误分离率显著升高［26］。有关ACA对人类配子减数分裂，以及对胚胎甚至整个生殖健康影响的研究目前仍十分匮乏。
本研究收集了2016年6月至2023年6月在浙江省人民医院接受体外受精-胚胎移植患者的资料，发现其中ACA阳性率虽然不高，但严重影响辅助生殖结局，因此对ACA阳性患者的体外受精结局和自然试孕随访结局进行回顾性分析，以总结此类患者的不孕特征，希望为改进诊治提供新思路。
1. 对象与方法
1.1. 对 象
回顾性收集2016年6月至2023年6月在浙江省人民医院接受体外受精-胚胎移植治疗且有ANA谱检查结果的3955例患者的临床资料，排除年龄40岁以上及有恶性肿瘤或已知的遗传性不孕患者。根据ANA谱检查结果将研究对象分为ACA阳性组和ACA阴性组。ACA阳性患者34例，占ACA体外受精患者总数的0.86%（34/3955），占ANA阳性体外受精患者数的2.51%（34/1356），且34例抗CENP-B抗体均阳性。研究通过浙江省人民医院伦理委员会审查（浙人医伦审2023研第054号）。
1.2. 主要试剂和药物
ANA谱IgG检测试剂盒为德国Euroimmun公司产品；Vitrolife G-系列胚胎培养液为瑞典Vitrolife生物技术公司产品。促排卵药物尿源性人绝经期促性腺素（商品名丽申宝）为丽珠集团丽珠制药厂产品。重组促卵泡激素：注射用重组人促卵泡激素（商品名果纳芬，意大利Merck EuropeB.V/Merck Serono Europe Ltd公司；商品名金赛恒，长春金赛药业股份有限公司），重组促卵泡激素β注射液（商品名普丽康，荷兰Merck Sharp & Dohme BV公司）。免疫用药：羟氯喹（商品名酚乐，上海上药中西制药有限公司；商品名赛能，法国Sanof-Aventis公司）；环孢素（商品名新赛斯平，杭州中美华东制药有限公司）；泼尼松（商品名强的松，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司）。
1.3. 间接免疫荧光测定和欧蒙免疫印迹法检测ACA
采用ANA谱IgG检测试剂盒，以HEp-2和猴肝组织底物为抗原，在血清稀释比不低于1∶32的情况下，细胞核中出现明显的斑点图案定义为ANA阳性。将血清标本分别以1∶100、1∶320、1∶1000的比例进行稀释，得到ACA最终的滴度。采用欧蒙免疫印迹法对血清和卵泡液中的ACA靶抗原CENP-B进行检测。两种检测方法均呈阳性的患者纳入ACA阳性组。
1.4. 体外受精助孕过程
促排卵方案包括激动剂长方案、拮抗剂方案、高孕激素状态下促排卵方案、氯米芬联合促性腺激素促排卵方案等［27］。促性腺激素的药物品种和剂量根据患者对卵巢刺激的反应而定。当主导卵泡有一个直径为18 mm或两个直径为17 mm时，给予hCG或促性腺激素释放激素类似物扳机，35~38 h后取卵，在扳机39 h后对卵母细胞进行授精。c-IVF周期：在授精16~18 h后观察受精情况，同时对未受精的卵母细胞成熟度进行分期。ICSI周期：在显微注射前观察卵母细胞成熟度分期，仅对MⅡ卵母细胞进行显微注射，注射11~18 h后进行受精检查。参考伊斯坦布尔共识［28］对2PN胚胎情况进行分级：Ⅰ级为7～8个细胞对称性均匀，碎片化占10%以下，无多核化；Ⅱ级为7～8个细胞对称性均匀，碎片化占11%～25%，或至少有9个细胞对称性均匀，碎片化占26%以下；Ⅲ级为至少4个细胞对称性均匀，碎片化占50%以下。其中Ⅰ级、Ⅱ级为优胚，Ⅲ级胚胎为次优胚。胚胎发育每24 h评估一次，直至移植日或冷冻日。
1.5. 免疫抑制药物治疗
服用羟氯喹（200~400 mg/d）、泼尼松（5~10 mg/d）、环孢素（2次/d，每次50~75 mg）中的任意1~3种。
1.6. 随访方法
胚胎移植9 d后检测患者血清hCG。若结果呈阳性，患者在1~2周后接受超声检查确定是否临床妊娠，并随访至分娩或妊娠丢失。对hCG阴性患者亦进行电话长期随访，询问自然试孕、疾病进展和治疗情况。
1.7. 观察指标
取卵日观察指标：获卵率（%）=获卵数/穿刺卵泡数×100%，卵母细胞成熟度（%）=各期卵母细胞数/获卵数×100%。异常卵指卵母细胞透明带异常、极体异常、胞质异常、卵周间隙过大、卵母细胞形态异常。
授精后第一日（D1）观察指标：2PN判定为正常受精，0PN且后续未卵裂判定为未受精，1PN和≥3PN判定为异常受精。c-IVF周期正常受精率（%）=2PN卵数/所有卵母细胞数×100%，0PN率（%）=0PN卵数/所有卵母细胞数×100%，1PN率（%）=1PN卵数/所有卵母细胞数×100%，多PN率（%）=多PN卵数/所有卵母细胞数×100%；ICSI周期正常受精率（%）=2PN卵数/MⅡ卵母细胞数×100%，0PN率（%）=0PN卵数/MⅡ卵母细胞数×100%，1PN率（%）=1PN卵数/MⅡ卵母细胞数×100%，多PN率（%）=多PN卵数/MⅡ卵母细胞数×100%。
授精后第二日（D2）观察指标：正常卵裂胚胎是指在D2 2PN来源的卵裂胚胎。正常卵裂率（%）=2PN卵裂胚胎数/2PN数×100%。
授精后第三日（D3）观察指标：卵裂球数、卵裂球的均一度及胚胎碎片数。由于囊胚培养在本院为选择性治疗，因此未进行比较。
1.8. 统计学方法
采用R 4.1.0软件包进行PSM，将患者的年龄、AMH、不孕因素、体重指数作为预测变量，采用最近邻匹配方法计算各研究对象的倾向评分，选取ANA阴性患者进行1∶3匹配，卡钳值设为0.02。应用SPSS 27.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；符合非正态分布的计量资料用中位数（上下四分位数）［M（Q 1，Q 3）］表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料以例数（百分比）［n（%）］或率（%）表示，采用χ 2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结 果
2.1. 研究对象的基本特征
ACA阳性患者首周期为c-IVF授精方式18例，PSM匹配阴性组54例；ACA阳性患者首周期为ICSI授精方式16例，PSM匹配阴性组48例。PSM后同种授精方式下的ACA阳性组和ACA阴性组之间年龄、AMH、体重指数、不孕类型、不孕因素差异无统计学意义（均P>0.05），见表1。提示ACA阳性组和阴性组之间具有可比性。
表1.
倾向评分匹配后研究对象基本特征
| 组 别 | n | 年龄（岁） |
AMH （ng/mL） |
体重指数 （kg/m2） |
继发性不孕 | 不孕因素 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 女 方 | 男 方 | 双 方 | 原因不明 | ||||||
| c-IVF周期 ACA阳性组 | 18 | 32.6±3.6 | 4.4±3.3 | 22.5±3.8 | 10（55.6） | 18（100.0） | 0（0.0） | 0（0.0） | 0（0.0） |
| ACA阴性组 | 54 | 32.3±3.5 | 6.5±5.6 | 21.6±2.5 | 35（64.8） | 41（75.9） | 13（24.1） | 0（0.0） | 0（0.0） |
| ICSI周期 ACA阳性组 | 16 | 34.8±2.7 | 2.1（1.5，3.4） | 20.9±1.7 | 8（50.0） | 4（25.0） | 7（43.8） | 5（31.3） | 0（0.0） |
| ACA阴性组 | 48 | 33.3±4.1 | 3.7（2.0，6.8） | 21.0±1.9 | 27（56.3） | 18（37.5） | 11（22.9） | 18（37.5） | 1（2.1） |
AMH：抗米勒管激素；c-IVF：常规体外受精；ACA：抗着丝点抗体；ICSI：卵胞质内单精子注射.
±s或n（%）或M（Q 1，Q 3）
2.2. ACA阳性对胚胎结局的影响
无论是接受c-IVF还是接受ICSI的患者，ACA阳性组卵母细胞成熟度和受精情况均与ACA阴性组有明显差异（均P<0.01），且ACA阳性组D3次优胚数和D3优胚数减少（均P<0.01），见表2、3。
表2.
接受常规体外受精的ACA阳性与阴性患者首周期胚胎结局比较
| 组 别 | n | 获卵情况 | 受精情况 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 获卵数 | 获卵率 | 未受精 | 0PN&2PB | 1PN&2PB | 2PN&2PB | ≥3PN | |||||
| ACA阳性组 | 18 | 9.3±6.4 | 77.3（167/216） | 10.8（18/167） | 5.4（9/167） | 7.2（12/167） | 45.5（76/167） | 31.1（52/167） | |||
| ACA阴性组 | 54 | 10.1±5.7 | 76.8（533/694） | 15.6（83/533） | 6.9（37/533） | 2.8（15/533） | 66.8（356/533） | 7.9（42/533） | |||
| t或χ 2值 | — | －0.53 | 0.24 | 2.37 | 0.50 | 6.55 | 24.38 | 59.17 | |||
| P值 | — | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | |||
| 组 别 | n | 卵母细胞成熟度* | 胚胎发育 | ||||||||
| 异常卵 | GV卵 | MⅠ卵 | MⅡ卵 | 2PN卵裂率 | D3优胚数 | D3次优胚数 | |||||
| ACA阳性组 | 18 | 9.6（16/167） | 0.6（1/167） | 0.6（1/167） | 89.2（149/167） | 94.7（72/76） | 1.0（0.0，2.0） | 3.0（1.0，4.0） | |||
| ACA阴性组 | 54 | 2.3（12/533） | 0.8（4/533） | 3.8（20/533） | 93.2（497/533） | 93.5（333/356） | 4.0（1.0，7.0） | 5.0（3.0，8.0） | |||
| t或χ 2值 | — | 17.79 | 0.04 | 4.35 | 2.89 | 0.15 | －3.07 | －3.20 | |||
| P值 | — | <0.01 | >0.05 | <0.05 | >0.05 | >0.05 | <0.01 | <0.01 | |||
—：无相关数据. *系授精后第一日观察推断，MⅡ卵数=未受精MⅡ卵数+受精卵数. ACA：抗着丝点抗体；PN：原核；PB：极体；GV：生发泡期；MⅠ：第一次减数分裂中期；MⅡ：第二次减数分裂中期.
±s或%（n）或M（Q 1，Q 3）
表3.
接受卵胞质内单精子注射的ACA阳性与阴性患者首周期胚胎结局比较
| 组 别 | n | 获卵情况 | 受精情况 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 获卵数 | 获卵率 | 未受精 | 0PN&2PB | 1PN&2PB | 2PN&2PB | ≥3PN | |||||
| ACA阳性组 | 16 | 7.5（5.3，9.0） | 81.1（133/164） | 22.1（23/104） | 7.7（8/104） | 4.8（5/104） | 33.7（35/104） | 31.7（33/104） | |||
| ACA阴性组 | 84 | 6.0（2.8，11.3） | 75.8（360/475） | 21.2（72/339） | 2.1（7/339） | 3.5（12/339） | 71.4（242/339） | 1.8（6/339） | |||
| t或χ 2值 | — | －1.10 | 1.95 | 0.04 | 7.70 | 0.35 | 48.36 | 88.98 | |||
| P值 | — | >0.05 | >0.05 | >0.05 | <0.01 | >0.05 | <0.01 | <0.01 | |||
| 组 别 | n | 卵母细胞成熟度* | 胚胎发育 | ||||||||
| 异常卵 | GV卵 | MⅠ卵 | MⅡ卵 | 2PN卵裂率 | D3优胚数 | D3次优胚数 | |||||
| ACA阳性组 | 16 | 5.3（7/133） | 3.0（4/133） | 13.5（18/133） | 78.2（104/133） | 82.9（29/35） | 0.0（0.0，2.0） | 0.0（0.0，2.0） | |||
| ACA阴性组 | 84 | 1.7（6/360） | 1.7（6/360） | 0.6（2/360） | 94.2（339/360） | 97.5（236/242） | 2.0（1.0，4.0） | 3.0（1.0，5.0） | |||
| t或χ 2值 | — | 4.89 | 0.88 | 42.03 | 27.18 | 15.86 | －3.38 | －3.16 | |||
| P值 | — | <0.05 | >0.05 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | |||
—：无相关数据. *系授精当日观察得到. ACA：抗着丝点抗体；PN：原核；PB：极体；GV：生发泡期；MⅠ：第一次减数分裂中期；MⅡ：第二次减数分裂中期.
M（Q 1，Q 3）或%（n）
有5例ACA阳性患者首周期为c-IVF授精，后续周期改为ICSI授精，其中1例连续接受2周期c-IVF治疗后进行ICSI周期。更改受精方案后ACA阳性患者获卵、受精差异无统计学意义，但D3优胚、D3次优胚数减少（P<0.05），见表4。
表4.
抗着丝点抗体阳性患者c-IVF更改为ICSI方案前后胚胎结局比较
| 授精方式 | n | 获卵情况 | 受精情况 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 获卵数 | 获卵率 | 未受精 | 0PN&2PB | 1PN&2PB | 2PN&2PB | ≥3PN | ||||
| c-IVF | 5 | 6.3±3.8 | 69.1（38/55） | 18.4（7/38） | 7.9（3/38） | 2.6（1/38） | 29.0（11/38） | 42.1（16/38） | ||
| ICSI | 5 | 3.8±2.2 | 69.2（27/39） | 10.5（2/19） | 15.8（3/19） | 5.3（1/19） | 21.1（4/19） | 47.4（9/19） | ||
| t或χ 2值 | — | 0.49 | 0.00 | 0.59 | 0.84 | 0.26 | 0.41 | 0.14 | ||
| P值 | — | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | ||
| 授精方式 | n | 卵母细胞成熟度* | 胚胎发育 | |||||||
| 异常卵 | GV卵 | MⅠ卵 | MⅡ卵 | 2PN卵裂率 | D3优胚数 | D3次优胚数 | ||||
| c-IVF | 5 | 0.0（0/38） | 0.0（0/38） | 0.0（0/38） | 100.0（38/38） | 100.0（11/11） | 0.0（0.0，0.0） | 1.0±0.7 | ||
| ICSI | 5 | 11.1（3/27） | 0.0（0/27） | 18.5（5/27） | 70.4（19/27） | 100.0（4/4） | 0.0（0.0，1.0） | 0.0±0.0 | ||
| t或χ 2值 | — | — | — | — | 12.84 | — | 0.43 | 3.16 | ||
| P值 | — | >0.05 | >0.05 | >0.05 | <0.05 | — | <0.05 | <0.05 | ||
—：无相关数据. *c-IVF周期卵母细胞成熟度系授精后第一日观察推断，ICSI周期卵母细胞成熟度系授精当日观察得到. c-IVF：常规体外受精；ICSI：卵胞质内单精子注射；PN：原核；PB：极体；GV：生发泡期；MⅠ：第一次减数分裂中期；MⅡ：第二次减数分裂中期.
±s或%（n）或M（Q 1，Q 3）
上述结果提示，ACA阳性患者在c-IVF和ICSI周期均存在受精率较低、胚胎质量较差的情况，即使转为ICSI，多PN现象也没有明显改善。
2.3. 免疫抑制剂对ACA抗体阳性患者胚胎结局的影响
共有12例ACA抗体阳性患者前次c-IVF/ICSI结束经过免疫抑制剂治疗1~2个月后再次行c-IVF/ICSI，用药前后获卵和受精结果差异无统计学意义（均P>0.05），但2PN胚胎卵裂率改善（P<0.05），见表5。可见免疫抑制剂并未使体外受精周期明显获益。
表5.
抗着丝点抗体阳性患者应用免疫抑制剂前后重复周期的胚胎结局比较
|
免疫抑制剂 用药情况 |
n | 获卵情况 | 受精情况 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 获卵数 | 获卵率 | 未受精 | 0PN&2PB | 1PN&2PB | 2PN&2PB | ≥3PN | |||||
| 未用药周期 | 12 | 7.3±4.5 | 83.8（88/105） | 28.4（25/88） | 8.0（7/88） | 1.1（1/88） | 33.0（29/88） | 29.5（26/88） | |||
| 用药后周期 | 12 | 7.1±3.9 | 77.3（85/110） | 28.2（24/85） | 4.7（4/85） | 3.5（3/85） | 42.4（36/85） | 21.2（18/85） | |||
| t或χ 2值 | — | 0.15 | 1.46 | 0.00 | 0.77 | 1.10 | 1.63 | 1.60 | |||
| P值 | — | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | |||
|
免疫抑制剂 用药情况 |
n | 卵母细胞成熟度* | 胚胎发育 | ||||||||
| 异常卵 | GV卵 | MⅠ卵 | MⅡ卵 | 2PN卵裂率 | D3优胚数 | D3次优胚数 | |||||
| 未用药周期 | 12 | 2.3（2/88） | 1.1（1/88） | 5.7（5/88） | 90.9（80/88） | 82.8（24/29） | 1.0（0.0，2.0） | 1.4±1.2 | |||
| 用药后周期 | 12 | 2.4（2/85） | 2.4（2/85） | 8.2（7/85） | 87.1（74/85） | 100.0（36/36） | 0.5（0.0，2.0） | 0.6±1.5 | |||
| t或χ 2值 | — | 0.00 | 0.38 | 0.44 | 0.66 | 6.72 | －0.46 | －2.34 | |||
| P值 | — | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | <0.05 | >0.05 | <0.05 | |||
—：无相关数据. *c-IVF周期卵母细胞成熟度系授精后第一日观察推断，ICSI周期卵母细胞成熟度系授精当日观察得到. PN：原核；PB：极体；GV：生发泡期；MⅠ：第一次减数分裂中期；MⅡ：第二次减数分裂中期；c-IVF：常规体外受精；ICSI：卵胞质内单精子注射.
±s或%（n）或M（Q 1，Q 3）
2.4. ACA阳性对移植结局的影响
34例ACA阳性患者中21例获得了胚胎。对21例患者的移植周期进行分析（1例次鲜胚移植，29例次冻胚移植）并与PSM匹配的90例阴性组进行比较。两组间移植胚胎数和流产率差异无统计学意义（均P>0.05），但ACA阳性组临床妊娠率显著低于ACA阴性组（P<0.05），见表6。可见，ACA阳性患者在移植周期中移植胚胎数与阴性组相近，但临床妊娠率低于阴性组，着床后的妊娠丢失率并未升高。
表6.
ACA阳性与阴性患者胚胎移植后妊娠结局比较
| 组 别 | n | 移植胚胎数 | 未着床 | 生化妊娠 | 临床妊娠 | 临床妊娠流产 | 活 产 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ACA阳性组 | 30 | 2.0（1.0，2.0） | 66.7（20/30） | 3.3（1/30） | 30.0（9/30） | 33.3（3/9） | 20.0（6/30） |
| ACA阴性组 | 90 | 2.0（1.0，2.0） | 26.7（24/90） | 15.6（14/90） | 57.8（52/90） | 19.2（10/52） | 46.7（42/90） |
| t或χ 2值 | — | －0.25 | 15.50 | 3.07 | 6.95 | 0.91 | 6.67 |
| P值 | — | >0.05 | <0.01 | >0.05 | <0.05 | >0.05 | <0.05 |
—：无相关数据. ACA：抗着丝点抗体.
M（Q 1，Q 3）或%（n）
2.5. ACA阳性患者随访结果
对34例ACA阳性患者进行随访。7例经IVF/ICSI-ET累积移植后获得临床妊娠，其中6例成功分娩，1例孕9周胚胎停育，胚胎染色体检查为9号染色体三体。4例自然试孕获临床妊娠，其中3例顺利分娩；1例孕8周自然流产，胚胎染色体为16号染色体三体，后续自然试孕未孕。3例促排卵后经自然同房或宫腔内人工授精获临床妊娠，均已成功分娩。3例供卵治疗获临床妊娠，均成功分娩。15例患者至随访结束仍未妊娠。2例失访。在获得临床妊娠的患者中，仅有1例患者在停止免疫用药两年后成功自然受孕，并在怀孕期间恢复了免疫用药；而其余患者则在移植期和怀孕期间均接受了免疫抑制药物治疗，包括羟氯喹、泼尼松和环孢素等。可见，ACA阳性患者若能获得整倍体胚胎，移植或自然妊娠后活产率较高。
3. 讨 论
本研究回顾性分析了ACA阳性患者体外受精的相关实验室结果和临床结局。ACA阳性患者在本院寻求体外受精治疗的人群中占比低（0.86%），虽然是非主流的不孕症合并免疫问题，但普遍表现出体外受精预后差，值得重视。其特征总结为：①卵母细胞成熟度略受干扰，ICSI授精时阳性组MⅡ卵率降低，MⅠ卵率升高、生发泡期卵和结构异常卵并未增多，这与日本学者此前的发现一致［15］；②异常受精现象频发，ACA阳性组多PN受精率显著增多，其中≥4PN的现象也常见，改用ICSI技术也不能降低异常受精率；③胚胎发育受限，大多数患者不能获得可利用胚胎，ACA阳性组D3次优胚数、优胚数显著低于阴性组，这与此前的发现一致［15］。
据文献报道，c-IVF的多PN率为5.0%~8.1%，ICSI为2.5%~6.2%［29］。然而，本文资料显示ACA阳性患者c-IVF周期的多PN受精率比ACA阴性患者高4~7倍，ICSI周期更是高出4~12倍，提示这类患者的多PN并非来源于精子而是源自于卵子。Ying等［5］发现用ANA阳性患者血清共培养体外受精胚胎，胚胎内可显示IgG荧光，发育成优质胚胎数下降，临床妊娠率和着床率也降低。因此推测，ACA尤其是抗CENP-B抗体可能进入卵母细胞，引起卵母细胞CENP-B蛋白功能异常，导致纺锤体微管牵引染色体障碍，造成染色体分离的不稳定性。这种干扰持续存在于卵母细胞成熟-受精-卵裂过程，导致染色体与纺锤体连接数减少甚至无法正常连接，纺锤体的不稳定性增加，影响减数分裂进程［12］。从卵母细胞恢复减数分裂开始，尽管这类患者仍能获得成熟的MⅡ期卵母细胞，但其内部纺锤体的结构可能是混乱的（如出现同源染色体分离异常、单倍体和多极纺锤体），导致精子进入卵母细胞后，中心体与卵母细胞纺锤体结合过程受影响，两者不能正常结合或纺锤丝无法将染色体均匀引向细胞两极。ICSI治疗过程可能加重卵母细胞内微管微丝结构紊乱，如ICSI期间中期板区域受损、精子注射期间第一次减数分裂纺锤体的重新定向或卵母细胞骨架的损伤以及随后第二次减数分裂纺锤体的定向错误［20］。因此认为，ACA阳性患者选择c-IVF方案或许更佳。
为了降低ACA对患者卵母细胞的影响，尝试使用免疫抑制剂改善抗CENP-B抗体阳性患者的体外受精结局，但效果并不理想。患者应用免疫抑制剂前后获卵情况和受精情况未见差异，卵裂率增加、D3次优胚数降低。推测应用免疫抑制剂并不能有效抑制新抗体的生成，已存在的抗体无法在短时间内清除［21］，会持续存在于患者的卵泡液中。从产生窦腔的次级卵泡发育至优势卵泡排卵前需要约三个月［30］，理论上需要在取卵前至少三个月将卵泡液中抗体滴度下降至影响卵母细胞的下限滴度。因此，短期内免疫抑制剂的应用对患者体外受精结局的改善可能有限。
尽管ACA患者体外受精的获胚结局差，但偶有获优胚后能移植成功，均未流产。体外受精失败后，患者自然试孕亦有获得自然妊娠机会，而且自然受孕后流产风险并未增加；供卵3例均成功妊娠，且未发生流产。表明如果在排卵和受精环节未发生染色体的分离异常，后继胚胎发育很少受ACA的影响，妊娠结局良好，并不会出现类似其他ANA阳性早期流产率增加的情况。本文资料中，ACA阳性患者均因不孕症首诊，通过筛查发现ACA阳性，就诊时并无任何自身免疫损伤的表现，后期是否会出现典型的免疫相关症状尚待后期长期随访。
综上所述，ACA阳性患者卵母细胞减数分裂、受精、胚胎发育显著差于ACA阴性患者，且ICSI和使用免疫抑制剂并不能使这些患者获益。尽管c-IVF/ICSI并非解决ACA阳性患者问题的有效方法，但却让研究者成功发现导致这类患者不孕的重要原因是受精异常。幸运的是，患者仍有一定的体内妊娠成功率。但是，要精准高效解决这类患者的生育问题，需要更深入的研究和更具靶向的治疗。
Acknowledgments
研究得到浙江省医药卫生科技计划（2022RC108）支持
Acknowledgments
This study was supported by the Zhejiang Provincial Medical and Health Science Research Project (2022RC108)
［缩略语］
抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）；抗着丝点抗体（anticentromere antibody，ACA）；抗着丝点蛋白（centromere protein，CENP）；免疫球蛋白G（immuno-globulin G，IgG）；人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）；常规体外受精（conventional in vitro fertilization，c-IVF）；卵胞质内单精子注射（intracy-toplasmic sperm injection，ICSI）；第二次减数分裂中期（metaphase Ⅱ of meiosis，MⅡ）；原核（pronucleus，PN）；倾向评分匹配（propensity score matching，PSM）；抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）；第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ of meiosis，MⅠ）
利益冲突声明
所有作者均声明不存在利益冲突
Conflict of Interests
The authors declare that there is no conflict of interests
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