Abstract
目的
探究何氏养巢方（简称“养巢方”）提高卵巢颗粒细胞线粒体功能的机制。
方法
取36只6~8周龄C57BL/6J雌鼠随机分为空白对照组，模型对照组，养巢方小、中、大剂量组和阳性对照组。均予环磷酰胺90 mg/kg单次腹腔注射以建立原发性卵巢功能不全（POI）模型后，分组灌胃21 d后处死。另取6只6~8周龄C57BL/6J雌鼠造模后获取原代颗粒细胞，分为养巢方组、PHTPP（一种雌激素受体阻滞剂）组、养巢方+PHTPP组，分别予养巢方含药血清或PHTPP或同时给予两者干预培养24 h。分别采用苏木精-伊红（HE）染色观察卵巢组织病理学变化；荧光素酶法检测颗粒细胞腺苷三磷酸（ATP）水平；定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测线粒体DNA（mtDNA）的拷贝数；透射电镜观察线粒体结构变化；蛋白质印迹法检测雌激素受体β（ERβ）、过氧化物异酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC1α）、线粒体转录因子A（TFAM）、超氧化物歧化酶2（SOD2）蛋白表达；qRT-PCR检测Erβ、Pgc1α、Tfam、Sod2 mRNA表达。
结果
模型对照组卵巢组织次级及三级卵泡较少，养巢方各剂量组及阳性对照组次级及三级卵泡较多。与空白对照组比较，模型对照组颗粒细胞ATP和mtDNA水平均下降（均P<0.01），线粒体嵴消失或空泡化结构异常比例增加，ERβ、PGC1α、TFAM、SOD2蛋白及其mRNA表达均下降（均P<0.01）。养巢方中、大剂量组及阳性对照组颗粒细胞内ATP生成增多、mtDNA拷贝数增加（P<0.05或P<0.01）；颗粒细胞内结构异常线粒体减少，ERβ、PGC1α、TFAM、SOD2蛋白及其mRNA表达均增加（P<0.05或P<0.01）。体外实验中，与PHTPP组比较，养巢方+PHTPP组线粒体结构正常比例更高，线粒体ATP含量增加（P<0.05或P<0.01），mtDNA拷贝数增加（P<0.05或P<0.01）；ERβ、PGC1α、TFAM、SOD2蛋白及其mRNA表达均上升（P<0.05或P<0.01）。
结论
养巢方可以通过ERβ/PGC1α/TFAM通路提高线粒体生物发生从而改善POI小鼠卵巢功能。
Keywords: 早发性卵巢功能不全, 何氏养巢方, 线粒体, 雌激素受体β, 过氧化物异酶体增殖激活受体共激活因子1α, 线粒体转录因子A, 小鼠
Abstract
Objective
To investigate the effect of Chinese medicine He’s Yangchao recipe on premature ovarian insufficiency (POI) and its relationship with mitochondrial function of ovarian granulose cells in an animal model.
Methods
Thirty-six female C57BL/6J mice were randomly divided into blank control group, model group, low-, medium- and high-dose He’s Yangchao recipe treatment group and coenzyme Q10 (Q10) treatment group (positive control). The POI model was induced by a single intraperitoneal injection of cyclophosphamide (90 mg/kg). The animals were sacrificed after 21 days. Primary granulose cells were obtained from POI mice and treated with He’s Yangchao recipe, ERβ inhibitor PHTPP, and He’s Yangchao recipe+PHTPP in vitro for 24 h, respectively. Ovarian histopathological changes were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining, ATP levels were detected by luciferase assay, mtDNA copy numbers were detected by quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR), mitochondrial structure changes were observed by transmission electron microscopy, protein and mRNA expression levels of estrogen receptor β (ERβ), peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α (PGC1α), mitochondrial transcription factor A (TFAM), and superoxide dismutase 2 (SOD2) were detected by Western blotting and qRT-PCR.
Results
The ovarian tissue in model group exhibited few secondary and tertiary follicles, whereas the He’s Yangchao recipe groups and Q10 group had abundant secondary and tertiary follicles. Compared with the blank control group, ATP and mtDNA levels in model group decreased (P<0.01), mitochondrial crista disappeared or abnormal vacuolated structure increased; the protein and mRNA levels of ERβ, PGC1α, TFAM, and SOD2 decreased (all P<0.01). ATP production increased in granulose cells of high-dose He’s Yangchao recipe group and Q10 group; mtDNA copy numbers increased (P<0.05 or P<0.01); abnormal mitochondrial structure was reduced; the protein and mRNA expressions of ERβ, PGC1α, TFAM, and SOD2 increased (P<0.05 or P<0.01). Compared with the PHTPP intervention group, the proportion of normal mitochondrial structure in the granulose cells of He’s Yangchao recipe + PHTPP group was higher; ATP content increased (P<0.05 or P<0.01); mtDNA copy numbers increased (P<0.05 or P<0.01); the protein and mRNA expression of ERβ, PGC1α, TFAM and SOD2 increased (P<0.05 or P<0.01).
Conclusions
He’s Yangchao recipe can regulate mitochondrial biogenesis through ERβ/PGC1α/TFAM pathway to improve ovarian function in POI mice.
Keywords: Premature ovarian insufficiency, He’s Yangchao recipe, Mitochondria, Estrogen receptor β, Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α, Mitochondrial transcription factor A, Mice
小于40周岁的女性出现原发性或继发性闭经4个月以上，并且伴卵泡刺激素检测值增加（超过25 mIU/mL），即POI［1］。据估计，全球1%的女性在40岁之前受到POI的影响，0.1%的女性在30岁之前受到POI的影响［2］。POI患者表现为卵巢储备不足或过早耗尽，自然妊娠率低下；且在辅助生殖治疗中对促排卵药物反应性差，直接影响胚胎移植后妊娠率［3］。
近年来，中医药治疗POI因其疗效确切、毒性低而备受关注。何氏妇科学术继承人章勤教授认为，卵巢激素分泌及卵母细胞营养支持均为肾阴所主，POI病机当属肾阴不足、精血亏虚，宗“阳中求阴”之法，由加减苁蓉菟丝子丸化裁组成何氏养巢方（本文简称“养巢方”）［4］。其药物组成有肉苁蓉、菟丝子、覆盆子、葛根、天冬、柏子仁、当归、白芍。全方重在补肾阳、养精血、精血互生，使血充精足，促进卵泡的发育、排出，从而达到改善卵巢功能、提高卵子质量的目的。临床研究证实，养巢方对卵巢功能下降患者具有提高卵巢相关激素分泌水平和卵母细胞受精率的效果［4］；其在POI动物模型中同样具有改善卵巢颗粒细胞分泌功能、提高卵母细胞获卵数和受精率的作用［5-6］。另外，前期动物实验表明，养巢方能上调POI小鼠卵巢组织中ERβ的表达，而ERβ是经典核转录因子，可以通过刺激NRF1与PGC1α的相互作用，促进TFAM转录，是线粒体生物发生的关键［7］。基于此，本研究以ERβ/PGC1α/TFAM通路为切入点，通过体内外实验探索线粒体生物发生在POI发生发展中的作用，阐明养巢方通过ERβ/PGC1α/TFAM通路改善线粒体生物发生，从而提高卵巢颗粒细胞功能的分子机制。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物、药物、试剂及仪器
6~8周龄无特定病原体级雌性C57BL/6J小鼠42只，体重15~20 g；8~12周龄雌性SD大鼠6只，体重250~300 g，均购于上海斯莱克实验动物有限公司［动物生产许可证号SCXK（沪）2013-0018］。所有动物均饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心［实验动物使用许可证号SYXK（浙）2018-0012］：在屏障环境下，温度20~24 ℃，湿度50%~60%，光照每12 h明暗交替，换风次数15~20次/h。实验方案通过浙江中医药大学动物福利委员会审查（IACUC-20180402-02）。
养巢方为覆盆子15 g、菟丝子15 g、肉苁蓉15 g、当归10 g、葛根12 g、天冬10g、白芍10 g、柏子仁10 g，采用颗粒剂型，每克颗粒由2.25 g生药浓缩而成，由浙江省中药研究所有限公司提供。辅酶Q10片（10 mg/片）为卫材（中国）药业有限公司产品。环磷酰胺为美国Glpbio公司产品；孕马血清促性腺激素为南京爱贝生物科技有限公司产品；ER阻滞剂PHTPP为美国MedChem Express公司产品；HE染色套装为武汉赛维尔生物科技有限公司产品；DMEM/F12培养基为美国HyClone公司产品；胎牛血清为浙江天杭生物科技股份有限公司产品；ATP检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒为碧云天生物技术公司产品；SYBR Premix Ex TaqⅡ为日本TaKaRa公司产品；逆转录试剂盒为康为世纪生物科技股份有限公司产品；抗ERβ抗体、抗TFAM抗体、抗PGC1α抗体、抗SOD2抗体、抗β-actin抗体均为美国Affinity公司产品。
低温高速离心机（Micro17R）、细胞培养箱（BB150）、mRNA定量仪（Nanodrop one）均为美国Thermo公司产品；实时荧光定量PCR仪（CFX96）为美国Bio Rad公司产品；电泳仪（EPS300）、电泳槽（VE 180C）均为上海天能科技有限公司产品；化学发光仪（610020-9Q）为上海勤翔科学仪器有限公司产品；透射电镜（FE-2000）为日本Hitachi公司产品。
1.2. 建立POI小鼠模型及分组处理
选取6~8周龄雌性C57BL/6J小鼠30只，单次腹腔注射环磷酰胺90 mg/kg［8］，连续观察阴道脱落细胞涂片15 d及小鼠动情周期变化，以动情周期紊乱或动情间期延长为造模成功的判断标准。造模成功后，随机将模型小鼠分为养巢方小剂量组、养巢方中剂量组、养巢方大剂量组、阳性对照组和模型对照组各6只。另选取同周龄雌性C57BL/6J小鼠6只作为空白对照组。空白对照组和模型对照组予蒸馏水10 mL/kg，阳性对照组予辅酶Q10（根据临床剂量0.83 mg·kg－1·d－1换算）水溶液灌胃，1次/d。养巢方给药剂量参照《人和动物体表面积折算的等效剂量比率表》换算，小、中、大剂量组分别为临床成人用药剂量的1、2、4倍，即生药6、12、25 g/kg灌胃，1次/d，连续21 d。
1.3. 制备养巢方含药血清
取8~12周龄SD雌性大鼠6只，以养巢方大剂量（25 g/kg）连续灌胃7 d，末次灌胃后1 h麻醉，行腹主动脉采血。6只大鼠血清在50 mL离心管中混匀，室温静置30 min后4 ℃ 1000×g离心15 min，取上清液。0.22 μm滤器抽滤除菌后，分装冻存在－20 ℃冰箱备用。
1.4. POI小鼠原代细胞获取及分组培养
取6~8周龄雌性C57BL/6J小鼠6只，以环磷酰胺腹腔注射POI模型，造模方法及动情周期观察方法同上。造模成功后，孕马血清促性腺激素10 IU腹腔注射后48 h取卵巢，1 mL注射器针头释放收集原代颗粒细胞，用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM-F12培养基培养。置于37 ℃，5%二氧化碳全湿度培养箱内培养生长。细胞分为养巢方组、PHTPP组、养巢方+PHTPP组，分别给予90% DMEM/F12培养基（含青-链霉素）+10%养巢方含药血清、含PHTPP（100 nmol/L）［9］的DMEM/F12培养基（含青-链霉素）+10%胎牛血清、含PHTPP（100 nmol/L）的DMEM/F12培养基（含青-链霉素）+10%养巢方含药血清，放置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中继续培养24 h。每组设置三个复孔。
1.5. HE染色观察卵巢组织病理学改变
多聚甲醛固定各组小鼠卵巢组织，75%乙醇浸泡4~6 h，85%乙醇浸泡2 h，95%乙醇浸泡1 h，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ浸泡各30 min，香柏油中浸泡过夜；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡各15 min，蜡块包埋并切片、捞片、烤片。切片依次放入两缸二甲苯各15 min；依次放入两缸无水、95%、85%、75%乙醇各3 min；苏木素染液浸泡3~5 min；流水返蓝2 h；流水冲洗玻片，伊红染液浸泡5 min；95%乙醇、二甲苯各两缸分别浸泡5 min，中性树胶封片，加盖玻片封固，采集图像。
1.6. 荧光素酶法检测ATP水平
动物实验中，释放各组小鼠原代卵巢颗粒细胞；细胞实验中，收集各组经干预后的颗粒细胞。细胞裂解后在4 ℃、12 000×g下离心5 min，取上清液。根据ATP检测试剂盒说明书配置标准液和工作液。加100 μL ATP检测工作液到检测孔，在检测孔内加20 μL样品或标准液，混匀，用化学发光仪测定相对光强度值。
1.7. qRT-PCR法检测细胞质mtDNA水平
动物实验中，释放各组小鼠原代卵巢颗粒细胞；细胞实验中，贴壁颗粒细胞经胰蛋白酶消化后重悬于磷酸盐缓冲液，分别置于摇床上室温孵育10 min，4 ℃下16 000×g离心25 min。通过DNA试剂盒分别提取上清（细胞质）和沉淀（总）的DNA，采用mtDNA特异的引物进行PCR定量。mtDNA上游引物5 -TAGCATCACACACCGCACAA-3 ，下游引物5 -GAGTGGGAAGAAGAAAGAGAGGAA-3 ；内参基因β-globin上游引物5 -CCCTTGGACCCAGAGGTTCT-3 ，下游引物5 -CGAGCACTTTCTTGCCATGA-3 。将每个样本的细胞质mtDNA与总mtDNA进行标准化。
1.8. 透射电镜观察线粒体结构
各组小鼠处死后收集卵巢释放原代颗粒细胞培养，使用Karnovsky法进行化学固定后，用二甲胂酸盐缓冲液洗三次，然后将贴壁细胞刮下，转移至1.5 mL EP管中，1000×g离心1 min，弃上清液。加入液态琼脂糖将细胞重悬，1000×g离心1 min，置于冰上30 min使琼脂糖凝固。将凝固的细胞块修剪成1 mm3的块状，用50%、70%、90%梯度乙醇脱水，每个浓度15 min；90%乙醇与90%丙酮（1∶1）脱水15 min，再用90%丙酮脱水15 min；用812树脂包埋；制备超薄切片，3%醋酸铀-柠檬酸铅双染色。透射电镜下观察细胞超微结构并采集图像。
1.9. qRT-PCR法检测ERβ/PGC1α/TFAM通路mRNA表达
动物实验中，释放各组小鼠原代卵巢颗粒细胞；细胞实验中，收集各组经干预后的颗粒细胞，参照TRIzol说明书进行颗粒细胞总RNA的提取。采用M-MLV逆转录试剂盒逆转录为cDNA。GAPDH为内参照，每组加入QuantiTect SYBR Green、上游引物、下游引物和cDNA。逆转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。定量PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；熔解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。反应完成后，得到所有标本的记录曲线，用2－∆∆Ct表示mRNA相对表达量。ERβ上游引物5 -TAGTCGTGGGCAGTCTTTGC-3 ，下游引物5 -TCACAGGACCAGACACCGTA-3 ；TFAM上游引物5 -AACACCCAGATGCAAAACTTTCA-3 ，下游引物5 -GACTTGGAGTTAGCTGCTCTTT-3 ；PGC1α上游引物5 -GACAGCTTTCTGGGTGGATTG-3 ，下游引物5 -GGAGACTGGGCCGTTTAGT-3 ；SOD2上游引物5 -CAGACCTGCCTTACGACTATGG-3 ，下游引物5 -CTCGGTGGCGTTGAGATTGTT-3 ；内参基因GAPDH上游引物5 -TCAACGGCACAGTCAAGG-3 ，下游引物5 -TGAGCCCTTCCACGATG-3 。
1.10. 蛋白质印迹法检测ERβ/PGC1α/TFAM通路蛋白表达
动物实验中，释放各组小鼠原代卵巢颗粒细胞；细胞实验中，收集各组经干预后的颗粒细胞。细胞充分裂解后，将匀浆转入1.5 mL离心管中4 ℃、12 000×g离心30 min，转移上清液至新的离心管中，并通过BCA检测蛋白提取液的蛋白浓度，蛋白样品行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚偏二氟乙烯膜进行转膜，并用脱脂奶粉封闭非特异性结合，然后依次孵育目标一抗ERβ（1∶2000）、PGC1α（1∶2000）、TFAM（1∶2000）、SOD2（1∶2000）、β-actin（1∶2000）及二抗后化学发光法显影，检测各组组织标本中的ERβ、PGC1α、TFAM、SOD2表达水平，以β-actin作为内参照。以ImageJ进行灰度值分析。
1.11. 统计学方法
采用GraphPad Prism软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（ ±s）表示，不符合正态分布的数据采用中位数（上下四分位数）［M（Q 1，Q 3）］表示。计量资料多组间比较用单因素方差分析；组间两两比较若符合正态分布且方差齐性采用SNK检验，若符合正态分布但方差不齐则采用Dunnett’s T3检验或独立样本t检验；组间两两比较若不符合正态分布，则采用Kruskal-Wallis H检验。计数资料用例数（百分比）［n（%）］表示，采用χ²检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结 果
2.1. POI模型鼠造模成功
空白对照组活泼好动，饮食量正常，大小便形状色量均正常，毛色乌黑有光泽，灌胃配合度高；模型对照组精神低萎，活动量少，毛色枯槁无华，易脱毛，喜蜷缩，饮食量及饮水减少，大便稀溏，小便量较少，性情较狂躁。造模前，各组小鼠动情周期均正常；造模后，模型对照组相比空白对照组出现不同程度的动情周期延长、停滞及无周期，紊乱发生比例均为100%（均P<0.05），提示POI造模成功。
2.2. 养巢方改善POI小鼠卵巢卵泡发育
空白对照组卵巢各级卵泡清晰可见，卵泡数较多；模型对照组卵巢体积明显萎缩，纤维化明显，卵巢中各级卵泡数较少；与模型对照组比较，养巢方小、中剂量组卵巢组织中黄体数较多、次级卵泡数较多，可见成熟的三级卵泡；养巢方大剂量组和阳性对照组卵巢组织中卵泡数丰富，各级卵泡均可见，次级及三级卵泡中颗粒细胞数较多且呈放射状整齐排列（图1）。提示养巢方可改善环磷酰胺造成的POI模型卵泡生长发育。
图1. 各组卵巢组织病理学观察结果（HE染色）.
空白对照组小鼠卵巢各级卵泡清晰可见；模型对照组小鼠卵巢体积明显萎缩，纤维化明显，可见闭锁卵泡；养巢方各剂量组及阳性对照组可见各级卵泡及黄体，其中养巢方大剂量组次级卵泡中颗粒细胞丰富且呈放射状整齐排列. 黑色箭头代表三级卵泡，绿色箭头代表次级卵泡，黄色箭头代表闭锁卵泡，五角星代表黄体. 各组右图为左图局部放大图，左图标尺=500 μm，右图标尺=100 μm. HE染色：苏木精-伊红染色.
2.3. 养巢方改善POI小鼠卵巢颗粒细胞线粒体生物发生
与空白对照组比较，模型对照组颗粒细胞中ATP含量显著降低（P<0.01）；与模型对照组比较，养巢方中、大剂量组和阳性对照组细胞中ATP含量显著升高（P<0.05或P<0.01）；养巢方中、大剂量组与阳性对照组ATP含量差异均无统计学意义（均P>0.05），见表1。
表1.
各组卵巢颗粒细胞中ATP含量和mtDNA拷贝数比较
| 组 别 | ATP含量（μmol/L） | mtDNA拷贝数 |
|---|---|---|
| 空白对照组 | 3.21±0.24 | 164.49±15.50 |
| 模型对照组 | 1.84±0.14** | 49.08±4.30** |
| 养巢方小剂量组 | 2.04±0.19△ | 57.02±4.76△△ |
| 养巢方中剂量组 | 2.13±0.21# | 68.23±5.91#△△ |
| 养巢方大剂量组 | 2.49±0.18 | 101.41±9.60 |
| 阳性对照组 | 2.66±0.29 | 118.80±10.53 |
与空白对照组比较，** P<0.01；与模型对照组比较，# P<0.05， P<0.01；与阳性对照组比较，△ P<0.05，△△ P<0.01. ATP：腺苷三磷酸；mtDNA：线粒体DNA.
n=3， ±s
电镜下可见，空白对照组线粒体数较多，聚集分布在细胞核附近，线粒体基本无肿胀，内膜嵴结构清晰可见；模型对照组卵巢颗粒细胞中线粒体数减少，线粒体空泡征和嵴消失的比例显著增高；养巢方各剂量组及阳性对照组细胞内空泡线粒体数明显减少，正常线粒体数有所增加（图2）。qRT-PCR结果显示，模型对照组卵巢颗粒细胞中线粒体mtDNA拷贝数较空白对照组显著减少（P<0.01）；而养巢方中、大剂量组及阳性对照组卵巢颗粒细胞中线粒体mtDNA拷贝数较模型对照组显著增加（P<0.05或P<0.01）；养巢方大剂量组与阳性对照组差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
图2. 各组卵巢颗粒细胞中线粒体电镜下观察.
空白对照组正常线粒体（红色箭头所示）数多；模型对照组细胞中正常线粒体数减少，异常线粒体空泡征（绿色箭头所示）和嵴消失的比例显著增高；养巢方各剂量组及阳性对照组细胞内空泡线粒体数较模型对照组明显减少，正常线粒体数有所增加. 标尺=2 μm.
以上结果提示，中大剂量养巢方可显著改善POI小鼠卵巢颗粒细胞线粒体ATP水平及颗粒细胞内线粒体结构和数量。
2.4. 养巢方提高POI小鼠卵巢颗粒细胞ERβ/PGC1α/TFAM通路表达
与空白对照组比较，模型对照组卵巢颗粒细胞中ERβ、TFAM、PGC1α、SOD2蛋白和mRNA表达水平显著降低（均P<0.01）；与模型对照组比较，养巢方中、大剂量组和阳性对照组卵巢颗粒细胞中ERβ、TFAM、PGC1α、SOD2蛋白和mRNA表达水平显著升高（P<0.05或P<0.01），其中养巢方大剂量组与阳性对照组差异均无统计学意义（均P>0.05），见图3，表2、3。结果提示，中大剂量养巢方可有效改善POI卵巢颗粒细胞中ERβ/PGC1α/TFAM通路表达。
图3. 各组卵巢颗粒细胞中ERβ、TFAM、PGC1α和SOD2蛋白电泳图.
ER：雌激素受体；TFAM：线粒体转录因子A；PGC1α：过氧化物异酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α；SOD：超氧化物歧化酶；β-actin：β-肌动蛋白.
表2.
各组卵巢颗粒细胞中ERβ、TFAM、PGC1α和SOD2蛋白表达比较
| 组 别 | ERβ | TFAM | PGC1α | SOD2 |
|---|---|---|---|---|
| 空白对照组 | 1.00±0.10 | 1.00±0.10 | 1.00±0.10 | 1.00±0.10 |
| 模型对照组 | 0.43±0.04** | 0.21±0.02** | 0.26±0.03** | 0.26±0.03** |
| 养巢方小剂量组 | 0.52±0.06△△ | 0.23±0.02△△ | 0.29±0.03△△ | 0.28±0.03△ |
| 养巢方中剂量组 | 0.59±0.06#△△ | 0.53±0.05△ | 0.54±0.05△ | 0.43±0.05 |
| 养巢方大剂量组 | 0.65±0.07 | 0.66±0.07 | 0.68±0.06 | 0.51±0.05 |
| 阳性对照组 | 0.75±0.07 | 0.80±0.09 | 0.86±0.08 | 0.69±0.07 |
与空白对照组比较，** P<0.01；与模型对照组比较，# P<0.05， P<0.01；与阳性对照组比较，△ P<0.05，△△ P<0.01. ER：雌激素受体；TFAM：线粒体转录因子A；PGC1α：过氧化物异酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α；SOD：超氧化物歧化酶.
n=3， ±s
表3.
各组卵巢颗粒细胞中Erβ、Tfam、Pgc1α和Sod2 mRNA表达比较
| 组 别 | Erβ | Tfam | Pgc1α | Sod2 |
|---|---|---|---|---|
| 空白对照组 | 1.00±0.08 | 1.00±0.09 | 1.00±0.08 | 1.00±0.09 |
| 模型对照组 | 0.30±0.03** | 0.23±0.02** | 0.58±0.05** | 0.40±0.04** |
| 养巢方小剂量组 | 0.36±0.03△ | 0.28±0.03△△ | 0.65±0.06△ | 0.45±0.05△△ |
| 养巢方中剂量组 | 0.42±0.04#△△ | 0.33±0.03#△△ | 0.73±0.07#△ | 0.53±0.05#△△ |
| 养巢方大剂量组 | 0.70±0.07 | 0.65±0.06 | 0.93±0.08 | 0.72±0.06 |
| 阳性对照组 | 0.70±0.07 | 0.72±0.07 | 0.95±0.10 | 0.83±0.08 |
与空白对照组比较，** P<0.01；与模型对照组比较，# P<0.05， P<0.01；与阳性对照组比较，△ P<0.05，△△ P<0.01. ER：雌激素受体；TFAM：线粒体转录因子A；PGC1α：过氧化物异酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α；SOD：超氧化物歧化酶.
n=3， ±s
2.5. 养巢方逆转ERβ阻滞后颗粒细胞中线粒体生物发生
体外实验结果显示，与养巢方组比较，PHTPP组ATP含量和mtDNA拷贝数显著降低（均P<0.01）；与PHTPP组比较，养巢方+PHTPP组ATP含量和mtDNA拷贝数显著增加（均P<0.05）。见表4。结果提示，养巢方可提高ERβ阻滞后颗粒细胞线粒体生物发生水平。
表4.
各组颗粒细胞中ATP含量和mtDNA拷贝数比较
| 组 别 | ATP含量（μmol/L） | mtDNA拷贝数 |
|---|---|---|
| 养巢方组 | 2.60±0.21** | 109.29±12.08** |
| PHTPP组 | 1.76±0.13 | 60.84±6.58 |
| 养巢方+PHTPP组 | 2.26±0.17* | 83.66±7.61* |
与PHTPP组比较，* P<0.05，** P<0.01. ATP：腺苷三磷酸；mtDNA：线粒体DNA；PHTPP：4-［2-苯基-5，7-双（三氟甲基）吡唑并（1，5-a）嘧啶-3-基］苯酚.
n=3， ±s
2.6. 养巢方提高ERβ阻滞后颗粒细胞中ERβ/PGC1α/TFAM表达水平
与养巢方组比较，PHTPP组ERβ、PGC1α、TFAM、SOD2蛋白和mRNA表达显著减少（均P<0.01）；与PHTPP组比较，养巢方+PHTPP组ERβ、PGC1α、SOD2蛋白表达显著增加（P<0.05或P<0.01），Erβ、Pgc1α、Tfam、Sod2 mRNA表达显著增加（均P<0.01）。见图4和表5、6。结果提示，养巢方可提高ERβ阻滞后颗粒细胞中ERβ/PGC1α/TFAM通路表达。
图4. 各组颗粒细胞中ERβ、TFAM、PGC1α和SOD2蛋白电泳图.
PHTPP：4-［2-苯基-5，7-双（三氟甲基）吡唑并（1，5-a）嘧啶-3-基］苯酚；ER：雌激素受体；TFAM：线粒体转录因子A；PGC1α：过氧化物异酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α；SOD：超氧化物歧化酶；β-actin：β-肌动蛋白.
表5.
各组颗粒细胞中ERβ、TFAM、PGC1α和SOD2蛋白表达水平比较
| 组 别 | ERβ | TFAM | PGC1α | SOD2 |
|---|---|---|---|---|
| 养巢方组 | 1.00±0.08** | 1.00±0.08** | 1.00±0.09** | 1.00±0.10** |
| PHTPP组 | 0.12±0.01 | 0.41±0.04 | 0.17±0.02 | 0.31±0.03 |
| 养巢方+PHTPP组 | 0.46±0.04** | 0.50±0.05 | 0.44±0.05** | 0.53±0.06* |
与PHTPP组比较，* P<0.05，** P<0.01. ER：雌激素受体；TFAM：线粒体转录因子A；PGC1α：过氧化物异酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α；SOD：超氧化物歧化酶；PHTPP：4-［2-苯基-5，7-双（三氟甲基）吡唑并（1，5-a）嘧啶-3-基］苯酚.
n=3， ±s
表6.
各组卵巢颗粒细胞中Erβ、Tfam、Pgc1α和Sod2 mRNA表达水平比较
| 组 别 | Erβ | Tfam | Pgc1α | Sod2 |
|---|---|---|---|---|
| 养巢方组 | 1.00±0.10** | 1.00±0.11** | 1.00±0.08** | 1.00±0.09** |
| PHTPP组 | 0.34±0.03 | 0.33±0.04 | 0.39±0.03 | 0.38±0.04 |
| 养巢方+PHTPP组 | 0.67±0.07** | 0.65±0.07** | 0.85±0.07** | 0.75±0.08** |
与PHTPP组比较，** P<0.01. ER：雌激素受体；TFAM：线粒体转录因子A；PGC1α：过氧化物异酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α； SOD：超氧化物歧化酶；PHTPP：4-［2-苯基-5，7-双（三氟甲基）吡唑并（1，5-a）嘧啶-3-基］苯酚.
n=3， ±s
3. 讨 论
何氏养巢方是浙派中医何氏妇科的代表方之一，临床应用多年，治疗POI疗效显著。前期用UPLC-ESI-MS/MS系统鉴定何氏养巢方水提物中的主要生物活性成分，包括黄豆苷元、山柰酚、黄芪甲苷、金丝桃苷、染料木素、芦丁、鞣花酸、猕猴桃苷、没食子酸、Z-藁本内酯、槲皮素、烟花苷、松果菊苷、芍药苷、阿魏酸、芹菜素、葛根素、毛蕊花素和延龄草素等［10］。其中槲皮素、芦丁、山柰酚等多种成分均被发现具有改善线粒体功能的作用［8， 11-12］。
本研究利用环磷酰胺建立POI小鼠模型，分析了何氏养巢方对POI小鼠卵巢组织学、颗粒细胞线粒体生物发生和ERβ/PGC1α/TFAM通路相关靶点表达的影响。选用目前临床POI辅助用药方案中与线粒体功能最相关的辅酶Q10作为阳性对照［13-14］。体外实验部分以POI颗粒细胞为目的细胞，采用阻滞ERβ的方法研究何氏养巢方通过ERβ/PGC1α/TFAM通路影响线粒体生物发生的作用。体内实验结果证实，何氏养巢方可以有效改善POI小鼠卵巢卵泡发育及颗粒细胞内线粒体生物发生。体外实验结果发现，阻滞ERβ受体可引起颗粒细胞线粒体生物发生水平下降，而养巢方含药血清可提高被PHTPP抑制的ERβ/PGC1α/TFAM通路蛋白及mRNA表达水平，并改善线粒体生物发生。
线粒体“生命周期”始于核DNA和mtDNA编码蛋白质的协同合成，以及线粒体膜生物合成和呼吸链亚基的正确定位和折叠，这些内容被归纳为线粒体的生物发生，而生物发生是线粒体发挥各种生物功能的基础［15］。同样地，在卵巢颗粒细胞中，线粒体为其增殖生长、合成分泌激素等活动提供能量［16］。一旦线粒体发生异常，必然影响颗粒细胞正常活动的供能，从而限制颗粒细胞的功能，并促进颗粒细胞凋亡。研究发现，线粒体mtDNA含量与卵巢功能不全存在相关性［17］。PGC1α和TFAM是线粒体生物发生非常关键的调节因子。PGC1α是一种转录共激活因子，活性PGC1α移位到细胞核中，激活核NRF-1和NRF-2，随后转录核编码呼吸链成分和TFAM［18］。TFAM是线粒体转录和翻译的直接调控子，以组织特异性方式促进线粒体的生物发生，调控线粒体质量和生命周期，其轻链和重链启动子中有特定的mtDNA结合域，可以激活mtDNA的转录并调节mtDNA的复制，是生殖细胞中稳定mtDNA拷贝数的关键调控因子［19］。
随着科学技术的不断发展，人们发现由内源性雌激素和雄激素水平以及性染色体编码的基因介导性别差异在疾病发生中扮演着极为重要的角色，也是当前提出的精准个性化治疗的基础。雌激素可以系统地调节能量平衡和新陈代谢；雌激素结合受体ERα和ERβ是保守的核受体，可以调控细胞内线粒体生物发生行为［7］。有研究发现，ERβ选择性激动剂DPN可部分恢复原代大鼠海马神经元中的基础和最大氧合反应，并对抗合成淀粉样蛋白β寡聚体治疗诱导的线粒体氧合反应抑制［20］。在原代人子宫内膜异位细胞中过表达标记为ERβ的线粒体靶向序列会增加基础氧合反应和线粒体储备，敲除ERβ则会降低子宫内膜异位症细胞中NRF1、TFAM、MT-CO1和MT-ATP6转录物的表达，并增加抗凋亡蛋白Bcl-2，从而拯救氧化应激诱导的线粒体凋亡［21］。以上这些数据揭示了ERβ在线粒体生物发生功能的关键作用。关于ERβ在线粒体中的具体作用途径，目前研究证实ERβ主要通过刺激活化PGC1α，使之与NRF-1之间相互作用，促进TFAM转录，包括结合mtDNA并调节其转录的TFAM［22］。
综上，本研究结果发现何氏养巢方可明显改善ER阻滞剂PHTPP对ERβ、PGC1α、TFAM、SOD2蛋白和mRNA表达的抑制作用，且该通路的下游表型——线粒体生物发生也得到一定程度的改善，证实了何氏养巢方对颗粒细胞线粒体生物发生的改善作用是可以通过ERβ/PGC1α/TFAM通路实现的，为何氏养巢方的临床利用提供了科学依据。
Acknowledgments
研究得到国家自然科学基金（82305296）、浙江省中医药管理局中医药现代化项目（2021ZX012）、杭州市卫生科技计划（Z20230103）和浙江省中医药管理局章勤名中医工作室（GZS2017014）支持
Acknowledgments
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (82305296), Research Project of Moderni-zation of Traditional Chinese Medicine granted by the Admini-stration of Traditional Chinese Medicine of Zhejiang Province (2021ZX012), Health Science and Technology Scheme of Hangzhou City (Z20230103), Zhejiang Zhangqin Famous Traditional Chinese Medicine Expert Inheritance Studio Project (GZS2017014)
［缩略语］
早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）；雌激素受体（estrogen receptor，ER）；核呼吸因子（nuclear respiratory factors，NRF）；过氧化物异酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC1α）；线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）；4-［2-苯基-5，7-双（三氟甲基）吡唑并（1，5-a）嘧啶-3-基］苯酚｛4-［2-phenyl-5，7-bis（trifluoromethyl）pyrazolo（1，5-a）pyrimidin-3-yl］phenol，PHTPP｝；苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）；腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）；信使RNA（messenger RNA，mRNA）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）；定量逆转录PCR（quantitative reverse transcriptase-PCR，qRT-PCR）；线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）；互补DNA（complementary DNA，cDNA）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）
利益冲突声明
所有作者均声明不存在利益冲突
Conflict of Interests
The authors declare that there is no conflict of interests
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