R环结合蛋白对肺腺癌患者预后的预测及药物敏感性分析

Abstract

Objective

To investigate the association of R-loop binding proteins with prognosis and chemotherapy efficacy in lung adenocarcinoma.

Methods

The data related to R-loop regulatory genes were obtained from literature of R-loop proteomics and relevant databases. We used 403 cases of lung adenocarcinoma in the Cancer Genome Atlas as training set, and two datasets GSE14814 and GSE31210 in Gene Expression Omnibus as validation sets. The weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) was employed to identify R-loop genes with a significant impact on the clinical phenotype of lung adenocarcinoma. Least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) regression analysis was utilized to eliminate genes exhibiting multicollinearity. A multivariate Cox regression analysis was employed to scrutinize clinical variables and R-loop characteristic genes that exert independent prognostic effects on patient survival. Subsequently, a risk score model was constructed. The predictive capacity of this model for the prognosis of patients was analyzed and validated. Additionally, the performance of risk model on the anti-tumor drug sensitivity was assessed. The mutations of R-loop genes were analyzed by maftools. The effect of PLEC expression on anti-tumor drug sensitivity was tested on non-small cell lung adenocarcinoma H1299 and A549 cells in vitro.

Results

A collection of 1551 R-loop genes were obtained, and 78 genes exhibited significant effects on the clinical phenotype shown on WGCNA. The LASSO regression analysis retained fourteen R-loop genes. A multivariate Cox regression analysis further identified three R-loop genes (HEXIM1, GLI2, PLEC) and a clinical variable (tumor grading) that were associated with patient prognosis. Risk prediction model was established according to the regression coefficients of each parameter. Kaplan-Meier survival analysis showed that the prognosis of high-risk group was significantly worse than that of low-risk group (P<0.01). The time-dependent ROC curve showed that the risk model had good predictive ability in both training and validation sets. Predictive analyses of anti-neoplastic drug sensitivity indicated a diminished responsiveness to both chemotherapy and targeted treatment drugs among high-risk patients. The expression of PLEC was strongly correlated with sensitivity to gefitinib, a classical EGFR inhibitor.

Conclusion

R-loop binding proteins have been identified as significant determinants in the prognosis and therapeutic strategies for lung adenocarcinoma, which indicates that therapeutic interventions targeting these specific R-loop binding proteins might contribute to a better survival of the patients.

基因组稳定性是一切生命活动的基础，基因组不稳定是导致肿瘤发生的一个关键生物学因素。除了DNA碱基编码序列改变引起基因组不稳定外，异常的基因组结构也可以干扰DNA复制和转录等正常活动从而威胁整个基因组的稳定性。近年来，RNA分子介导的基因组不稳定性受到了国际上的广泛关注，特别是当转录产生的新生RNA链暂时无法与退火产生的模板DNA分开，同时与打开的非模板DNA链共同形成的RNA-DNA杂交三链体结构，即R环（R-loop），被认为是复制压力和DNA损伤的重要来源^［1-2］。R环介导的基因组不稳定性机制包括：①R环顶端的双链DNA与DNA-RNA杂交双链转换螺旋区不稳定，在核苷酸切除修复下引起DNA断裂^［3］；②游离的非模板单链DNA易遭受胞嘧啶脱氨酶的攻击，在碱基切除修复下引起DNA断裂^［4］；③当细胞周期处于S期时，DNA转录和复制共享DNA模板，转录和复制碰撞促进R环积累并触发转录-复制冲突，是破坏DNA复制叉进程的结构性障碍^［5］。

肿瘤的发展与病理性R环积累有着错综复杂的关联，且R环调控异常参与肿瘤演进的具体分子生物学基础仍不清楚。R环结合蛋白组分在R环积累与清除水平的动态调控中起直接作用，蛋白质组学能够识别结合R环结构的蛋白质分子，通过生物学功能验证，可以筛选并解析R环调控机制的关键分子。基于蛋白质组学研究进展，本文通过收集整理R环结合蛋白作为R环调节相关基因，以肺腺癌为临床对象，采用生物信息学的研究思路（附图1），筛选与肿瘤预后及治疗响应等临床表型有关的分子标志物，不仅为R环结合蛋白在调控R环和肺腺癌进展中的具体作用提供新的生物学基础，也为肺腺癌患者预后评估及临床决策提供新分子分型的生物学依据。

图1. R环基因在肺腺癌中的表达差异火山图.

1. 材料与方法

1.1. R环相关基因的收集

R环相关基因来源于大规模R环互作蛋白质组数据或专业数据库数据，包括Cristini等^［6］鉴定的RNA/DNA杂交链蛋白质组数据469条、Wang等^［7］鉴定的蛋白质组数据803条、Mosler等^［8］采用临近标记技术鉴定的蛋白质组数据612条和R-loopBase数据库（https：//rloopbase.nju.edu.cn/）收集的蛋白质数据1293条。合并R环相关基因条目并去重后得到R环相关基因数据1780条。使用SynGO工具（https：//www.syngoportal.org/convert）将所有蛋白质名称转换成HGNC基因通用名称后最终得到R环相关基因数据1551条。

1.2. 肺腺癌基因表达数据与临床资料的收集

使用R语言TCGAbiolinks包下载403例肺腺癌患者相关临床资料和转录组测序数据作为训练集，剔除80%以上病例基因表达值为0的R环基因的转录组测序数据，以及随访时间不足30 d或生存时间信息缺失病例的临床资料（附表1）。同时，收集GEO数据库中GSE14814和GSE31210两个数据集的数据作为验证集（附表2和附表3），用于验证预后风险模型的预测性能。

表1.

基因模块与临床特征的相关性分析

模块颜色	肿瘤 组织	正常 组织	删失 （包括存活）	死 亡	年 龄	男 性	女 性	肿瘤分级
								Ⅰ级	Ⅱ级	Ⅲ级	Ⅳ级
棕色	0.360 （<0.01）	－0.360 （<0.01）	－0.100 （0.02）	0.100 （0.02）	－0.070 （0.08）	0.050 （0.26）	－0.050 （0.26）	－0.100 （0.01）	0.090 （0.02）	0.003 （0.94）	0.070 （0.09）
绿松石色	0.560 （<0.01）	－0.560 （<0.01）	－0.080 （0.06）	0.080 （0.06）	－0.120 （<0.01）	0.110 （<0.01）	－0.110 （<0.01）	－0.090 （0.04）	0.050 （0.26）	0.020 （0.62）	0.080 （0.05）
绿色	－0.300 （<0.01）	0.300 （<0.01）	0.080 （0.05）	－0.080 （0.05）	0.130 （<0.01）	－0.130 （<0.01）	0.130 （<0.01）	0.070 （0.07）	－0.050 （0.21）	－0.004 （0.92）	－0.080 （0.06）
红色	0.210 （<0.01）	－0.210 （<0.01）	0.090 （0.03）	－0.090 （0.03）	－0.080 （0.06）	0.020 （0.62）	－0.020 （0.62）	0.100 （0.01）	－0.090 （0.04）	－0.060 （0.17）	0.020 （0.68）
灰色	0.070 （0.11）	－0.070 （0.11）	0.030 （0.43）	－0.030 （0.43）	0.050 （0.25）	－0.030 （0.50）	0.030 （0.50）	0.020 （0.63）	－0.020 （0.56）	0.003 （0.93）	－0.010 （0.79）

r（P）

1.3. R环调节基因功能注释及富集分析

采用在线工具webgestalt（https：//www.webgestalt.org/）对R环调节基因进行基因功能注释。采用limma包对肺腺癌基因转录本进行差异表达分析，以|log₂FC|≥1和校正P<0.05为标准筛选出差异表达的R环相关基因，然后采用GO和KEGG富集分析对差异表达基因进行富集分析。同时，采用GSEA软件（版本号4.3.2）对所有可能具有生物学意义的基因列表进行富集分析，从而探索生物学信号通路的变化。

1.4. 采用WGCNA筛选与临床表型关联的R环基因模块

为了避免遗漏一些无差异表达但有生物学意义或临床意义的基因，研究根据基因的共表达模式，对收集的全部R环相关基因采用WGCNA包构建加权基因共表达网络，利用拓扑树结构区分与特定性临床表型相关联的基因模块，结果以层级聚类树状图表示；计算模块与临床表型特征之间的相关性和显著性，结果以模块与临床表型特征关联热图表示。

1.5. 预后风险模型的构建和验证

利用R Studio与survival包和glmnet包进行LASSO回归分析，进一步筛选与肺腺癌患者预后相关的基因变量。最后，采用多因素Cox回归分析筛选与患者预后独立相关的临床变量和R环特征基因，并在此基础上建立风险回归模型：风险评分= ${\sum }_i^{n}coef\times Xi$ ，其中n代表变量数，X为纳入模型的变量，coef是回系数，Xi为变量值。

以风险评分中位数为截断值进行高、低风险分组，利用survival、survminer以及ggplot2包绘制高、低风险组的Kaplan-Meier生存曲线，利用ggrisk包绘制风险评分图，利用rms与timeROC包绘制1、3、5年的时间依赖ROC曲线，在训练集和验证集中验证预后风险模型的预测性能。

1.6. 构建肺腺癌患者预后风险评估列线图

为了更加直观地展现各个因素对预后风险的贡献大小，运用R Studio的rms包，将潜在预测指标进行整合，构建肺腺癌列线图模型并对模型进行内部验证，利用校准曲线及其C指数评估模型的区分度，通过rmda包绘制临床决策曲线列线图，从而预测模型的临床适用性，并根据其阈值范围及临床净收益进行解读。

1.7. R环特征基因突变分析及验证

基于TCGA数据库得到的maf文件，探索数据库中肺腺癌常见突变基因与R环特征基因的突变频率和突变类型。利用maftools包展现基因的突变特征与基因之间的互斥性和共现性。比较R环特征基因在肺腺癌常见突变基因突变肿瘤组织与非突变肿瘤组织中的表达情况，结果以小提琴图表示。运用R语言和GraphPad Prism软件比较PLEC基因在多种肿瘤组织中的突变频率，结果以柱状图表示。

1.8. 不同风险患者对化疗药物的敏感性分析

以风险评分中位数分组肿瘤样本，以R环特征基因表达水平建立基因表达矩阵表。以GDSC数据库中GDSC2药敏数据作为训练集，采用oncoPredict包预测高、低风险患者对不同抗肿瘤药物的敏感性并筛选显著的抗肿瘤药物，同时对特征基因与抗肿瘤药物敏感性进行相关性分析。

1.9. PLEC基因沉默与药物敏感性功能验证

1.9.1. 细胞及其培养

EGFR野生型人肺腺癌细胞株H1299和A549细胞株购买于中国科学院上海细胞库，在37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，培养基为含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640。细胞传代时间少于6个月，取对数生长期的细胞进行实验。

1.9.2. PLEC基因沉默实验

PLEC基因编码蛋白为Plectin。PLEC特异的siRNA（5 $\mathrm{´}$ -GAAGAGACACAGAUCGACAUU-3 $\mathrm{´}$ ）及阴性对照由韩国Bioneer公司合成。为验证Plectin沉默效果，将细胞接种于六孔板中，干扰组和阴性对照组siRNA每孔的转染量为25 pmole，转染试剂Lipofectamine^® RNAiMAX Reagent（美国Invitrogen公司）量为3.5 μL，分别用250 μL的opti-MEM稀释，制备每孔500 μL的转染复合物转染细胞。48 h后裂解细胞，采用蛋白质印迹法鉴定蛋白质干扰效果，其中Plectin检测抗体为英国Abcam公司产品。

1.9.3. CCK-8法分析PLEC基因沉默对细胞活性和药物敏感性的影响

吉非替尼为美国Selleck公司产品，用二甲基亚砜溶解成10 mmol/L储备液。将两株细胞接种于96孔板中，转染PLEC特异siRNA和阴性对照48 h后，更换正常培养基，加入溶剂对照或不同浓度吉非替尼（终浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L）继续培养48 h。培养结束后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在酶标仪450 nm处读取吸光度值。细胞存活率（%）=［（实验孔吸光度值－空白孔吸光度值）/（对照孔吸光度值－空白孔吸光度值）］×100%。

1.10. 统计学方法

采用R4.3.1进行统计分析。正态分布的计量数据采用均数±标准差（ $\overline{x}$ ±s）表示，两组或多组细胞活性比较采用学生t检验、单因素方差和事后Dunnett检验。两组生存比较采用log-rank对数秩检验。采用Pearson相关系数衡量两个连续变量的线性相关。P<0.05为具有统计学意义。

2. 结果

2.1. R环调节基因的功能注释和富集分析

对1551个R环基因进行功能注释发现，这些R环基因主要分布于RNA剪接、DNA复制、核糖体合成、错配修复、碱基切除修复、RNA代谢等生物学途径（附图2）。肺腺癌中R环基因中表达值 $\left|\mathrm{l}\mathrm{o}{\mathrm{g}}_{\mathrm{2}}\mathrm{F}\mathrm{C}\right|$ ≥1的差异基因有201个，其中上调基因155个，下调条基因46个（图1）。上调差异基因富集气泡图显示，显著富集的GO通路为染色体结构、细胞周期调控等，显著富集的KEGG通路为系统性红斑狼疮、细胞周期等（附图3）。GSEA分析结果显示，显著富集的Hallmarks通路包括G2/M检查点（G2M_CHECKPOINT）、E2F靶标（E2F_TARGETS）、糖酵解（GLYCOLYSIS）、有丝分裂纺锤体（MITOTIC_SPINDLE）、紫外线响应上调（UV_RESPONSE_UP）等（附图4）。以上结果提示有丝分裂期相关的周期检查点蛋白、E2F转录因子家族、糖代谢关键酶、DNA损伤应答等基因是肺腺癌中R环调控异常的主导基因。

图2. 绿色模块基因与患者生存状态相关性散点图.

图3. 风险评分模型对肺腺癌患者预后的预测效果.

A：TCGA数据库；B：GSE14814数据库；C：GSE31210数据库.

图4. 肺腺癌患者预后风险预测列线图模型.

HEXIM：环己二乙酰胺诱导蛋白；GLI：GLI家族锌指蛋白；PLEC：网蛋白.

2.2. 与肺腺癌患者预后关联的R环基因模块

将全部1551个R环相关基因纳入WGCNA分析，以β=7作为软阈值（soft threshold）构建无尺度网络（附图5）。在合并切割高度（mergeCutHeight）为0.5、最小模块大小（minModuleSize）为50的聚类标准下（附图6），共得到5个模块（棕色、绿松石色、绿色、红色、灰色），其中棕色、绿松石色、绿色和红色模块与样本类型的相关性最为显著，绿色模块与患者生存状态的关联最为显著，涉及R环相关基因78个（表1、图2）。

图5. 不同风险评分组对抗肿瘤药物的敏感性比较.

图6. PLEC基因沉默后Plectin蛋白表达电泳图.

PLEC：网蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶.

2.3. LASSO与多因素Cox回归分析筛选具有独立预后预测作用的R环特征基因

对WGCNA分析筛选出的78个与肺腺癌患者生存相关的基因进行LASSO回归筛选，以剔除共线性基因。LASSO回归系数随λ参数的变化趋势见附图7：随着λ值的增加，惩罚力度不断增大，模型中所有变量的回归系数会逐步压缩直到全部变为零。左侧虚线对应了最小均方误差时有14个系数不为零，保留14个基因变量并进行下一步分析（附图8）。Pearson相关性热图显示，RNA结合蛋白编码基因FXR1与微管驱动蛋白编码基因TPX2基因之间相关性最大（r=0.531，P<0.01），见附图9。结合临床变量的单因素分析结果（附表4），进一步行肺腺癌患者预后风险因素的多因素Cox回归分析，结果显示肺腺癌患者的预后与肿瘤分级和3种R环特征基因（HEXIM1、GLI2、PLEC）相关（P<0.05或P<0.01），见附图10。构建风险评分模型如下：风险评分=0.393×肿瘤分级+0.518×HEXIM1表达水平+0.516×GLI2表达水平+0.232×PLEC表达水平。

2.4. 评分模型对肺腺癌预后的预测能力及外部验证

将训练集中的病例按照风险评分中位数分为高风险组和低风险组，Kaplan-Meier生存曲线显示高风险组患者较低风险组患者预后差（P<0.01），见图3A。将风险评分按照从小到大排序并根据中位数分组，得到风险评分和生存结局的散点图，其中蓝色为存活，红色为死亡，从而可更直观地展示风险评分判断预后模型的结果（附图11）。此外，风险评分的时间依赖ROC曲线在1、3、5年各预测时间点的AUC值均在0.7以上（附图12），说明风险评分模型对各时间点的预后有较好的区分度。在GSE14814和GSE31210中验证结果显示，高风险组的生存时间均明显短于低风险组，且AUC值显示该预后模型对验证集的预后差异也有较好的区分度（均P<0.01），见图3B、C和附图11、12。

2.5. 肺腺癌患者预后预测列线图的构建及评估

以肿瘤分级和三个R环特征基因（HEXIM1、GLI2、PLEC）作为预测因子建立列线图如图4所示。内部验证结果显示，列线图预测模型的校正曲线与原始曲线及理想曲线接近，模型总体的C指数为0.729（0.679，0.779），模型拟合度较高（附图13）。基于验证集的外部验证结果与内部验证结果基本一致（附图14、15）。

2.6. R环特征基因的突变特征分析

采用maftools包分析三个R环特征基因遗传学突变，结果显示9%的肺腺癌患者携带PLEC突变，5%患者携带GLI2突变，1%患者携带HEXIM1突变（附图16）。其中，GLI2、PLEC和TP53呈现显著的共现性（附图17）。进一步比较上述三个基因在肺腺癌常见突变基因（TP53、KRAS、EGFR）突变肿瘤组织与非突变肿瘤组织之间的表达情况发现，GLI2在TP53突变和非突变肿瘤组织中的表达水平差异有统计学意义，PLEC在KRAS和EGFR突变和非突变肿瘤组织中的表达水平差异均有统计学意义（附图18）。进一步探索PLEC基因在各类肿瘤中的突变频率发现，相比其他肿瘤，PLEC在肺腺癌中的突变频率较高（附图19）。结果提示，PLEC可能是肺腺癌的一个重要风险因素。

2.7. R环特征基因与抗肿瘤药物敏感性预测

采用oncoPredict包计算高、低风险组对肺腺癌一线或二线化疗或靶向治疗药物的敏感性，结果显示，与低风险组比较，高风险组对五种药物（顺铂、紫杉醇、厄洛替尼、吉非替尼和吉西他滨）均有更高的IC₅₀值（图5），说明对这五种药物的耐药性更强，且HEXIM1、GLI2和PLEC三个基因的表达水平与药物耐药均呈现正相关性，其中PLEC与吉非替尼的正相关性最强（附图20）。结果提示，基于R环特征基因的评分模型可以用于预测患者对抗肿瘤药物治疗的敏感性，并进一步指导个体化药物的选择和临床决策。

2.8. PLEC基因沉默增强EGFR野生型非小细胞肺腺癌细胞对吉非替尼的敏感性

采用非小细胞肺腺癌细胞对PLEC基因表达产物Plectin的表达水平进行RNA干扰实验，结果靶向PLEC基因的小干扰RNA在两株细胞中成功实施了基因沉默（图6）。PLEC表达降低继续培养48 h后，两株细胞的细胞存活率分别降低20.3%和16.0%，说明细胞生长存活对PLEC基因有一定的依赖性。吉非替尼药物敏感性实验表明，抑制PLEC基因的表达能增强两株EGFR野生型非小细胞肺腺癌细胞株对吉非替尼的敏感性，其48 h的IC₅₀均降低到10 μmol/L以内（附图21），说明表达PLEC能抵抗吉非替尼的抗肿瘤活性。

3. 讨论

正常细胞通过直接清除RNA-DNA杂交链或耦合DNA修复机制减少R环的基因毒性，然而在多种肿瘤中发现了R环水平病理性升高的现象。越来越多证据表明，肿瘤细胞利用R环调控基因复制和转录促进肿瘤的演进及耐药性发展^［9］。因此，深入理解R环调控失衡的生物学机制对理解肿瘤基因组不稳定性至关重要。多个研究利用蛋白质组学技术解析了R环结构的结合蛋白质组，通过解析结合蛋白复合物中与临床预后相关的特征分子功能及生物学意义，为R环调控机制研究提供一定理论依据^［10］。

本研究通过公共数据库的RNA-seq数据，及其在肿瘤组织和正常组织的表达差异开展GSEA分析，发现表达异常的R环结合蛋白的功能属性，特别是RNA剪接蛋白编码基因在富集的Hallmarks通路中列于首位。R环中RNA-DNA杂交链的产生与转录机制密不可分，初生未成熟的mRNA链首先需要剪接加工后释放出成熟的mRNA。RNA剪接异常是R环积累的一个重要机制，因此RNA剪接蛋白是第一大类的R环结合蛋白。通过WGCNA、LASSO、多因素Cox回归分析逐一筛选，发现了肺腺癌中具有独立预后作用的3个R环特征基因，且均是肺腺癌的危险因素而非保护因素。其中，PLEC基因的抑制表达能增强两株EGFR野生型非小细胞肺腺癌细胞株对吉非替尼的敏感性，其48 h的IC₅₀均降低到10 μmol/L以内，说明PLEC的表达能抵抗吉非替尼的抗肿瘤活性。这种敏感性的改变可能来自于PLEC基因与吉非替尼的药物遗传学相互作用。吉非替尼是EGFR抑制剂，PLEC敲低能增强吉非替尼的抗肿瘤活性，EGFR和PLEC可能处于互相补偿的通路上，因此产生双杀的作用。

三个R环特征基因在肿瘤进展中的研究证据均有报道。HEXIM1是调控RNA转录加工过程的一个枢纽基因，其编码蛋白是一种RNA结合蛋白^［11］。HEXIM1通过与另一成员HEXIM2形成二聚体并与7SK小核RNA通过抑制正转录延伸因子b的激酶活性从而抑制转录延伸，在RNA聚合酶Ⅱ介导的RNA合成中起关键作用。研究显示，HEXIM1在前列腺癌中表达升高，并与前列腺癌的不良预后有关^［12］。GLI2是一种胶质瘤相关癌基因蛋白，是胶质瘤相关癌基因同源蛋白家族的一员，作为Krüppel样锌指转录因子，是Hedgehog信号通路末端的激活转录因子，在肿瘤进展中的作用及机制已有广泛报道。PLEC基因编码Plectin蛋白，后者作为一种细胞骨架交联蛋白广泛存在于皮肤和肌肉组织中，是肿瘤侵袭和转移的启动子。Plectin蛋白能从R环结合的蛋白复合物中检出，可见其功能远超于调控细胞的机械运动。研究发现，PLEC可以与同源重组修复蛋白BRCA2结合，导致有丝分裂期中心体微管的运动和定位异常，从而促进染色质异常分配和微核产生^［13］。综上所述，上述三个R环特征基因的功能均与负责维持基因组的完整性有关。然而，这三个基因与R环调控关系的直接证据均未见报道。鉴于筛选出的R环特征基因对预后的生物学意义，聚焦上述三个基因参与R环稳态调控的具体机制，对改善肿瘤预后具有一定的研究价值和研究意义。

本研究仍然存在一定局限性。本文基于极个别R环基因构建风险评分，无法代表R环的基因特征，未来可利用富集得到不同的信号通路或生物过程涉及的基因集合作为变量进行预后评估。其次，验证集GSE31210的AUC评分高于测试集，可能与数据不均衡有关。该列队中80%以上患者未观测到结局事件，以风险评分中位数作为分组标准时，患者死亡概率更倾向于高风险组，降低了该预测模型的准确性。今后将尝试收集更大的列队数据或其他肿瘤类型，进一步验证模型的预测效果。综上所述，本文结果进一步加深了我们对R环结合蛋白影响肺腺癌发展、预后以及抗肿瘤药物敏感性的理解，为挖掘R环结合蛋白调控R环稳态的生物学机制提供了一定的参考和依据。

Supplementary information

本文附图和附表见电子版。

［缩略语］

HUGO基因命名委员会（HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC）；癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）；基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）；差异倍数（fold change，FC）；基因本体（Gene Ontology，GO）；京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）；基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）；加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）；最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）；受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线）；网蛋白（plectin，PLEC）；抗癌药物敏感性基因组学数据库（Genomics of Drug Sensitivity in Cancer，GDSC）；干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）；细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）；脆性X相关基因（fragile X related gene，FXR）；环己二乙酰胺诱导蛋白（hexamethylene bis-acetamide inducible，HEXIM）；GLI家族锌指蛋白（GLI family zinc finger，GLI）；曲线下面积（area under the curve，AUC）；肿瘤蛋白53（tumor protein P53，TP53）；Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）；表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）；半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests