小分子组合诱导大鼠胚胎成纤维细胞重编程为功能性神经元

Abstract

Objective

To establish a methodological system for reprogramming rat embryonic fibroblasts (REF) into chemically induced neurons (ciNCs) via small molecule compounds to provide safe and effective donor cells for treatment of neurodegenerative diseases.

Methods

Based on the method established by PEI Gang’s research group to directly reprogram human fibroblasts into neurons, the induction medium and maturation medium was optimized by replacing the coating solution, mitigating oxidative stress injury, adding neurogenic protective factors, adjusting the concentration of trichothecenes, performing small-molecule removal experiments, and carrying out immunofluorescence and Western blotting on cells at different stages of induction to validate the effect of induction.

Results

When the original protocol was used for induction, the cell survival rate was (34.24±2.77)%. After replacing the coating solution gelatin with matrigel, the cell survival rate increased to (45.41±4.27)%; after adding melatonin, the cell survival rate increased to (67.95±5.61)% and (23.43±1.42)% were transformed into neural-like cells; after adding the small molecule P7C3-A20, the cell survival rate was further increased to (76.27±1.41)%, and (39.72±4.75)% of the cells were transformed into neural-like cells. When the concentration of trichothecene was increased to 30 μmol/L, the proportion of neural-like cells reached (55.79±1.90)%; after the removal of SP600125, (86.96±2.15)% of the cells survived, and the rate of neural-like cell production increased to (63.43±1.60)%. With the optimized protocol, REF could be successfully induced into ciNC through the neural precursor cell stage, in which the neural precursor cells were able to highly express the neural precursor cell markers SRY-related HMG-box gene 2 (Sox2) and paired box 6 (Pax6) as well as neuron-specific marker tubulin 1 (Tuj1), while the expression of fiber-associated protein vimentin was reduced. After two weeks of induction of neural precursor cells in a maturation medium, most cells displayed neuronal-like cell morphology. The induced ciNCs were able to highly express the mature neuronal surface markers Tuj1 and microtubule-associated protein 2 (MAP2), while the expression of vimentin was reduced.

Conclusion

The small molecule combinations optimized in this study can reprogram REF to ciNCs under normoxic conditions.

神经退行性疾病是困扰中老年群体的一类重要疾病，目前的治疗手段只能缓解症状而无法彻底治愈。近年来，细胞移植为神经退行性疾病的根治提供了可能。然而，如何获得安全有效的供体细胞一直是一个难题。

胚胎干细胞和诱导多能干细胞由于存在相关伦理和免疫原性问题，尚无法用于临床^［1］。近年来，有研究报道转录因子可将成纤维细胞重编程为诱导神经元^［2-3］，但由于效率低、实验复杂、成本高，再加上外源基因的导入可能会诱发肿瘤等缺点，限制了其应用^［4］。有研究发现，小分子化合物可以将不同类型的体细胞重编程为其他类型的功能性细胞^［5-9］，并具有较高的转化效率^［10-13］。小分子化合物不仅易于操作，安全高效，而且具有能精准控制细胞命运、反应迅速、特异性和可逆性等优点^［14］，已成为体细胞重编程的研究热点。本研究尝试利用不同小分子组合将REF重编程为功能性神经元，以期为细胞移植治疗神经退行性疾病提供潜在的细胞来源。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物

健康SD雌雄大鼠由杭州子源实验动物科技有限公司提供［许可证号：SCXK（浙）2019-0004］。大鼠在清洁级动物房中饲养，环境温度控制在25 ℃，雌雄受孕比例为1∶1，饲养密度为每盒5只及以下，自由活动。喂食商品化颗粒饲料，高温消毒饮水垫料，定期更换垫料。实验动物的使用和所有实验程序均通过蚌埠医科大学伦理委员会审查（伦动科批字〔2023〕第515号），实验操作按照我国《实验动物福利伦理审查指南（GB/T 35892—2018）》要求，规范落实实验动物福利伦理。

1.2. 主要试剂

DMEM高糖培养基、DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、非必需氨基酸、L-GlutaMAX、B27、0.25%含EDTA胰蛋白酶、胎牛血清、N2为美国Gibco公司产品；bFGF为美国R&D公司产品；丙戊酸、TritonX-100、兔源Olig2为美国Sigma公司产品；CHIR99021、RepSox、GO6983、Y-27632、SP600125、毛喉素、P7C3-A20、褪黑素、NT3、多索吗啡为美国Selleck公司（中国分公司）产品；BDNF、GDNF为美国Peprotech公司产品；驴血清、驴抗兔Cy3为美国Jackson Lab公司产品；驴抗鼠Alexa Fluor 488、CellTracker^TM CM-DiI Dye、抗荧光淬灭剂为美国Invitrogen公司产品；鼠源Tuj1（Ⅲ类β-微管蛋白）、鼠源神经上皮干细胞蛋白（nestin）、兔源Sox2、兔源Pax6抗体为美国Abcam公司产品；鼠源MAP2抗体为玻利维亚Santa Crµz公司产品；兔源GFAP、兔源波形蛋白抗体为博奥森生物技术有限公司产品；双抗为上海碧云天生物技术股份有限公司产品；多聚甲醛为山东西亚化学工业有限公司产品；BSA为北京索莱宝科技有限公司产品；PBS为美国HyClone公司产品。

优化前培养基配置：成纤维培养基为DMEM高糖培养基、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-GlutaMAX、1%双抗；诱导培养基（VCRFSGY组合）为DMEM/F12∶Neurobasal（1∶1）、0.5 mmol/L丙戊酸、3 μmol/L CHIR99021、1 μmol/L RepSox、10 μmol/L 毛喉素、10 μmol/L SP600125、5 μmol/L GO6983、5 μmol/L Y-27632、0.5% N2、1% B27、10 μmol/L cAMP、20 ng/mL bFGF、1%双抗；成熟培养基为DMEM/F12∶Neurobasal（1∶1）、3 μmol/L CHIR99021、10 μmol/L毛喉素、1 μmol/L多索吗啡、0.5% N2、1% B27、10 μmol/L cAMP、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL BDNF、20 ng/mL GDNF、20 ng/mL NT3、1%双抗；神经元培养基为DMEM/F12∶Neurobasal（1∶1）、0.5% N2、1% B27、20 ng/mL BDNF、20 ng/mL GDNF、20 ng/mL NT3、1%双抗^［15］。

1.3. REF原代分离培养

取孕16~18 d大鼠，颈椎脱位法处死，取出胎鼠，用剪刀剪去头部，并用镊子剔除其四肢、内脏及性腺等组织，取皮肤组织剪至1 mm²大小的组织块置于培养瓶底部，每瓶加入3 mL成纤维细胞培养基，倒置放入37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养6 h后，将培养瓶翻正继续培养。待细胞从组织块周围长出并达到一定密度后，将细胞消化重新铺瓶，之后每三天换液一次，细胞生长至80%~90%时，将部分细胞冻存备用，剩余继续培养。

1.4. 诱导REF重编程为ciNC

选用P3代以内状态良好的REF作为诱导起始细胞，按照1×10⁵个/孔的密度接种到预包被过的12孔板（或按1×10⁴个/孔的密度接种到24孔板）上，在37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养2~3 d，待细胞生长至80%~90%时更换含小分子诱导培养基培养5~7 d，诱导培养基每两天半量换液一次；期间密切观察并记录细胞形态学改变，根据培养效果及时调整；对各组多次诱导的明场图片中存活细胞数和神经样细胞数进行统计。每个实验重复四次，每次各组随机挑选1个视野计数。

诱导第一阶段结束后，更换成熟培养基继续诱导两周左右，成熟培养基每两天半量换液一次。两周后，更换神经元培养基继续培养，进一步促进其存活及成熟。

1.5. 免疫荧光法检测各阶段细胞标志物

选用生长状态良好的P3代以内的REF，接种于放有基质胶包被无菌玻片的24孔板中（1×10⁴个/孔），37 ℃、5%二氧化碳培养箱培养2~3 d，细胞生长至80%~90%时，选取细胞状态良好的无菌玻片，取出放入新的24孔板中，用4%多聚甲醛固定无菌玻片上的细胞18 min，用封闭液1（1×PBS、2% BSA、10%驴血清、0.2% TritonX-100）室温通透8 min后，再用封闭液2（1×PBS、2%BSA、驴血清）室温封闭50 min。将封闭液2用1×PBS润洗干净后，于4 ℃用一抗（鼠源Tuj1、鼠源神经上皮干细胞蛋白、兔源波形蛋白、兔源GFAP、兔源Olig2）对细胞进行孵育过夜。第二天，于黑暗环境下用与荧光二抗Alexa Fluor 488（1∶500）或Cy3（1∶1000）室温孵育1 h，之后用DAPI复染细胞核15 min，抗荧光淬灭剂封片；其余细胞更换含小分子的诱导培养基，每两天半量换液一次，诱导5~7 d后选取细胞生长状态良好的无菌玻片采用免疫荧光法检测Sox2、Pax6表达；其余更换含小分子的成熟培养基，每两天半量换液一次，两周后采用免疫荧光法检测Tuj1、MAP2表达。

1.6. 蛋白质印迹法检测ciNC中蛋白表达

收取REF、诱导第一阶段中间态细胞（Stage Ⅰ）和ciNC（Stage Ⅱ）三组细胞，分别加入混有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，利用超声破碎仪破碎后于冰上裂解30 min，冷冻离心机4 ℃、13 400×g离心25 min，收集上清液，进行蛋白定量。根据收集蛋白样品体积加入相应体积的蛋白上样缓冲液，于沸水中煮10 min变性，每组样品各取20 μg蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，用波形蛋白、Tuj1、Sox2、Pax6抗体孵育并与相应二抗结合，化学发光法检测抗原抗体结合区条带，分析各蛋白表达情况。

1.7. 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0生成相关统计图并进行统计分析，所有定量数据均以均值±标准差（ $\overline{x}$ ±s）表示。多组数据进行单因素方差分析，随后进行Dunnett’s t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. REF的鉴定

原代分离培养REF高表达成纤维细胞表面标志物波形蛋白，而不表达神经元标志物Tuj1、神经干细胞或神经前体细胞标志物神经上皮干细胞蛋白、星形胶质细胞表面标志物GFAP和少突胶质细胞表面标志物Olig2（图1）。提示原代REF未被神经相关细胞系污染，可以作为诱导起始细胞。

图1. 重编程起始细胞REF的免疫荧光法检测结果.

A：正常培养下原代分离培养的第一代REF呈梭状结构，标尺=200 μm；B：REF表面未表达星形胶质细胞表面标志物GFAP和少突胶质细胞表面标志物Olig2，标尺=50 μm；C：REF表面表达成纤维细胞表面标志物波形蛋白，未表达神经元表面标志物Tuj1和神经前体细胞表面标志物Nestin，标尺=50 μm. REF：大鼠胚胎成纤维细胞；DAPI：4$\mathrm{´}$，6-二脒基-2-苯基吲哚；GFAP：胶质纤维酸性蛋白；Olig：少突胶质细胞转录因子；Tuj：微管蛋白；Nestin：神经上皮干细胞蛋白.

2.2. 诱导体系的建立及优化

2.2.1. 包被液优化

实验初期，将REF接种至明胶包被的24孔板，2~3 d后采用含有小分子VCRFSGY组合的诱导培养基进行诱导，第一天可见部分细胞形态发生明显改变，并出现神经样细胞，但随着诱导时间的延长，在第一阶段后期细胞大量脱落死亡，仅有约1/3的细胞存活。考虑到神经元相较于REF黏附力降低，将包被液更换为基质胶，细胞存活率上升到（45.41±4.27）%，说明基质胶包被的孔板对诱导神经元的黏附效果要优于明胶，见图2、表1。

图2. 明胶、基质胶包被和不同小分子组合培养基培养下细胞生长情况免疫荧光检测结果.

基质胶包被的孔板对诱导过程中细胞的黏附效果略优于明胶；添加小分子褪黑素后神经样细胞数增加；添加P7C3-A20后神经样细胞数增加. 标尺=50 μm.

表1.

明胶、基质胶包被和不同小分子组合培养基培养下细胞存活率和神经样细胞生成率比较

包被液	培养基	细胞存活率	神经样细胞 生成率
明胶	VCRFSGY	34.24±2.77	6.99±0.94
基质胶	VCRFSGY	45.41±4.27**	11.18±0.67*
基质胶	VCRFSGY+褪黑素	67.95±5.61##	23.43±1.42##
基质胶	VCRFSGY+褪黑素+ISX-9	2.96±1.52△△	0.00±0.00△△
基质胶	VCRFSGY+褪黑素+P7C3-A20	76.27±1.41△	39.72±4.75△△

与明胶+VCRFSGY比较，^* P<0.05，^** P<0.01；与基质胶+VCRFSGY比较，^## P<0.01；与基质胶+VCRFSGY+褪黑素比较，^△ P<0.05，^△△ P<0.01. VCRFSGY为DMEM/F12∶Neurobasal（1∶1）、0.5 mmol/L丙戊酸、3 μmol/L CHIR99021、1 μmol/L RepSox、10 μmol/L 毛喉素、10 μmol/L SP600125、5 μmol/L GO6983、5 μmol/L Y-27632、0.5% N2、1% B27、10 μmol/L环磷酸腺苷酸、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、1%双抗.

%， $\overline{x}$ ±s，n=4

2.2.2. 针对氧化应激损伤的优化

考虑到在诱导过程中可能因氧化应激损伤而导致细胞死亡，将小分子褪黑素（10 μmol/L）添加至VCRFSGY组合（VCRFSGYM组合）中，发现添加褪黑素后细胞存活率提高至（67.95±5.61）%，并且细胞诱导效率也有所提升，（23.43±1.42）%转变为神经样细胞，见图2、表1。

2.2.3. 添加神经源性保护因子

分别将神经源性保护因子ISX-9（20 μmol/L）和P7C3-A20（3 μmol/L）添加到VCRFSGYM组合中。结果发现，添加ISX9的VCRFSGYM组合在第一阶段诱导前中期（1~4 d）与原组合诱导效果无明显差异，第一阶段后期（7~8 d）细胞仅（2.96±1.52）%存活。而添加小分子P7C3-A20的VCRFSGYM组合在第一阶段诱导后期细胞存活率有所提高，达到（76.27±1.41）%；同时，其对诱导细胞的形态转变也有一定的促进作用，（39.72±4.75）%细胞转变为神经样细胞，见图2、表1。因此，选择将小分子P7C3-A20添加到VCRFSGYM组合中，得到优化后的VCRFSGYMP组合。

2.2.4. 毛喉素浓度优化

结果显示，随毛喉素浓度升高，细胞存活率有所下降，而诱导效率有所上升。当毛喉素浓度为30 μmol/L时，细胞存活率为（65.22±6.34）%，较原浓度（10 μmol/L）下降幅度不明显；神经样细胞比例明显上升，达到（55.79±1.90）%。当毛喉素为40 μmol/L时虽然神经样细胞比例上升到（55.21±0.99）%，但细胞存活率却下降至（55.74±3.15）%。见图3、表2。故将30 μmol/L作为毛喉素的最终使用浓度。

图3. 加入不同浓度毛喉素后细胞生长情况.

毛喉素浓度低于30 μmol/L时，细胞存活率受影响较小；高于30 μmol/L时，细胞存活率有所下降. 毛喉素浓度为30、40 μmol/L时，神经样细胞数明显提升. 标尺=50 μm.

表2.

使用不同浓度毛喉素时诱导过程中细胞存活率和神经样细胞生成率比较

毛喉素（μmol/L）	n	细胞存活率	神经样细胞生成率
10	4	76.27±1.41	39.72±4.75
20	4	65.93±4.11	42.96±5.64
25	4	66.56±2.24	45.18±6.30
30	4	65.22±6.34	55.79±1.90*
35	4	55.42±6.72**	47.53±4.42
40	4	55.74±3.15**	55.21±0.99*
45	4	53.37±7.10**	26.58±7.79

与10 μmol/L毛喉素比较，^* P<0.05，^** P<0.01.

%， $\overline{x}$ ±s

2.2.5. 小分子去除实验结果

去除毛喉素后，诱导过程中细胞存活率有所降低，仅有（44.20±1.08）%细胞存活，且仍保持REF形态，神经样细胞比例下降至（5.99±2.69）%；去除GO6983，细胞存活率和神经样细胞数均有所降低；去除Y-27632，诱导前期细胞大量死亡，仅有（5.45±1.37）%细胞存活，且无神经样细胞产生；去除SP600125，诱导过程中细胞死亡率有所减少，（86.96±2.15）%细胞存活，且神经样细胞生成率也升高至（63.43±1.60）%以上。见图4、表3。

图4. 四种小分子去除对诱导细胞的影响.

去除毛喉素和GO6983后诱导过程中细胞存活率和神经样细胞数均明显下降；去除Y-27632后细胞大量死亡；去除SP600125后诱导过程中细胞死亡率有所下降，神经样细胞数明显增加. 标尺=50 μm.

表3.

分别去除各小分子后细胞存活率和神经样细胞生成率比较

培养基	n	细胞存活率	神经样细胞生成率
VCRFSGYMP	4	65.22±6.34	55.79±1.90
去除毛喉素	4	44.20±1.08**	5.99±2.69**
去除GO6983	4	55.17±5.25*	30.87±5.44**
去除Y-27632	4	5.45±1.37**	0.00±0.00**
去除SP600125	4	86.96±2.15**	63.43±1.60*

与VCRFSGYMP比较，^* P<0.05，^** P<0.01. VCRFSGYMP为DMEM/F12∶Neurobasal（1∶1）、0.5 mmol/L 丙戊酸、3 μmol/L CHIR99021、1 μmol/L Repsox、30 μmol/L毛喉素、10 μmol/L SP600125、5 μmol/L GO6983、5 μmol/L Y-27632、10 μmol/L褪黑素、3 μmol/L P7C3-A20、0.5% N2、1% B27、10 μmol/L环磷酸腺苷酸、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、1%双抗.

%， $\overline{x}$ ±s

根据上述研究结果，最终确定第一阶段诱导培养基为：DMEM/F12∶Neurobasal（1∶1）、0.5 mmol/L丙戊酸、3 μmol/L CHIR99021、1 μmol/L Repsox、30 μmol/L毛喉素、5 μmol/L GO6983、5 μmol/L Y-27632、10 μmol/L褪黑素、3 μmol/L P7C3-A20、0.5% N2、1% B27、10 μmol/L cAMP、20 ng/mL bFGF、1%双抗。由于P7C3-A20能有效减少神经元死亡，故将其添加至第二阶段成熟培养基中，得到成熟培养基为：DMEM/F12∶Neurobasal（1∶1）、3 μmol/L CHIR99021、30 μmol/L毛喉素、3 μmol/L P7C3-A20、1 μmol/L多索吗啡、0.5% N-2、1% B-27、10 μmol/L cAMP、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL BDNF、20 ng/mL GDNF、20 ng/mL NT3、1%双抗，可成功将REF重编程为ciNC，并且具有较高的神经样细胞生成率（图5）。

图5. 不同阶段细胞状态镜下所见.

确定诱导组合后细胞生长不同阶段形态，大鼠胚胎成纤维细胞呈梭状结构；诱导第一阶段部分细胞转变为神经样形态，并形成神经突起，与周围细胞发生联系；第二阶段大部分大鼠胚胎成纤维细胞转变为神经样细胞，并形成神经突起，与周围细胞发生联系. 标尺=50 μm. REF：大鼠胚胎成纤维细胞；ciNC：化学诱导神经元.

2.3. 重编程细胞特征鉴定

免疫荧光检测结果表明，中间态细胞能够高表达神经前体细胞标志物Sox2和Pax6，具有典型的神经前体细胞特征（图6A）。蛋白质印迹法检测结果显示，与REF比较，中间态细胞中多潜能转录因子Sox2、Pax6与神经元特异性标志物Tuj1的表达量显著增加，与神经前体细胞具有明显的相似性，同时成纤维相关蛋白波形蛋白表达量有所减少（图7）。提示REF在诱导重编程为ciNC过程中经过神经前体细胞阶段。

图6. 大鼠胚胎成纤维细胞诱导为化学诱导神经元过程中各阶段细胞标志物表达免疫荧光法检测结果.

A：中间态细胞高表达神经前体细胞系标志物Sox2、Pax6；B：ciNC高表达成熟神经元标志物MAP2、Tuj1. 标尺=20 μm. DAPI：4$\mathrm{´}$，6-二脒基-2-苯基吲哚；Sox：SRY-box转录因子；Pax：配对框；MAP：微管相关蛋白；Tuj：微管蛋白.

图7. 大鼠胚胎成纤维细胞诱导为化学诱导神经元过程中各阶段细胞标志物表达蛋白电泳图.

REF：大鼠胚胎成纤维细胞；ciNC：化学诱导神经元；Sox：SRY-box转录因子；Pax：配对框；Tuj：微管蛋白；actin：肌动蛋白.

中间态细胞在成熟培养基中诱导两周后，可见大部分细胞出现明显的神经样细胞形态。免疫荧光结果显示，ciNC高表达成熟神经元表面标志物Tuj1和MAP2（图6B）。蛋白质印迹法结果显示，相较于REF，ciNC中成纤维相关蛋白波形蛋白表达减少，神经元相关蛋白Tuj1表达显著增加；相较于中间态细胞，ciNC中Sox2、Pax6表达量显著减少（图7）。结果提示，利用小分子组合经过神经前体细胞阶段成功将REF诱导为ciNC。

3. 讨论

近十年来，小分子化合物被广泛应用于重编程和转分化领域，其不仅可以提高重编程效率，取代部分外源基因，甚至能单独诱导细胞命运转换，在体细胞重编程中扮演着重要角色^［16］。2013年，邓宏魁团队通过使用VC6TFZ组合（丙戊酸、CHIR99021、616452、反苯环丙胺、毛喉素、DZNep）重新赋予体细胞“多潜能性”，命名为“化合物诱导性多能干细胞”^［5］。2015年，裴钢研究团队应用小分子化合物组合VCRFSGY（丙戊酸、CHIR99021、RepSox、毛喉素、SP600125、GO6983、Y-27632）将健康者与阿尔茨海默病患者成纤维细胞直接重编程为人ciNC，后者具有类似人神经元的电生理特性及表达谱特征^［15］。Ma等^［17］利用化学小分子成功将星形胶质细胞重编程为功能神经元。前期研究发现，小分子化合物（丙戊酸、CHIR99021和RepSox）在含5%氧气的生理低氧条件下，可将成纤维细胞重编程为神经前体细胞，定向移植至帕金森病大鼠黑质-纹状体后，可分化为多种功能神经元，并与宿主细胞发生突触联系从而发挥神经修复作用^［18-19］。

在上述研究的基础上，本文资料优化了诱导流程和小分子毛喉素的浓度，去除了小分子SP600125，添加P7C3-A20和褪黑素，减少了细胞在诱导过程中的死亡，并提高了REF重编程为神经元的效率。结果显示，小分子VCRFGYMP组合可以将已分化的REF重编程为ciNC，并具有较高的诱导效率，成功使REF转变为功能性神经元。

SP600125是一种高选择性的JNK抑制剂。有研究报道，JNK1、JNK2可以抑制KLF4活性，从而抑制重编程过程，因此使用SP600125抑制JNK可以增加胚胎干细胞的自我更新，并可能有助于细胞重编程^［20］。本文资料中，去除SP600125后细胞存活率和神经样细胞数反而有所增加，表明在该诱导体系中相较于其有助细胞重编程的作用，细胞毒性可能更为突出，具体机制还需进一步研究。

毛喉素是一种从毛喉鞘蕊花中提取出的植物化合物，被广泛用于医药和生物学研究领域^［21］。毛喉素作为一种腺苷酸环化酶的激活剂，可以促进细胞内cAMP的产生^［22-23］。cAMP是一种重要的第二信使，在细胞调控多种生物学过程中发挥着关键作用，包括细胞增殖、分化和再编程等。同时，细胞内cAMP水平的增加也可以增加PKA/CREB1的表达，从而抑制细胞凋亡信号传导途径，如JNK信号传导途径，有益于神经元的存活^［24-25］。神经元的再生和修复对于治疗神经系统疾病和损伤具有重要意义。研究表明，毛喉素可以促进神经干细胞的增殖和分化，从而增加新生神经元的生成。此外，毛喉素还可以促进神经元突触形成和轴突生长，有助于神经元之间的连接和信息传递^［26］。毛喉素在细胞重编程中的作用机制主要包括通过激活cAMP信号通路调节细胞内转录因子的表达和活性，影响细胞的基因表达模式和功能，进而影响细胞的重编程能力。因此，毛喉素可能作为一种潜在的神经保护剂和神经修复促进剂，为神经系统疾病治疗提供新的策略。本文资料中，神经样细胞的生成效率在一定程度上随毛喉素浓度升高而增加，表明毛喉素在体细胞向神经元的分化过程中发挥着重要作用，并具有一定的剂量依赖性，但过高的浓度会抑制神经元的存活。

褪黑素是一种由松果体产生的脂水双溶性神经激素，参与多种生理活动，包括防止神经毒性物质诱导的神经元死亡^［27］、清除羟基自由基和过氧自由基^［28-29］、调节神经免疫活动等^［30-31］，从而减少体细胞重编程过程中神经元死亡。同时，褪黑激素具有调控胚胎脑组织神经干细胞的功能，包括神经干细胞的增殖和分化^［32-33］。因此，其在细胞重编程过程中表现出增加重编程效率的功效^{［31， 34］}。褪黑素还与细胞外信号磷酸激酶水平的调节有关，以增殖和分化为导向调控转录因子的基因表达^［35］。本文资料通过添加褪黑素可有效减少重编程过程中细胞死亡，提高重编程效率，究其原因可能是其通过清除自由基而降低了细胞因氧化应激损伤导致的死亡，但具体机制还需进一步验证。

P7C3类药物具有广泛的神经保护作用^［39］，可以促进海马神经发生。有研究表明，该类药物及其衍生物能够抑制神经元的死亡，促进未成熟神经元的存活^［37-38］。P7C3-A20作为其衍生物的一种，能够通过激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路抑制神经元的凋亡，从而发挥神经保护作用^［39］。研究表明，P7C3-A20能够保护酪氨酸羟化酶阳性细胞免受MPTP相关毒性^［40-41］；并且在缺血性卒中和神经退行性疾病等多种疾病中发挥神经保护作用^［42］。同时，在缺血性脑损伤模型中，P7C3-A20可以促进海马侧脑室室下区和齿状回颗粒下区的神经发生^［43］。本文资料也显示，通过添加P7C3-A20可以有效提高诱导细胞存活率，促进诱导细胞向神经样细胞的转化，提高神经元生成效率。

综上所述，本文资料利用八种小分子化合物通过两步诱导法成功将REF重编程为ciNC，为体细胞重编程为功能性神经元探索一种可行的方法；同时初步探究了重要小分子在体细胞重编程为神经元过程的作用，为相关研究提供了可以借鉴的经验，但其中作用机制还需进一步深入研究。

［缩略语］

大鼠胚胎成纤维细胞（rat embryonic fibroblasts，REF）；碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）；少突胶质细胞转录因子（oligoden-drocyte transcription factor，Olig）；脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）；胶质细胞源性神经营养因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）；微管蛋白（tubulin，Tuj）；SRY-box转录因子（SRY-related HMG-box gene，Sox）；配对框（paired box，Pax）；微管相关蛋白（microtubule-associated protein，MAP）；胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）；环磷酸腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）；化学诱导神经元（chemically induced neurons，ciNC）；4 $\mathrm{´}$ ，6-二脒基-2-苯基吲哚（4 $\mathrm{´}$ ，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）；异噁唑（isoxazole，ISX）；c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）；Kruppel样因子（Krüppel-like factor，KLF）；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1， 2， 3， 6-tetrahy-dropyridine，MPTP）

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests