Diagnostic et Évaluation de la Réponse Thérapeutique de la Leucémie Myéloïde Chronique au Mali par l’Hybridation in situ Fluorescente

Abstract

Objective.

Chronic myeloid leukemia (CML) is a hematologic malignancy characterized by the presence of the Philadelphia chromosome or its molecular equivalent, the BCR/ABL1 fusion gene. Diagnosis and monitoring of CML are done by detecting this chromosome, the BCR/ABL1 gene, or the BCR/ABL1 transcript. In Mali, genetic tools of diagnosis and follow-up are still lacking, so we did this study with the objectives of developing the FISH technique to diagnose, to follow up, and to characterize the cytogenetic profile of CML patients.

Methods.

We carried out FISH technique by using the dual color dual fusion probe for BCR/ABL1 on interphase nuclei and metaphases. Slides were scanned with an epifluorescence microscope.

Results.

A total of 25 patients (16 for diagnostic and 9 for follow-up) were included. We achieved a 92% success rate for obtaining metaphases. The BCR/ABL1 gene fusion signal was present in 22 patients. Among those 22 patients, 16 presented a typical signal pattern and 6 presented atypical signal patterns.

Conclusion.

We set up the FISH technique in Mali for the diagnosis and the follow-up of CML patients and identified atypical translocation of t(9;22).

INTRODUCTION

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne caractérisée par une prolifération anormale des cellules souches hématopoïétiques et la présence du chromosome Philadelphie (Ph+) issu de la translocation entre les chromosomes 9 et 22. Cette translocation entraine la fusion des gènes BCR et ABL1 qui donne une protéine chimérique BCR/ABL1 (1). Au Mali, une enquête épidémiologique sur les hémopathies malignes, sur une durée de 8 ans, a retrouvé que la LMC occupe 16,67% des hémopathies malignes et 42,3% des leucémies (2).

Le diagnostic et l’évaluation de la réponse thérapeutique de la LMC reposent sur des signes cliniques, biologiques et l’identification du chromosome Philadelphie (Ph+) ou du gène de fusion BCR/ABL1 par les techniques de cytogénétique conventionnelle (caryotype) et/ou moléculaire (FISH ou PCR).

Bien vrai qu’une étude pilote a été menée au Mali sur le diagnostic cytogénétique de la LMC au Mali (3), actuellement, il n’existe pas de test génétique permettant de diagnostiquer ou d’évaluer la réponse thérapeutique des patients atteints de la LMC au Mali, d’où l’intérêt de cette étude. Les objectifs de ce présent travail sont de développer la technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour le diagnostic et l’évaluation de la réponse thérapeutique et de déterminer le profil cytogénétique de réarrangements du gène de fusion BCR/ABL1 chez les patients souffrant de la LMC.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Nous avons mené une étude prospective et descriptive, allant du 1^er novembre 2018 au 31 août 2019, pour valider la technique FISH enfin de diagnostiquer et d’évaluer la réponse thérapeutique (traitement à base d’Imatinib Mesylate) de la LMC au Mali. Les patients ont été référés par les services d’hématologie ou d’oncologie des Hôpitaux du Point G, du Gabriel Touré et de Mère-Enfant « Le Luxembourg ». L’analyse cytogénétique des échantillons a été faite dans le Service de Cytogénétique et de Biologie de la Reproduction de l’Institut National de Santé Publique (INSP), l’évaluation microscopique et l’analyse des données ont été effectuées dans le laboratoire de la Neuroscience de la Faculté de Médecine et d’Odontostomatologie.

Nous avons inclus tous les patients référés au Service de Cytogénétique et de Biologie de la Reproduction de l’INSP pour la FISH de ABL1/BCR. Les patients chez lesquels la technique FISH n’a pas pu être réalisée ont été exclus de l’étude. Nous avons obtenu le consentement de tous les patients inclus dans cette étude.

Quatre millilitres de sang périphérique ou de la moelle osseuse ont été prélevés dans un tube à héparine chez chaque patient. Cinq cents microlitres de ce prélèvement ont été mis en culture dans 5 mL de milieu de culture MarrowMAX (Thermo Fisher, USA) et incuber dans un environnement de 5% CO₂ à 37°C pendant 24 heures. Après une culture cellulaire de 24 heures, la récolte des chromosomes a été faite selon le protocole standard de récolte des cellules leucémiques (4). Ensuite, les chromosomes ont été étalés sur des lames qui ont été vieillies à 37°C pendant 24 heures. Par la suite, les lames ont été prétraitées avec la solution tampon de 1X TBS (Tris: 20 mM et NaCl: 150 mM), puis déshydratées avec de l’éthanol à 80%, 90% et 100%. Une solution d’hybridation de 10 μL contenant 1μL de la sonde BCR/ABL1 double fusion double couleur de Vysis (Abbott, USA) et 9 μL de tampon d’hybridation a été appliquée sur les lames. La dénaturation a été faite à 78°C pendant 5 minutes et l’hybridation à 37°C pendant 24 heures. Enfin, les lames ont été lavées dans une solution de 1X TBS/0.05% Tween 20 et contre colorées avec du DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole).

L’observation des lames et la capture des images ont été effectuées avec un microscopique à épifluorescence Axio Imager 2 (Zeiss, USA) dotée du système de capture et de traitement d’images ISIS de Metasystems (Metasystem, USA). Pour chaque échantillon, 200 noyaux interphasiques et 20 métaphases lorsqu’elles ont pu être obtenues, ont été analysés. La sonde BCR/ABL1 est composée de deux types de sondes marquées par des fluorochromes différents: la sonde ABL1 qui colore le gène ABL1 situé sur le chromosome 9 en rouge (R) et la sonde BCR qui colore le gène BCR situé sur le chromosome 22 en vert (V). Ainsi, les gènes ABL1 et BCR sont identifiés à l’observation microscopique grâce à la présence de signaux rouges et verts, respectivement. La présence d’une fusion BCR/ABL1 est observée lorsqu’il y a une co-localisation des signaux vert et rouge, appelée signal de fusion (F).

Nous avons interprété les patrons de signaux en fonction des instructions fournies par Abbott et Primo D et al. (5,6). L’interprétation des signaux a été faite de la manière suivante: 2R2V pour les cellules ne présentant pas de translocation, les signaux 1R1V2F pour les cellules leucémiques présentant un patron de signaux typique, et les autres patrons de signaux ont été considérés comme des signaux atypiques de cellules leucémiques.

Le sexe, l’âge, le pourcentage des cellules interphasiques et/ou des métaphases et la caractérisation des différents patrons de signaux observés étaient les principales variables étudiées.

La confidentialité des données a été garantie et nous ne notons aucun conflit d’intérêts.

RÉSULTATS

Durant les 9 mois d’étude, nous avons inclus 25 patients dont 16 pour diagnostic et 9 pour évaluation de la réponse thérapeutique. Les hommes étaient légèrement moins représentés que les femmes avec un sex-ratio de 0,92 (Figure 1).

Figure 1 :

Répartition des patients en fonction du sexe

L’âge moyen des patients était de 33,48 ans (extrêmes de 15 à 53 ans). La tranche d’âge de 35 à 49 ans était la plus représentée au moment du diagnostic, soit 62,5% des 25 patients (Tableau I).

Tableau I :

Répartition des patients en fonction de l’âge

Tranches	Patients		Total
d’âge (ans)	Diagnostic	Évaluation
Moins 20	1	2	3
20–34	4	7	11
35–49	9	-	9
50 et plus	2	-	2
Total	16	9	25

La culture cellulaire a permis d’obtenir des métaphases chez 23 patients, soit 92% de la population d’étude. La technique FISH a été réalisée chez l’ensemble des patients. Nous avons noté la présence du réarrangement BCR/ABL1 chez tous les 16 patients référés pour le test de diagnostic et 6 des 9 patients pour l’évaluation de la réponse thérapeutique (Tableau II).

Tableau II:

Répartition des patients selon les réarrangements ABL1/BCR

Réarrangements		Patients		Total
ABL1/BCR		Diagnostic	Évaluation
Présence	Typique	13	3	16
	Atypique	3	3	6
Absence		0	3	3
Total		16	9	25

Les patients en évaluation thérapeutique qui ne présentaient pas de réarrangement BCR/ABL1 (3 patients) étaient considérés comme étant en rémission cytogénétique complète c’est-à-dire ces patients ne présentaient pas de cellules leucémiques selon la technique FISH (Figure 2). Les 6 autres patients en évaluation thérapeutique chez lesquels les cellules avaient le réarrangement BCR/ABL1 (cellules leucémiques) étaient en rémission cytogénétique partielle ou présentaient une absence de réponse thérapeutique cytogénétiquement.

Figure 2 :

Présentation des patrons des signaux des loci ABL1 et BCR Les images A) et B) représentent, respectivement, une métaphase et un noyau interphasique qui ne montent pas de fusion ABL1/BCR (2R2V). Ces images proviennent de deux cellules normales d’un individu en rémission cytogénétique complète. Les images C) et D) représentent une métaphase et un noyau interphasique, respectivement, dans lesquels on retrouve un parton de signaux typique (1R1V2F). Ces images sont celles de deux cellules leucémiques d’un même individu. Les images E) et F) représentent, respectivement une métaphase et un noyau interphasique qui montrent un patron de signaux atypiques (2R1V1F). Ces images proviennent de deux cellules leucémiques d’un même individu. Les flèches indiquent le chromosome Philadelphie sur les métaphases et les signaux de fusion ABL1/BCR dans les noyaux interphasiques.

Nous avons retrouvé des signaux atypiques de la translocation t (9; 22) dans les échantillons de 6 patients sur les 25, soit 24% de la population d’étude (Tableau II et Figure 2). Parmi ces patients, trois étaient en évaluation thérapeutique et ceux-ci ont présenté le même patron de signaux atypiques.

En outre, nous avons retrouvé chez un patient référé pour évaluation thérapeutique la présence de clones en fonction de la translocation t(9; 22). En effet, ce patient a présenté des patrons de signaux correspondant à des cellules normales (6,5% des cellules), le patron de signaux typiques de la translocation t(9; 22) (81,5% des cellules) et un patron de signaux atypiques de la translocation t(9; 22) (12% des cellules).

DISCUSSION

Cette étude a porté sur une population de 25 patients dont 16 référés pour diagnostic et 9 pour évaluation réponse thérapeutique de l’Imatinib Mesylate. Le petit nombre de patients dans cette cohorte d’étude s’expliquerait par le fait que la LMC est une maladie rare avec une incidence annuelle estimée à 1–1,5 cas pour 100000 habitants (7,8), mais aussi le manque d’accès des patients aux spécialistes pouvant établir le diagnostic clinique. A noter que tous les spécialistes en hémato-oncologie sont concentrés à Bamako qui a été le site d’enrôlement de l’étude.

L’âge moyen des patients était de 33,48 ans alors qu’en occident, il varie entre 55–60 ans (9–12). Certaines données Africaines et du Moyen Orient aussi supportent une tendance plus jeune de patients atteints de LMC avec un âge médian inférieur à 40 ans au moment du diagnostic (13). L’espérance de vie basse dans nos contrées pourrait en partie expliquer la fréquence élevée de la LMC dans une population relativement plus jeune que celle de l’occident. En outre d’autres facteurs tels que génétiques ou environnementaux doivent être rechercher pour mieux expliquer l’apparition précoce de la LMC au Mali.

Après la culture cellulaire, nous avons pu obtenir des métaphases analysables dans la plupart des échantillons. Les deux échantillons dans lesquelles la culture cellulaire n’a pas permis d’obtenir des métaphases s’expliquent par le fait que ses patients étaient sous un traitement qui inhiberait la prolifération cellulaire in vitro. La réalisation de la technique FISH BCR/ABL1 sur des métaphases a l’avantage de mieux décrire les différents types de signaux observés, leurs localisations sur les chromosomes, et le type et le nombre de chromosome incriminés dans les réarrangements des loci BCR/ABL1 (14–16).

Les cellules leucémiques que nous avons observées présentaient des patrons de signaux typiques ou atypiques. Le patron de signal typique résulte du réarrangement ABL1/BCR à partir des points de cassures communs aux deux loci ABL1 et BCR (5) alors que plusieurs mécanismes conquerraient à l’émergence des patrons de signaux atypiques (5,17). Nous avons décelé des patrons de signaux atypiques chez un quart des patients, une proportion proche à celle de l’étude de Dewald et al. dont les patients présentant les patrons de signaux atypiques étaient 19% de la population d’étude (18). Les patients référés pour une évaluation de la réponse thérapeutique et qui présentaient un même patron de signaux atypiques n’étaient pas en rémission cytogénétique complète, indicateur précoce d’un échec thérapeutique. En effet, il a été démontré que les signaux atypiques sont associés à une résistance thérapeutique à l’Imatinib Mesylate (19,20). Nous avons aussi observé des signaux atypiques lors du diagnostic, et leur présence serait indicative d’une éventuelle une résistance primaire à l’Imatinib Mesylate (19,21). L’analyse FISH, en plus d’être extrêmement simple et rapide, est très informative et complémentaire au caryotype pour une évaluation cytogénétique complète de la LMC.

CONCLUSION

Nous avons établi la technique FISH pour le diagnostic et l’évaluation de la réponse thérapeutique de la LMC au Mali. Ensuite, nous avons observé des signaux atypiques de la translocation BCR/ABL1 qui pourraient être associés à une résistance thérapeutique primaire et/ou secondaire à l’Imatinib Mesylate. Il est donc crucial de mener d’autres études sur des cohortes plus larges pour mieux évaluer l’impact des patrons de signaux atypiques de la translocation t(9;22).