Abstract
目的
基于网络药理学探讨清心解瘀颗粒（QXJYG）抗动脉粥样硬化（AS）的药效学及其调控机制。
方法
通过网络药理学挖掘QXJYG抗AS的关键靶点和信号通路。采用高脂喂养合并腹腔注射维生素D3的方式构建AS大鼠模型，将造模成功后的30只大鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组（13.15 mg·kg-1·d-1）、低剂量组（0.99 g·kg-1·d-1）、中剂量组（1.98 g·kg-1·d-1）、高剂量组（3.96 g·kg-1·d-1），每组6只；另外将6只SD大鼠给予正常饮食作为对照组。实验动物干预8周后，通过小动物超声检测大鼠腹主动脉血管内径、血管壁厚度、脉冲波传播速度、搏动指数，通过HE染色检测大鼠腹主动脉病理形态，通过全自动生化仪检测每组大鼠的血脂水平，通过ELISA检测试剂盒测定血清中AngⅡ、ET-1、TXA2、PGI2、ox-LDL含量。采用免疫组化法检测大鼠腹主动脉中LOX-1、PPARγ、RXRα、p-P65、VCAM-1、ICAM-1蛋白的表达。
结果
与正常组相比，模型组的腹主动脉血管壁厚度、脉冲波传播速度、搏动指数升高（P<0.05），血管内径减小（P<0.05），且平滑肌细胞增生、排列紊乱，TC、LDL-C、AngⅡ、ET-1、TXA2含量显著升高（P<0.05），HDL-C、PGI2含量显著下降（P<0.05）。与模型组相比，QXJYG和阿托伐他汀干预后，显著降低腹主动脉血管壁厚度、脉冲波传播速度、搏动指数（P<0.05），增大血管内径（P<0.05），减轻平滑肌细胞排列紊乱情况，显著降低TC、LDL-C，AngⅡ、ET-1、TXA2（P<0.05），显著升高HDL-C、PGI2含量（P<0.05），通过网络药理学预测发现QXJYG可能通过调控脂质，PPAR和NF-κB等信号通路发挥抗AS的作用。与正常组相比，模型组的ox-LDL含量、LOX-1、p-P65、VCAM-1、ICAM-1蛋白表达水平显著升高（P<0.05），PPARγ、RXRα蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与模型组相比，QXJYG干预后，ox-LDL含量、LOX-1、p-P65、VCAM-1、ICAM-1蛋白表达水平显著降低（P<0.05），PPARγ、RXRα表达显著升高（P<0.05）。
结论
QXJYG显著改善AS大鼠脂代谢紊乱，扩大腹主动脉血管内径，减小腹主动脉血管壁厚度，抑制腹主动脉血管病理损伤，调节血管收缩和舒张功能。QXJYG发挥抗AS的作用机制可能是抑制血脂中ox-LDL水平，降低LOX-1的表达，激活PPARγ、RXRα蛋白，抑制P65的磷酸化，从而降低VCAM-1、ICAM-1蛋白表达。
Keywords: 清心解瘀颗粒, 动脉粥样硬化, 网络药理学, PPARγ/RXRα信号通路, NF-κB信号通路
Abstract
Objective
To elucidate the therapeutic mechanism of Qingxin Jieyu Granule (QXJYG) against atherosclerosis (AS) based on network pharmacology.
Methods
The major targets and pathways of QXJYG against AS were analyzed using network pharmacology. Rat models of AS established by high-fat feeding combined with intraperitoneal vitamin D3 injection were treated daily with normal saline, atorvastatin (13.15 mg/kg), or QXJYG at 0.99, 1.98, and 3.96 g/kg for 8 weeks (n=6). Ultrasound and HE staining were used to assess the function and pathologies of the abdominal aorta. Blood lipids and serum levels of Ang II, ET-1, TXA2, PGI2, and ox-LDL of the rats were detected using an automatic biochemical analyzer or ELISA. The expressions of LOX-1, PPARγ, RXRα, p-P65, VCAM-1 and ICAM-1 in the abdominal aorta were detected with immunohistochemistry.
Results
The rat models of AS showed obvious abdominal aorta wall thickening, increased pulse wave velocity and pulse index, decreased inner diameter of the abdominal aorta, elevated levels of TC, LDL-C, Ang II, ET-1 and TXA2, and lowered levels of HDL-C and PGI2. QXJYG and atorvastatin treatment of the rat models significantly alleviated histopathological changes of the abdominal aorta, decreased serum levels of TC, LDL-C, Ang II, ET-1 and TXA2, and increased the levels of HDL-C and PGI2. Network pharmacology study suggested the therapeutic effect of QXJYG against AS was mediated by regulating lipid metabolism, PPAR and NF‑κB pathways. Consistently, treatments with QXJYG were found to significantly decrease ox-LDL level and LOX-1, P-P65, VCAM-1 and ICAM-1 protein expressions while increasing PPARγ and RXRα expressions in the aorta of AS rats.
Conclusion
QXJYG alleviates lipid metabolism disorder and improves histopathological changes of the abdominal aorta of AS rats possibly by lowering ox-LDL level, reducing LOX-1 expression, activating PPARγ and RXRα, and inhibiting P65 phosphorylation to reduce VCAM-1 and ICAM-1 expression in the aorta.
Keywords: Qingxin Jieyu Granule, atherosclerosis, network pharmacology, PPARγ/RXRα signaling pathway, NF-κB signaling pathway
心血管病引起死亡的人数占全球死亡人数的1/3，我国就有超过3.3亿的心血管病患者，动脉粥样硬化（AS）是心血管疾病的重要原因之一［1］。我国AS发病率逐年上升，且AS发病人群也呈现年轻化的态势［2］。AS是由于动脉血管壁变厚，血管的管腔狭窄，血管弹性减小及血糖、血脂代谢障碍，血小板功能不正常等病理性改变所致［3］。研究发现 ［4-6］，在缺血、药物、吸烟、糖尿病、高血压等一些诱导因素的作用下，低密度脂蛋白（LDL-C）进入血管被氧化修饰成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），后与凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体（LOX-1）结合，能抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、视黄酸X受体α（RXRα）的表达，进一步激活核因子κB（NF-κB）信号通路，从而促进血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达，造成血管损伤。因此，通过减轻脂质代谢紊乱，改善血管损伤，能有效抗AS。
现代医学提倡中西医结合，既往研究［7-9］表明中药及其复方能够通过调节脂质代谢，减轻血管内皮细胞损伤，改善炎症反应，调节肠道微生物及其代谢物等发挥抗AS的作用。因此，发挥中医药多靶点、多途径协调作用的优势，拓宽AS用药十分重要。清心解瘀颗粒（QXJYG）由国医大师陈可冀院士的临床经验方愈梗通瘀汤精简化裁而来［10］，由黄芪、丹参、川芎、广藿香、黄连五味药组成。前期研究表明，QXJYG能通过调控巨噬细胞焦亡及铁死亡，重塑肠道菌群，稳定AS易损斑块［11-15］，但其能否通过抑制脂质代谢紊乱，减轻血管损伤，改善AS尚未明确。本课题采用高脂喂养合并腹腔注射维生素D3的方式构建AS大鼠模型，初步验证QXJYG抗AS的药效。利用网络药理学技术，预测QXJYG抗AS的作用机制，并利用免疫组化等技术进行进一步验证其是否通过调控脂质代谢等相关途径发挥作用，为清心解瘀颗粒抗AS的临床应用提供实验依据。
1. 材料和方法
1.1. 实验材料
1.1.1. 药物与主要试剂
高脂饲料（Research Diets）；维生素D3（APEx BIO）；清心解瘀颗粒（天江药业）；阿托伐他汀钙片（立普妥，辉瑞制药）；苏木素、伊红染液（索莱宝）；血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、内皮素1（ET-1）、血栓素2（TXA2）、前列环素2（PGI2）、ox-LDL的ELISA试剂盒（云克隆科技）；即用型免疫组化试剂盒、PBS 磷酸盐缓冲液、粉剂抗原修复液（迈新生物）；DAB显色试剂盒（索莱宝）；LOX-1、PPARγ抗体（Signal way Antibody）；RXRα、VCAM-1、ICAM-1抗体（三鹰生物）；p-P65抗体（Cell Signaling Technology）。
1.1.2. 实验动物
36只雄性SD大鼠（250~300 g，6~8周龄），购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于福建中医药大学动物实验中心二楼SPF级动物房。动物房温度是20.8~24.3 ℃，白天温差小于4 ℃，相对湿度在47.2%~67.2%，换气次数大于15次/h，12 h∶12h的光明时间和黑暗时间，明暗交替，实验动物自由饮食，2~3 d/次换垫料。动物实验得到了福建中医药大学动物管理和使用委员会的批准，通过伦理委员会的审核（伦理批号：2022078）。全部实验操作程序严格按照中国《关于善待实验动物的指导性意见》进行。
1.1.3. 主要仪器
高速低温离心机、低温冰箱、酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；全自动血清生化仪（日立）；超高分辨率小动物超声影像系统（Vevo2100，Visual Sonics）；全自动石蜡切片机、DFC295光学显微镜、DM6000B显微镜、DM4000B显微镜（Leica）。
1.2. 实验方法
1.2.1. 清心解瘀颗粒抗动脉粥样硬化的网络药理学分析
运用中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）搜索黄连、黄芪、丹参、川芎、广藿香5味药各自的化合物。筛选条件设作口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18。把筛选获得的化合物导到TCMSP数据库，检索各化合物的对应靶点，用Unitprot数据库，将靶点转化成对应基因名，设置基因来源为人源。在GeneCards、OMIM和TTD数据库检索动脉粥样硬化的疾病靶点，去除重复项后获得对应靶点，并通过Venny绘图网站将清心解瘀颗粒各活性成分的作用靶点与动脉粥样硬化疾病靶点取交集，将清心解瘀颗粒和动脉粥样硬化的重合靶点导进STRING平台，物种设置为“homo sapiens”，置信度≥0.9，其他固定，得出关系表。依托Cytoscape 3.7.2 软件，制作蛋白相互作用PPI网络，开展拓扑结构分析。把交集靶点导入Metascape数据库，进行KEGG信号通路富集和GO功能分析。用微生信在线作图工具，设置P≤0.05，把P值从小到大排序，把排名前20的生物过程和信号通路进行气泡图绘制。
1.2.2. 动物造模、分组及给药
1.2.2.1. AS大鼠模型的构建
适应性喂养1周，予高脂饲料（78.3%基础饲料、2%胆固醇、10%猪油、5%蛋黄粉、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠）喂养8周，加上腹腔注射维生素D3，造模第1天腹腔注射60万IU/kg的维生素D3，随后每4周补60万IU/kg，直到8周。正常组大鼠则给予正常饮食。
1.2.2.2. 动物分组及给药
分为正常组、模型组、西药阳性药阿托伐他汀（LPT）组、清心解瘀颗粒低剂量（LD）组、中剂量（MD）组、高剂量（HD）组，每组各6只。按照《药理实验方法学》换算给药剂量，LPT组为13.15 mg/（kg·d）、LD组为0.99 g/（kg·d）、MD组为1.98 g/（kg·d）、HD组为3.96 g/（kg·d），灌胃1 d/次，2 mL/次，连续灌胃8周，正常组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃。
1.2.3. 小动物超声检测各组大鼠腹主动脉血管壁厚度、脉冲波传播速度、搏动指数、以及内径大小
利用异氟烷持续吸入麻醉，把大鼠固定在超声检测台，用脱毛膏脱去胸腹部毛发。用彩色多普勒超声诊断仪检测，用B模式查看腹主动脉的整体情况，用超声多普勒模式查看腹主动脉血流速度，用M模式在腹主动脉远心端和近心端，分别记录脉冲波。最后用超声仪配套分析软件计算各组腹主动脉血管壁厚度、脉冲波传播速度、搏动指数、以及内径大小。
1.2.4. 生化分析仪检测各组大鼠血脂含量
对大鼠进行眼眶取血，血液室温静置1~2 h后，4 ℃，3000 r/min，离心15 min，收集上清，放于-80 ℃保存。使用日立全自动生化分析仪LABOSPECT008直接进行血脂4项检测。总胆固醇（TC）线性范围0.0~12.9 mmol/L；低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）线性范围0.0~11.6 mmol/L；甘油三酯（TG）线性范围0.0~11.3 mmol/L；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）线性范围0.0~2.6 mmol/L。
1.2.5. 动物取材
利用异氟烷麻醉大鼠，待大鼠麻醉，经腹主动脉取血后剥离腹主动脉，分离结缔组织，并将腹主动脉分为3段，取中段置于4%的多聚甲醛中，用于HE染色及免疫组化，另外的部分投入液氮后置于-80 ℃保存备用。采得的血液室温静置1~2 h后，4℃，3000 r/min 条件下，离心15 min，收集上清，放于-80 ℃保存，用于后续检测。
1.2.6. 苏木精-伊红（HE）染色观察各组大鼠腹主动脉的病理变化
用4%多聚甲醛固定腹主动脉组织24 h，精细修整腹主动脉表面，脱水，透明，浸蜡和包埋后切片（厚度4 μm），恒温箱中干燥2 h。脱蜡，梯度乙醇复水，苏木精和伊红染色，中性树胶封片，晾干后光镜下采集图像。
1.2.7. ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中AngⅡ、ET-1、PGI2、TXA2和ox-LDL的含量
收集所有大鼠血液，4 ℃下2000 r/min离心15 min，吸取血清，用于检测各组大鼠AngⅡ、ET-1、PGI2、TXA2和ox-LDL的水平。具体操作步骤根据说明书进行，在450 nm下进行各指标的检测。
1.2.8. 免疫组化法检测各组大鼠腹主动脉中LOX-1、PPARγ、RXRα、p-P65、VCAM-1、ICAM-1蛋白表达
4%多聚甲醛固定腹主动脉组织，脱水、包埋，石蜡切片，脱蜡入水，用柠檬酸法进行热抗原修复，冷却后按免疫组化试剂盒步骤进行：内源性过氧化物酶阻断剂→非特异性染色阻断剂→4℃过夜孵育一抗（LOX-1（1∶100）、PPARγ（1∶100）、RXRα（1∶100）、p-P65（1∶50）、VCAM-1（1∶200）、ICAM-1（1∶200）→生物素标记的羊抗小鼠/兔IgG聚合物→链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，DAB染色，自然晾干封片，在光学显微镜下放大400×成像观察血管，随机选取5~6个视野进行拍照，Image J软件计算各组蛋白的表达情况。
1.3. 统计学分析
采用SPSS 28.0软件进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差表示。首先采用夏皮罗-威尔克检验（Shapiro-Wilk Test）对计量资料数据进行正态性检测，若数据符合正态分布，多组比较采用单因素方差分析；事后比较中方差齐的数据用LSD检验，方差不齐则采用Dunnett T3检验。对非正态分布的数据采用非参数检验（Kruskal-Wallis One-Way ANOVA），显著性使用Bonferroni法进行校正。以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 清心解瘀颗粒对AS大鼠血管壁厚度、脉冲波传播速度、搏动指数和血管内径的影响
与正常组相比，模型组大鼠腹主动脉的血管壁厚度、脉冲波传播速度和搏动指数显著增加（P<0.05），腹主动脉血管内径显著减小（P<0.05）；而清心解瘀颗粒低、中、高剂量组和阿托伐他汀组的腹主动脉血管壁厚度、脉冲波传播速度、搏动指数较模型组减小（P<0.05），腹主动脉血管内径较模型组增大（P<0.05），且呈剂量依赖性（图1）。
图1.
清心解瘀颗粒对动脉粥样硬化大鼠血管壁厚度、脉冲波传播速度、搏动指数和血管内径的影响
Fig.1 Effects of QXJYG on vessel wall thickness, pulse wave propagation velocity, pulsatility index and vessel diameter in atherosclerotic rats. A, B: Ultrasound images and quantitative comparison of wall thickness of the abdominal aorta. C, D: Sonograms and quantitative comparison of pulse-wave propagation velocity of the abdominal aorta. E, F: Echocardiograms and quantitative analysis of the pulsatility index of the abdominal aorta. G, H: Ultrasound images and quantitative analysis of abdominal aorta vessel diameter. LPT: Positive control (atorvastatin) group; LD: Low-dose QXJYG group; MD: Medium-dose QXJYG group; HD: High-dose QXJYG group. *P<0.05 vs Control group; # P<0.05 vs Model group; △ P<0.05 vs LD group; & P<0.05 vs MD group.
2.2. 清心解瘀颗粒对AS大鼠血管病理形态的影响
与正常组相比，模型组大鼠血管内膜增厚，平滑肌细胞增生且排列紊乱，泡沫细胞形成，清心解瘀颗粒低、中、高剂量组和阿托伐他汀组的腹主动脉壁增厚、平滑肌增生及排列紊乱情况较模型组减轻（图2）。
图2.
清心解瘀颗粒对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉血管病理情况的影响
Fig.2 Effects of QXJYG on vascular pathology of the abdominal aorta in rats with atherosclerosis (HE staining, Scale bar=50 µm).①Intimal thickening of the blood vessels; ②Proliferation of smooth muscle cells with disordered arrangement.
2.3. 清心解瘀颗粒对AS大鼠血脂水平的影响
与正常组相比，模型组TC、LDL-C明显升高（P<0.05，图3），HDL-C明显降低（P<0.05）；与模型组比较，清心解瘀颗粒中、高剂量组和阿托伐他汀组的TC、LDL-C含量显著降低（P<0.05），HDL-C含量显著升高（P<0.05）；且清心解瘀颗粒中、高剂量组的TC、LDL-C、HDL-C含量与低剂量组相比，呈剂量依赖性。在TG指标上，各组间差异均无统计学意义（P>0.05）。
图3.
清心解瘀颗粒对动脉粥样硬化大鼠血清中TC、LDL-C、TG、HDL-C含量的影响
Fig.3 Effects of QXJYG on serum levels of TC, LDL-C, TG and HDL-C in rats with atherosclerosis. A: Serum levels of TC and LDL-C. B: Serum levels of TG and HDL-C. *P<0.05 vs Control group; # P<0.05 vs Model group; △ P<0.05 vs LD group.
2.4. 清心解瘀颗粒对AS大鼠血清中AngⅡ、ET-1、TXA2、PGI2含量的影响
与正常组相比，模型组大鼠血清中AngⅡ、ET-1、TXA2的含量升高（P<0.05，图4），PGI2含量则降低（P<0.05）；与模型组比较，清心解瘀颗粒低、中、高剂量组和阿托伐他汀组的AngⅡ、ET-1、TXA2的含量显著减少（P<0.05），PGI2的含量显著增多（P<0.05），且在ET-1和PGI2含量上，清心解瘀颗粒呈现剂量依赖。
图4.
清心解瘀颗粒对动脉粥样硬化大鼠血清中AngⅡ、ET-1、TXA2、PGI2含量的影响
Fig.4 Effects of QXJYG on serum levels of Ang II (A), ET-1 (B), TXA2 (C) and PGI2 (D) in rats with atherosclerosis. *P<0.05 vs Control group; # P<0.05 vs Model group; △ P<0.05 vs LD group; & P<0.05 vs MD group.
2.5. 清心解瘀颗粒与AS的交集靶点与PPI网络构建分析
用TCMSP数据库鉴定出清心解瘀颗粒中的丹参、黄芪、黄连、藿香、川芎中对应的化合物分别为65、20、14、11、7个（图5A），作用靶点分别为897、421、304、242、54个（图5B）。删掉相同的靶点，剩下301个作用靶点。在GeneCards、OMIM和TTD数据库中检索AS的疾病靶点，去除重复项后获得对应靶点有484个。将301个清心解瘀颗粒的作用靶点与484个AS的作用靶点取交集，获得29个清心解瘀颗粒与AS的交集靶点，绘制韦恩图（图5C），把清心解瘀颗粒抗AS的交叉靶点导到STRING数据库中，建立PPI网络（图5D）。有27个节点，129条边。把STRING数据库里的PPI网络数据导进Cytoscape 3.7.2，节点平均度值是9.556，挑出13个度值较平均值大的节点，如VCAM-1、PPARγ，是该网络的核心靶点（表1）。
图5.
清心解瘀颗粒与动脉粥样硬化作用靶点分析图
Fig.5 Analysis of targets of QXJYG and AS. A: Quantity diagram of each drug compound of QXJYG. B: Number of drug targets of QXJYG. C: Venn diagram of QXJYG and AS targets. D: PPI plot of potential protein interaction of QXJYG against AS.
表1.
清心解瘀颗粒抗动脉粥样硬化度值高于平均值的交叉靶点
Tab.1 Cross targets of QXJYG with anti-AS values higher than the average value
| Key target | Degree | Betweenness centrality | Closeness centrality |
|---|---|---|---|
| IL-6 | 21 | 0.14771628 | 0.83870968 |
| IL-1B | 19 | 0.0880959 | 0.78787879 |
| PPARG | 19 | 0.20820912 | 0.78787879 |
| VCAM1 | 16 | 0.03766667 | 0.7027027 |
| IL-10 | 14 | 0.02131169 | 0.66666667 |
| SERPINE1 | 14 | 0.01293806 | 0.65 |
| ESR1 | 14 | 0.04946542 | 0.65 |
| SPP1 | 14 | 0.01452414 | 0.65 |
| CRP | 13 | 0.00772194 | 0.63414634 |
| SIRT1 | 13 | 0.04028405 | 0.65 |
| NOS3 | 13 | 0.01529604 | 0.63414634 |
| MMP3 | 11 | 0.00423576 | 0.57777778 |
| SELE | 10 | 0.00117216 | 0.59090909 |
2.6. 清心解瘀颗粒抗AS的KEGG信号通路和GO功能分析
将交集靶点导入Metascape数据库，进行KEGG通路富集分析和GO功能分析。使用微生信在线作图工具，设置P≤0.05，最终得到29条通路，筛选出排名前20的通路，按P值由小到大排序，KEGG通路富集分析可视化结果（图6A）示，其中调控脂质、PPAR、NF-κB等相关信号通路可能是清心解瘀颗粒抗动脉粥样硬化的作用机制。GO功能分析，最终得到403个生物过程（图6B），其中主要包含脂质调节、炎症反应、防御反应等；12个细胞组分（图6C），主要包含小窝、转录调节复合体及等离子膜筏等；28个分子功能（图6D），主要包括核受体活性、配体激活的转录因子活性和DNA结合转录因子结合等。
图6.
清心解瘀颗粒抗动脉粥样硬化的KEGG通路富集分析与GO功能分析
Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis and GO functional analysis of QXJYG against AS.A: KEGG pathway enrichment analysis of QXJYG against AS. B: Biological processes analysis of QXJYG against AS. C: Cell components analysis of QXJYG against AS. D: Molecular function analysis of QXJYG against AS.
2.7. 清心解瘀颗粒对AS大鼠血清中ox-LDL含量的影响
利用ELISA试剂盒检测各组血清中ox-LDL含量（图7），与正常组相比，模型组大鼠的ox-LDL升高（P<0.05），清心解瘀颗粒低、中、高剂量组和阿托伐他汀组的ox-LDL水平较模型组降低（P<0.05），且呈剂量依赖性。
图7.
清心解瘀颗粒对动脉粥样硬化大鼠血清中ox-LDL的影响
Fig.7 Effect of QXJYG on serum ox-LDL in atherosclerotic rats. *P<0.05 vs Control group; # P<0.05 vs Model group; △ P<0.05 vs LD group.
2.8. 清心解瘀颗粒对AS大鼠腹主动脉中LOX-1、PPARγ、RXRα、p-P65蛋白表达的影响
通过免疫组化法检测各组大鼠腹主动脉中LOX-1、PPARγ、RXRα、p-P65蛋白表达水平（图8），与正常组相比，模型组大鼠腹主动脉的LOX-1、p-P65蛋白表达增加（P<0.05），PPARγ、RXRα蛋白表达减少（P<0.05）；清心解瘀颗粒组LOX-1、p-P65蛋白表达水平较模型组的降低（P<0.05），PPARγ、RXRα蛋白表达水平较模型组的升高（P<0.05），且呈现剂量依赖。
图8.
清心解瘀颗粒对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉中LOX-1、PPARγ、RXRα、p-P65蛋白表达的影响
Fig.8 Effect of QXJYG on the expression of LOX-1, PPARγ, RXRα and p-P65 in the abdominal aorta of atherosclerotic rats (DAB staining, original magnification: ×400). A, B: LOX-1 expression and positivity rate in the abdominal aorta. C, D: PPARγ expression and positivity rate in the abdominal aorta. E, F: Expression of RXRα and positivity rate positive rate. G, H: Expression of p-P65 and positivity rate. *P<0.05 vs Control group; # P<0.05 vs Model group; △ P<0.05 vs LD group; & P<0.05 vs MD group.
2.9. 清心解瘀颗粒对AS大鼠腹主动脉中VCAM-1、ICAM-1蛋白表达的影响
进一步利用免疫组化法检测各组大鼠腹主动脉中VCAM-1、ICAM-1的蛋白表达（图9），与正常组相比，模型组大鼠腹主动脉中VCAM-1、ICAM-1的蛋白表达升高（P<0.05）；清心解瘀颗粒干预后，显著降低了VCAM-1、ICAM-1的蛋白表达（P<0.05），且在VCAM-1蛋白表达上呈现剂量依赖。
图9.
清心解瘀颗粒对动脉粥样硬化大鼠腹主动脉中VCAM-1、ICAM-1蛋白表达的影响
Fig.9 Effect of QXJYG on the expression of VCAM-1 and ICAM-1 in abdominal aorta of atherosclerotic rats (DAB staining, ×400). A, B: VCAM-1 expression and positivity rate in the abdominal aorta. C, D: ICAM-1 expression and positivity rate in the abdominal aorta. *P<0.05 vs Control group; # P<0.05 vs Model group; △ P<0.05 vs LD group.
3. 讨论
清心解瘀颗粒具有益气化痰、活血解毒的功效。清心解瘀颗粒中的中药及其有效活性成分已在既往研究中证明可以用于治疗AS。如黄芪的主要活性成分黄芪甲苷 IV在心血管疾病中具有抗氧化和抗炎作用，能够预防ox-LDL诱导的内皮细胞损伤［16］。丹参中的活性成分丹酚酸B能降低血清脂质（TC、TG和LDL-C）水平，减少炎症因子，改善主动脉中的脂质积累，通过MAPKs/NF-κB信号通路发挥抗AS的作用［17］；另外，丹参二萜醌类有效成分丹参新醌乙能够通过NF-κB/NLRP3通路改善ox-LDL诱导的内皮细胞损伤，发挥抗AS的作用［18］。从川芎根茎中分离出来的化合物川芎嗪能抑制血小板中血栓素A2 （TXA2）的分泌［19］，通过抗氧化作用、抑制细胞凋亡、抗炎作用抑制AS［20］。从广藿香中提取的三环倍半萜烯广藿香醇能通过抑制炎症反应来减轻AS［21］。从黄连中提取的小檗碱具有降血脂的作用，能够降低总胆固醇和低密度脂蛋白（LDL-C）［22］，还能够改善内膜增生，拮抗颈动脉脂质积累，具有显著的抗AS特性［23］。以上这些证据充分证实了清心解瘀颗粒具有抗AS的作用。我们通过高脂喂养合并腹腔注射维生素D3构建AS大鼠模型，发现清心解瘀颗粒能显著扩大AS大鼠腹主动脉血管内径，减小腹主动脉血管壁厚度以及腹主动脉血管的脉冲波传播速度，抑制腹主动脉血管病理损伤，调节血管收缩和舒张功能，起到抗AS的作用。
AS的发病机制复杂。其中，脂质代谢障碍伴随了AS的全过程［24］，血脂异常是AS主要的致病因素，LDL-C的代谢对AS有重大影响。有研究表明［25］，LDL-C本身含有丰富的多不饱和脂肪酸，很容易被氧化修饰成ox-LDL，ox-LDL是一种比LDL-C更严重的致动脉粥样硬化脂蛋白。ox-LDL会使内皮细胞间隙增大，通透性增加，这会让更多脂质成分通过内皮层进入内皮下［26］。我们的研究发现，清心解瘀颗粒能减少AS大鼠血清中的ox-LDL、TC、LDL-C含量、升高HDL-C，从而改善AS大鼠的脂质代谢紊乱。
有研究报道，LOX1是心血管疾病和内皮功能障碍的潜在治疗靶点，抑制LOX-1，能够降低了ox-LDL［27］。ox-LDL与LOX-1结合后，会抑制PPARγ，进而激活NF-κB信号通路［5］。其中PPARγ是PPAR核受体超家族成员，它能加强脂肪细胞的摄取和脂质的存储，是介导胆固醇和游离脂肪酸从细胞内流向细胞外的关键受体，能够促进胆固醇的逆向转运，进而发挥防治AS的作用［28］。同时，PPARγ与RXRα形成异二聚体，拮抗NF-κB的促炎能力［6］。有研究表明，激活PPARγ信号通路能够减轻人脐静脉内皮细胞中ox-LDL介导的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡［29］。我们通过网络药理学技术进一步分析发现清心解瘀颗粒可能通过调控PPAR和NF-κB等多条信号通路发挥抗AS的作用。利用免疫组化技术进一步证实了，清心解瘀颗粒能显著降低AS大鼠腹主动脉血管中的LOX-1、p-P65蛋白表达，升高PPARγ、RXRα蛋白表达，说明调控PPAR/NF-κB可能是清心解瘀颗粒抗AS的作用机制。
当NF-κB通路被激活后，VCAM-1和ICAM-1的表达升高［30］。VCAM-1、ICAM-1是AS早期的病理变化及斑块进展的潜在机制，在一定程度上反映了血管的损伤程度［31］，是评估AS严重程度的重要指标［32］。我们的研究结果表明，清心解瘀颗粒能显著降低AS大鼠腹主动脉血管中的VCAM-1、ICAM-1蛋白表达，与超声结果以及HE染色结果一致。
综上所述，清心解瘀颗粒能改善AS大鼠的血管损伤，调节血管收缩和舒张功能，其作用机制可能是通过抑制血脂中ox-LDL水平，降低LOX-1的表达，使PPAR信号通路中的PPARγ、RXRα蛋白激活，进而抑制NF-κB信号通路中的P65的磷酸化，从而降低VCAM-1、ICAM-1有关。本研究为清心解瘀颗粒抗AS的临床应用提供了科学的实验证据。
基金资助
福建省科学技术厅中央引导地方科技发展专项（2021L3014）
参考文献
- 1. 马丽媛, 王增武, 樊 静, 等. 《中国心血管健康与疾病报告2022》要点解读[J]. 中国全科医学, 2023, 9(32): 3975-94. [Google Scholar]
- 2. 赵 冬. 新中国成立70年来我国人群血脂流行病学研究回顾与进展[J]. 中国医药, 2019, 14(10): 1441-4. [Google Scholar]
- 3. 王吉耀. 内科学[M]. 2版. 北京: 人民卫生出版社, 2010: 267-74. [Google Scholar]
- 4. Ibanez B, Fernández-Ortiz A, Fernández-Friera L, et al. Progression of early subclinical atherosclerosis (PESA) study: JACC focus seminar 7/8[J]. J Am Coll Cardiol, 2021, 78(2): 156-79. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5. Yin LQ, Wang LH, Shi ZH, et al. The role of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and atherosclerosis: post-translational modification and selective modulators[J]. Front Physiol, 2022, 13: 826811. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6. Gao LN, Zhou X, Lu YR, et al. Dan-Lou prescription inhibits foam cell formation induced by ox-LDL via the TLR4/NF-κB and PPARγ signaling pathways[J]. Front Physiol, 2018, 9: 590. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 7. 李银花, 贾张蓉, 江 龙, 等. 血脂康对冠心病合并高脂血症患者疗效的Meta分析[J]. 中国循证心血管医学杂志, 2014, 6(1): 25-30. [Google Scholar]
- 8. Zhang Z, Gao J, Wang J, et al. Mechanism of Zhishi Xiebai Guizhi decoction to treat atherosclerosis: Insights into experiments, network pharmacology and molecular docking. J Ethnopharmacol, 2024, 333: 118466. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 9. Zhi W, Liu Y, Wang X, et al. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis[J]. J Ethnopharmacol, 2023, 301: 115749. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10. 李圣耀, 杨 琳, 高铸烨, 等. 清心解瘀方组方中药入血成分的网络药理学分析[J]. 中国实验方剂学杂志, 2018, 24(5): 198-202. [Google Scholar]
- 11. 高 翔. 清心解瘀方干预炎症反应增强的稳定性冠心病患者临床研究[D]. 北京: 中国中医科学院, 2017. [Google Scholar]
- 12. 李金根. 清心解瘀方对稳定性冠心病临床终点事件影响的随机双盲对照研究[D]. 北京: 北京中医药大学, 2018. [Google Scholar]
- 13. 鞠建庆. 清心解瘀方调控巨噬细胞焦亡稳定动脉粥样硬化易损斑块的机制研究[D]. 北京: 北京中医药大学, 2019. [Google Scholar]
- 14. Zhang J, Wang XY, Guan BY, et al. Qing-Xin-Jie-Yu Granule inhibits ferroptosis and stabilizes atherosclerotic plaques by regulating the GPX4/xCT signaling pathway[J]. J Ethnopharmacol, 2023, 301: 115852. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15. Wang AL, Guan BY, Shao C, et al. Qing-Xin-Jie-Yu Granule alleviates atherosclerosis by reshaping gut microbiota and metabolic homeostasis of ApoE-/- mice[J]. Phytomedicine, 2022, 103: 154220. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16. Zhu ZS, Li JY, Zhang XR. Astragaloside IV protects against oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced endothelial cell injury by reducing oxidative stress and inflammation[J]. Med Sci Monit, 2019, 25: 2132-40. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 17. Zhang YF, Feng XT, Du M, et al. Salvianolic acid B attenuates the inflammatory response in atherosclerosis by regulating MAPKs/NF-κB signaling pathways in LDLR-/- mice and RAW264.7 cells[J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2022, 36: 3946320221079468. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 18. 李洪涛, 邓 宇, 王添乐, 等. 丹参新醌乙减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤: 基于抑制NF-κB/NLRP3信号通路介导的细胞焦亡[J]. 南方医科大学学报, 2023, 9(8): 1425-31. [Google Scholar]
- 19. Li L, Chen HW, Shen AL, et al. Ligustrazine inhibits platelet activation via suppression of the Akt pathway[J]. Int J Mol Med, 2019, 43(1): 575-82. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 20. Zhuang Z, Wang ZH, Huang YY, et al. Protective effect and possible mechanisms of ligustrazine isolated from Ligusticum wallichii on nephropathy in rats with diabetes: a preclinical systematic review and meta-analysis[J]. J Ethnopharmacol, 2020, 252: 112568. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 21. 张 伟, 张娟娟, 郭庆丰, 等. 广藿香醇药理作用研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2020, 26(3): 213-21. [Google Scholar]
- 22. Zhao JV, Yeung WF, Chan YH, et al. Effect of berberine on cardiovascular disease risk factors: a mechanistic randomized controlled trial[J]. Nutrients, 2021, 13(8): 2550. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 23. Song T, Chen WD. Berberine inhibited carotid atherosclerosis through PI3K/AKTmTOR signaling pathway[J]. Bioengineered, 2021, 12(1): 8135-46. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 24. 陈 超, 张瑞芬, 张海荣. PPAR-γ与动脉粥样硬化及其危险因素的相关研究进展[J]. 中国循证心血管医学杂志, 2021, 13(9): 1146-7. [Google Scholar]
- 25. 樊碧娆, 姚伟娟. 氧化型低密度脂蛋白受体在动脉粥样硬化发病机制中的作用[J]. 中国病理生理杂志, 2020, 36(10): 1897-901. [Google Scholar]
- 26. Yang XF, Shang DJ. The role of peroxisome proliferator-activated receptor γ in lipid metabolism and inflammation in atherosclerosis[J]. Cell Biol Int, 2023, 47(9): 1469-87. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 27. 汤银娟, 王建钧, 关莹露, 等. 阿托伐他汀对高胆固醇血症大鼠侧支血管中LOX-1和eNOS表达的影响[J]. 南方医科大学学报, 2019, 39(11): 1265-72. [Google Scholar]
- 28. Tang H, Zeng QF, Tang T, et al. Kaempferide improves glycolipid metabolism disorder by activating PPARγ in high-fat-diet-fed mice[J]. Life Sci, 2021, 270: 119133. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 29. Zhang BH, Hao ZW, Zhou WL, et al. Formononetin protects against ox-LDL-induced endothelial dysfunction by activating PPAR‑γ signaling based on network pharmacology and experimental validation[J]. Bioengineered, 2021, 12(1): 4887-98. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 30. Guo H, Cui BD, Gong M, et al. An ethanolic extract of Arctium lappa L. leaves ameliorates experimental atherosclerosis by modulating lipid metabolism and inflammatory responses through PI3K/Akt and NF‑κB singnaling pathways[J]. J Ethnopharmacol, 2024, 325: 117768. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 31. Ebrahimi F, Ghazimoradi MM, Fatima G, et al. Citrus flavonoids and adhesion molecules: potential role in the management of atherosclerosis[J]. Heliyon, 2023, 9(11): e21849. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 32. Adam CA, Șalaru DL, Prisacariu C, et al. Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(9): 4998. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]