电刺激促进周围神经再生的研究进展

Abstract

总结电刺激促进周围神经再生的研究进展，归纳临床前实验的电刺激参数并探讨其对神经再生的影响，介绍条件化电刺激模式和神经导管支架技术等最新研究。

耳鼻咽喉头颈区域涉及多组重要脑神经，脑神经的周围性损伤会导致面瘫、声嘶、吞咽困难等一系列相应症状^[1]。不仅严重影响患者的生活质量，也会带来巨大的经济负担^[2]。目前对于脑神经损伤尚缺乏令人满意的治疗手段，针对周围性神经损伤的治疗有诸多尝试，其中电刺激促进周围神经再生的研究历经数十年发展，取得了显著进展。新近的研究更多关注电刺激模式的优化及将其与生物工程技术结合，为周围神经功能修复提供了新的思路。本文就电刺激促进周围神经再生的研究进展进行综述。

1943年Hyden开创性地评估了电刺激对轴突再生的影响：利用1~2 mA的正弦交流电刺激脊髓背根神经节1~10 min后观察到神经节细胞中尼氏体增加。1952年Hoffman^[3]提出了促进轴突再生的电刺激参数：部分横断脊髓腰5神经根后对坐骨神经施加50~100 Hz、10~60 min的电刺激能够增加轴突出芽的速率。Pockett等^[4]在大鼠坐骨神经挤压伤后15~60 min内给予1 Hz的电刺激，观察到电刺激组的跖反射恢复时间缩短(4.14 d/10.40 d)。

Mendez等^[5]观察到短暂电刺激能加速挤压或横断的面神经恢复，并诱导损伤后的面神经运动神经元的通路特异性再生。但在Raslan等^[6]研究大鼠面神经切断吻合模型中，60 min 20 Hz的电刺激无法明显加速面神经恢复，其效果显著弱于股神经模型。这提示脑神经和脊神经对电刺激的机制可能不同，电刺激促进脑神经损伤修复效果还需更多的实验验证。

近年来临床试验也在逐步开展。Gordon等^[7]随机对照试验纳入21例正中神经损伤的受试者：正中神经减压后15 min内应用20 Hz、4~6 V的电刺激持续刺激正中神经1 h，随访6~8个月后发现接受正中神经电刺激的11例受试者比对照组在更短时间内实现了感觉神经动作电位(sensory nerve action potential，SNAP)波幅的提高、SNAP传导速度的增加和肌肉的再支配。此外，在指神经横断、肘管综合征、副神经损伤的患者中进行的随机对照试验均发现接受电刺激的患者神经电生理、感觉和运动功能均能更快恢复^[8-11]。

随着电刺激研究的深入，研究者注意到电刺激可能导致一些不良反应：表面电极需要高电流来克服皮肤阻抗到达深层组织，可能会导致疼痛、皮肤刺激和局部烧伤^[12]；袖带电极易于植入、创伤性小，可以提供准确定位的局部电刺激，但也会使神经出现病理反应、机械损伤^[13]。

1. 电刺激促进周围神经再生的机制

周围神经损伤后远端神经发生华勒氏(Wallerian)变性、髓鞘崩解、轴突骨架变性^[14]，这通常发生于损伤后24~48 h。损伤后期远端神经骨架发生萎缩、轴突末端脱离靶肌肉/器官^[15]。近端神经在再生过程开始前发生退行性改变如神经元胞体肿胀、尼氏体变性，同时细胞内基因表达改变^[16]。轴突整体再生的速度缓慢，约1~3 mm/d^[17]；在此过程中远端肌肉因失神经支配逐渐萎缩变性，时间越长、预后越差^[18]。

周围神经损伤后的修复过程中损伤部位局部微环境会发生一系列结构变化：首先是髓鞘解体, 施万细胞去分化为修复细胞^[19]，巨噬细胞活化吞噬髓鞘沉积物^[20]；除清除髓鞘碎片外，巨噬细胞和施万细胞可产生细胞因子如白细胞介素-6(IL-6)以促进轴突生长；随着碎片的清除，再生将从损伤部位的近端开始向远端延伸；施万细胞能够引导两侧神经末端基底膜之间的轴突萌发的胞浆延伸^[21]，Büngner带由纵行排列的施万细胞和新生的内膜管形成，内膜管将引导萌发的轴突向目标组织移动以重新获得神经支配^[22-23]；同时Büngner带会释放生长因子包括成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、白细胞介素样生长因子(Interleukin-like growth factor，IGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived growth factor，BDNF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)加速轴突再生^{[15, 24-25]}；损伤后1~2 d促炎症的M1巨噬细胞明显增加，损伤后3~4 d向促再生和抗炎症的M2巨噬细胞分化从而减少局部炎症反应、促进神经再生^[26]。

体外实验发现电刺激能促进脊髓背根神经节中神经元内的环腺苷酸(cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP)和施万细胞中的NGF分泌，cAMP持续升高可促进NGF和细胞骨架蛋白的表达^[27]。在损伤部位植入预先电刺激后的施万细胞，神经元的生长明显加速^[28]。大鼠胫神经脱髓鞘模型中电刺激对巨噬细胞表型产生了显著的影响，使巨噬细胞表型从主要的M1型转变为M2型^[29]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3-K/Akt)细胞通路在神经营养分子的下游信号传递中至关重要^[30]，而电刺激能减少此通路抑制基因磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog，PTEN)的表达^[31-32]，对PI3-K/Akt的药理性阻断降低了电刺激对神经再生的促进作用。

基于以上证据，电刺激促进周围神经再生机制可概括为以下几个方面：①促进巨噬细胞浸润，加速髓鞘和轴突的瓦解及碎片的清除；②上调BDNF和NGF表达，加速神经元生长和分化^[33]；③促进施万细胞迁移：近端和远端神经残端上的施万细胞长入神经桥形成施万细胞束，引导轴突再生^[34]；④直接或间接地促进内皮细胞的迁移和血管生成相关的功能基因的表达，施万细胞和内皮细胞的迁移、血管的生成都有利于神经桥的形成——这些作用可能由PI3K-Akt信号通路介导；⑤通过加速早期轴突和血管再生来延缓周围神经损伤后的靶器官/肌肉萎缩。

2. 电刺激的方式和参数

90年代以来，更多的啮齿类动物损伤模型表明：电刺激能促进多种类型周围神经损伤的再生包括神经挤压伤、横断伤和慢性损伤^[35-36]，但不同研究的电刺激方式、刺激参数(如频率、脉冲宽度、刺激时间和周期)以及电极类型差异较大。本研究对近5年各项临床前实验的电刺激方式、刺激参数和电极类型进行了回顾总结。

2.1. 电刺激方式

目前3种主要电刺激方式包括植入式电刺激、一次性直接电刺激和经皮电刺激，前2种为有创操作。Ju等^[37]在大鼠坐骨神经挤压伤模型中比较了植入式和经皮电刺激的效果：均使用25 Hz、0.1 ms、2~3 V的模式每天刺激30 min，每周5次，持续6周，实验结果提示虽然经皮电刺激组大鼠在轴突直径和肌纤维面积上优于空白对照组，但效果不及植入电极组。但Pion等^[38]在小鼠坐骨神经切断-缝合模型中证实经皮电刺激与直接电刺激在促进成年小鼠坐骨神经功能恢复方面同样有效。相比于一次性直接电刺激，Ju等^[37]使用长时间、高密度的电刺激模式，可能更能发挥植入电极的优势，因而获得更好的效果。

除电刺激方式外，对刺激电极的更新和探索也是研究重点之一，近5年动物实验的电极应用总结见表 1。Yu等^[39]比较了植入不同接触面积的电极对大鼠坐骨神经切断-缝合模型再生效果的影响：点接触电极和1/4圈接触组在植入后4周和10周的坐骨神经功能指数(sciatic functional index，SFI)、复合肌肉动作电位(compound muscle action potential，CMAP)和运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity，MNCV)方面的表现都显著优于无电极组。与全接触组比较，点和1/4圈接触能够促进坐骨神经的再生，且在植入后4周和10周观察到的神经干的机械损伤较少。在电极设计上，MacEwan等^[40]研发的植入式薄膜无线神经刺激器可显著改善大鼠的功能恢复，并且具有可完全植入、无连接线、无电源的优势，方便重复、长时间给予治疗性电刺激。

表 1.

电刺激促进周围神经再生临床前实验中对电刺激方式、电极材料、参数的研究

参考文献	临床疾病模型	电刺激参数	电极	动物模型	实验结论
[38]	周围神经损伤	20 Hz，0.1 ms，5 V，1 h	双极钩状电极	小鼠，坐骨神经切断-缝合模型	经皮电刺激与直接电刺激对成年小鼠坐骨神经功能恢复有相同的促进作用，显著优于单纯轴突切断后缝合
[54]	周围神经损伤后异体移植修复	20 Hz，0.2 ms，1 h/d，0/3/6/9/12 d	植入式薄膜无线神经刺激器	大鼠，坐骨神经横断后移植40 mm的同种异体神经	持续6 d治疗性电刺激对功能恢复最为有效
[43]	周围神经损伤	16 Hz，0.1 ms，0.5 mA，10/60 min	不锈钢304钩状电极	大鼠，坐骨神经切断-缝合模型	10 min电刺激与60 min方案促进效果相似
[42]	周围神经损伤	16 Hz，0.5 mA，10/60 min	不锈钢钩状电极	小鼠，坐骨神经切断-缝合模型	10 min电刺激能够加速轴突再生并促进功能恢复
[55]	周围神经损伤后自体移植修复	20 Hz，0.1 ms，3~5 V，1 h	Cooner铜导线末端	大鼠，腓总神经切断后移植对侧腓总神经	单次电刺激能够促进自体神经移植后的轴突再生；延迟电刺激的效果有限
[37]	周围神经损伤	25 Hz，0.1 ms，2~3 V，30 min，每周5次，持续6周	植入电极/经皮电刺激	大鼠，单侧坐骨神经挤压伤	植入电极组的大鼠较经皮电刺激组神经功能恢复更快
[39]	周围神经损伤	20 Hz，0.1 ms，9 V，30 min/d，持续20 d	点接触电极、1/4环接触电极、整圆接触电极	小鼠，坐骨神经切断-缝合模型	点接触组与1/4环接触组均能够促进坐骨神经再生，且较全接触组机械损伤小
[56]	周围神经损伤	20 Hz，0.3 ms，1 h/3 d，持续2周	植入式袖状电极	小鼠，坐骨神经切断-缝合模型	重复电刺激无法提高肌肉神经再支配恢复率，并导致反射亢进
[44]	周围神经损伤	5/100 Hz，0.2 ms，30 min/d，持续7 d	经皮电刺激	大鼠，单侧坐骨神经挤压伤	经皮高频电刺激具有促进运动神经再生的潜力
[40]	周围神经损伤	20 Hz，0.2 ms，2.5 V，1 h	植入式神经刺激器	大鼠，坐骨神经挤压伤/坐骨神经切断-缝合模型	植入式无线刺激器对损伤的周围神经组织有治疗作用，适宜临床转化

2.2. 电刺激参数

有效的电刺激治疗需要确定安全的、最佳的刺激参数，电刺激的效果取决于各种变量如电流、频率、持续时间、波形等，不同频率和电流的电刺激对神经元影响差异较大，但机制尚不明晰^[41]。

Sayanagi等^[42]和Roh等^[43]分别在小鼠和大鼠的坐骨神经损伤模型中应用16 Hz、0.5 mA的电流进行10 min或60 min的电刺激，评估神经节基因表达、神经元数量和形态、肌肉重量和行为学，发现持续10 min与60 min对神经再生促进作用相同。Su等^[44]对坐骨神经损伤的大鼠进行了不同时间点、刺激频率和强度的电刺激效果评价，发现即刻和迟期(损伤1周后)的高频电刺激(100 Hz)都较低频电刺激(5 Hz)的运动功能改善明显，体内、体外实验均提示高频电刺激比低频更能诱导背根神经节细胞炎症反应的发生。对近5年周围神经再生动物模型的电刺激参数研究的总结见表 1。目前周围神经损伤动物模型中最常用的电刺激参数是20 Hz、0.1 ms、3~5 V或0.5 mA，每次刺激1 h，并倾向于短时间、单次应用，这与目前临床应用于患者的电刺激标准模式一致：以20 Hz和0.1 ms脉冲刺激1 h。对于临床前实验的参数研究有利于制定更有效的临床方案。

3. 条件化电刺激

以上电刺激模式均应用于神经损伤后，但Senger团队研究发现：与挤压伤类似，在神经损伤前应用电刺激也能够促进周围神经横断后再生。与对照组比较，损伤前1周进行电刺激和神经挤压伤都使大鼠坐骨神经切断-缝合后1周的轴突再生长度增加3.8倍，轴突数量增加2.2倍^[45]，通过比较机械感觉、复合肌肉动作电位和行为学特性发现条件化电刺激在提高再生神经功能方面更有优势^[46]。但条件化电刺激对交感神经轴突再生效果有限^[47]，可能与交感神经轴突对电刺激的反应方式与运动神精轴突和感觉神精轴突不一致有关^[47]。该团队同时提出，相比于损伤后电刺激，术前条件化电刺激在周围神经的轴突再生和功能恢复方面效果更佳，坐骨神经损伤模型中条件化电刺激、损伤后电刺激、条件化+损伤后电刺激、对照组的7 d轴突再生长度分别是8.5 mm、5.5 mm、3.6 mm、2.7 mm。值得注意的是，在术前、术后同时进行电刺激，神经再生的效果并未出现叠加效应^[48]。

在此基础上Senger团队利用胫神经分支吻合腓总神经远端残端，并在术前1周对胫神经进行电刺激。与对照组比较，采用条件化电刺激治疗的大鼠在行为学、电生理学以及神经和肌肉组织学方面都存在明显的改善^[17]。

条件化电刺激促进神经再生的机制可能是使神经元胞体基因表达模式改变为“损伤/修复”状态，再生相关基因、轴突结构蛋白基因的表达上调，但不引起轴突变性或巨噬细胞浸润^[49]。因此，条件化电刺激的一个临床应用场景是：当肿瘤组织侵犯或严重的软组织创伤难以避免牺牲神经时，可考虑使用神经跨接的方式吻合神经或者暂时寄养神经，防止支配的肌肉萎缩，并在神经吻合前利用电刺激使供体神经进入储备或应激状态，加速后期轴突再生。

4. 电刺激结合神经导管技术

神经引导支架可通过生物工程提供神经外膜或神经束膜的支架结构，建立类似于细胞外基质的微环境，利用电纺和3D打印等技术设计支架模仿自体移植的形态结构，引导神经再生、增强电刺激对轴突沿电场的引导作用。

Li等^[50]将一种具有导电性和机械性能的碳纳米管/丝氨酸神经导管应用于大鼠损伤模型中，结合电刺激修补横断坐骨神经的10 mm缺口，12周后观察到该导管结合电刺激可以有效地促进结构修复和功能恢复，与自体神经移植效果相当。张喜等^[51]研发的神经导管也获得相似结果。Lu等^[52]设计了一种可生物降解的导电聚/石墨烯复合导管，表面的微图案是通过微压印技术和自组装的聚多巴胺制作的20 μm的凹槽，应用于大鼠坐骨神经挤压伤模型中发现：带有电刺激的传导性微图案导管能促进髓鞘的生长和加快神经再生，并在体内实现20倍于对照组的功能恢复。更多体外试验证明带有电刺激的导管能有效地刺激施万细胞的定向迁移、黏附和伸长，促进施万细胞表达神经生长因子^[52-53]。

5. 展望

作为周围神经康复的重要手段，电刺激促进周围神经再生的作用已经被广泛接受。临床前实验和分子机制方面已取得显著进展，从机制的可行性及实际运用的有效性而言，电刺激与手术结合可作为周围神经损伤的新型治疗手段，尤其在联合神经营养药物、理疗等治疗方式时可改善治疗效果。临床探索仍处于起步阶段，在广泛应用于临床前需对电刺激的最佳参数和安全范围进行更大范围的研究；评估电刺激应用于神经移植前预处理的安全性和有效性。此外，在电刺激应用于脑神经方面需要更多的基础研究和临床数据。

Funding Statement

北京市自然科学基金资助(No：7242107)；中央高校基本科研业务费项目(No：3332021010)；中央高水平医院临床科研专项(No：2022-PUMCH-A-094)