Abstract
目的
评估不同剂量的环磷酰胺(cyclophosphamide，CYP)诱导的间质性膀胱炎/膀胱痛综合征(interstitial cystitis/bladder pain syndrome, IC/BPS)动物模型模拟疾病症状的准确性与可重复性，以期为IC/BPS的病理生理学研究和治疗策略评估提供实验模型依据。
方法
选用7周龄的Sprague-Dawley雌性大鼠28只分为a组(25 mg/kg CYP)、b组(75 mg/kg CYP)、c组(125 mg/kg CYP)和d组(对照组)4组，每组7只，通过腹腔注射CYP或生理盐水建立动物模型，评估指标包括尿斑实验、von Frey纤维触痛实验、尿动力学检查，以及组织学分析。
结果
25 mg/kg CYP剂量的大鼠在模拟IC/BPS膀胱功能障碍和炎症反应方面显著优于其他CYP剂量组，且对生理功能影响较小。所有剂量CYP处理的大鼠都表现出膀胱炎症，但25 mg/kg剂量的症状与IC/BPS临床特征更为一致。此外，25 mg/kg CYP剂量组大鼠膀胱顺应性降低，内脏疼痛增加，但未显著增加排尿频率，与IC/BPS患者表现相似。
结论
25 mg/kg的CYP剂量在模拟非溃疡性IC/BPS的关键特征方面表现出明显的优势，对未来IC/BPS的研究和治疗策略提供了重要参考。但尽管如此，由于IC/BPS的多因素性质，未来研究需要探索更多诱导手段，以复现疾病的复杂病理过程。
Keywords: 环磷酰胺, 间质性膀胱炎, 膀胱痛综合征, 尿动力学, 动物模型
Abstract
Objective
To evaluate the efficacy of cyclophosphamide (CYP) at different doses in replicating the symptoms of interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS) in an animal model, thereby providing an experimental basis for understanding the pathophysiology of IC/BPS and assessing treatment strategies.
Methods
Twenty-eight female Sprague-Dawley rats aged seven weeks were divided into four groups: Group a (25 mg/kg CYP), group b (75 mg/kg CYP), group c (125 mg/kg CYP), and group d (a control group). The rats were injected intraperitoneally with either CYP or saline solution. Evaluations included urine spot tests, von Frey filament pain threshold tests, urodynamic examinations, and histological assessments.
Results
The study found that the 25 mg/kg CYP dosage significantly outperformed higher doses in simulating bladder dysfunction and inflammatory responses while minimizing the impact on the rats' physiological functions. Specifically, urine spot area, group a showed a significant reduction in urine spot area compared with the control group (P < 0.05), while groups b and c did not show significant differences. Pain threshold: The von Frey filament test indicated increased visceral pain in group a, aligning closely with IC/BPS patient symptoms, without a significant increase in urination frequency. Urodynamic assessments: Group a exhibited decreased bladder compliance and reduced maximum bladder capacity (P < 0.05), with no significant differences in baseline bladder pressure and maximum detrusor pressure across all groups. Histological analysis: Hematoxylin-eosin (HE) staining revealed that bladder tissue in group a had moderate inflammatory reactions, whereas groups b and c showed severe inflammation and tissue damage, correlating with the higher doses of CYP. Furthermore, the urine spot tests and von frey filament tests provided quantitative data supporting the model's reliability, urine spot count, group a had an average urine spot count of (15±3) spots, significantly higher than the control group's (5±2) spots (P < 0.01). Nociceptive score: Group a nociceptive score increased to 0.5±0.1, indicating heightened pain sensitivity compared with the control group 0.10±0.05 (P < 0.01).
Conclusion
The 25 mg/kg CYP demonstrated significant advantages in simulating the key features of non-ulcerative IC/BPS, summarizing the main aspects of the human condition, including persistent visceral pain and mild inflammatory reactions in bladder tissue. These findings offer substantial experimental support for drug development and treatment research in IC/BPS and provide new insights into the complex patho-physiology of the disease.
Keywords: Cyclophosphamide, Interstitial Cystitis, Bladder Pain Syndrome, Urodynamics, Animal Model
间质性膀胱炎/膀胱痛综合征(interstitial cystitis/bladder pain syndrome, IC/BPS)是一种以慢性盆底疼痛、频繁排尿和排尿紧迫感为主要症状的复杂疾病，严重影响患者的生活质量[1-2]。尽管其具体病因尚未明确，但研究表明，尿道上皮屏障损伤、炎症反应、神经功能异常和自身免疫过程可能是其关键因素[3-4]。因此，建立一个精确的动物模型对于深入理解IC/BPS的病理生理机制和研究新的治疗方法至关重要。环磷酰胺(cyclophosphamide, CYP)是一种已知可模拟IC/BPS症状的化疗药物[5-6]，虽广泛用于动物模型的建立，但其剂量和应用方式的多样性限制了模型的标准化和疾病特征的准确复现[7-9]。本研究评估不同剂量CYP在模拟IC/BPS症状的有效性及其在疾病发生机制研究和治疗评估中的应用，旨在建立并优化CYP诱导的IC/BPS动物模型，为未来的研究和治疗策略提供更准确的实验动物平台。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及分组
7周龄Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠共28只，体质量250~350 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠在(21±3)℃的条件下，经历12 h光照/暗周期，自由进食和饮水，至少3 d适应实验环境。实验大鼠分为a组(25 mg/kg CYP)、b组(75 mg/kg CYP)、c组(125 mg/kg CYP)和d组(对照组，0.9% NaCl)4组，每组7只。CYP和NaCl通过腹腔注射给药。本研究所有实验开始前已经北京大学人民医院医学伦理委员会审查批准(2023PHE119)。
1.2. 纤维丝触痛实验
使用8种力度的von Frey纤维细丝对大鼠进行腹部机械刺激，评估痛觉反应[9]。在测试前，每只大鼠指定的腹部区域备皮，将动物分别置于透明的Plexiglas盒中，置于提高的网状地板上，并使其适应至少30 min。在von Frey测试期间，每根纤维通过网格以能够轻微弯曲它的力量持续刺激1~2 s，这个过程对每根纤维重复3次，应用间隔5 s，并且小心变换靠近膀胱的刺激区域，以避免脱敏。痛觉反应评分如下：0 =无反应；1=腹部收缩；2=收缩加上位置改变；3=收缩、位置改变、刺激区域舔舐和/或发声。疼痛评分是根据动物在三次刺激中表现出的最大痛觉反应评分来计算的[10]。
1.3. 尿斑实验
在实验期间，将SD大鼠单独放置在标准笼中4 h，床垫被Whatman 3号滤纸替换，大鼠可以自由进食和饮水，然后在紫外光下拍摄尿迹，记录尿迹覆盖面积的百分比，使用Image J软件分析和计算尿迹的面积。
1.4. 尿动力学检查
在实验开始前，需要从输液泵和泵管中排出空气，并将泵设定为6 mL/h。在大鼠平台上，将大鼠置于仰卧位，通过吸入异氟醚诱导麻醉，并通过动物面罩维持。对尿道口进行消毒，然后通过尿道将一根19 G压力测量导管插入膀胱深3 cm处，并用胶带固定。通过生理盐水输液，利用计算机软件监测尿液动力学指标，并使用压力表记录数据，一旦尿液动力学曲线稳定，即开始实验。
1.5. 膀胱炎症评估和组织病理学
在第一次注射CYP或盐水后的指定时间，处死动物，迅速收集膀胱，并对膀胱质量、壁厚和水肿进行评估。根据Gray等[11]建立的标准对每个膀胱进行宏观检查以评估水肿，无、轻度、中度、重度水肿分别评为0、1、2、3分。当膀胱壁的外部和内部均可见液体时，定义为重度水肿；当水肿仅限于内部黏膜时，定义为中度水肿；当水肿介于正常到中度之间时，定义为轻度水肿。膀胱以10%(体积分数)的甲醛溶液固定，并嵌入石蜡中。膀胱切片用苏木精伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。
1.6. 统计学分析
使用R软件(版本3.6.3)进行统计和可视化分析，对于计量资料进行Shapiro-Wilk正态性检验，服从正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，不服从正态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验，多组数据使用多组间Kruskal-Wallis秩和检验，并通过Bonferroni方法进行显著性校正，P < 0.05认为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 尿液斑点测试评估膀胱功能
4组SD大鼠分别接受了不同剂量的CYP或生理盐水处理，并进行了功能评估，包括尿斑试验、von Frey纤维触觉敏感性测试和尿动力学测试，此外，还对膀胱黏膜变化进行了评估(图 1)。在c组(n=5)因使用较高剂量的CYP而导致了较高死亡率，即有两只大鼠死亡。
图 1.
造模后各组小鼠一般情况
General conditions of mice in each group after modeling
A, comparison of urine spot areas among groups; B, comparison of the number of urine spots among groups; C, comparison of pain scores from the von Frey filaments test among groups; D, comparison of bladder tissue edema scores among groups; E, comparison of bladder weights among groups; F, comparison of body weight changes in rats before and after treatment among groups. a, group a (25 mg/kg CYP); b, group b (75 mg/kg CYP); c, group c (125 mg/kg CYP); d, group d (control group). * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, compared with control group.
通过尿斑实验评估了经CYP建模的大鼠的膀胱功能(图 1A、B)，与对照组(d组)相比，a组(25 mg/kg)和b组(75 mg/kg)的尿斑面积差异无统计学意义，而c组(125 mg/kg)的尿斑面积显著低于d组(P < 0.05)。此外，a组和b组的尿点数量都显著高于d组(P < 0.05)，这可能由于高剂量的CYP使c组SD大鼠的活力下降，进而影响排尿功能，没有很好地反映出IC/BPS增加排尿频率的典型特征。
2.2. 内脏疼痛和膀胱炎症评估
通过von Frey纤维细丝触痛实验，以及对膀胱水肿的评估和膀胱质量与大鼠体质量的比例测量发现，接受慢性CYP注射的a、b、c 3组大鼠都表现出内脏疼痛，其特征是对正常无害的1~8 g von Frey力的反应增加(异常疼痛)，以及对有害的10~26 g von Frey力的反应增加和痛觉过敏(图 1C)。此外，a、b、c三组大鼠的水肿评分都显著高于d组(P < 0.05，图 1D)，膀胱质量也显著高于d组(P < 0.05，图 1E)，这表明所有3个剂量的CYP都能有效地模拟IC/BPS的炎症症状。然而，b组和c组在CYP建模后并未出现生理性的正常增重，与建模前体质量差异无统计学意义，而a组和d组则表现出8周龄SD大鼠应有的生理性体质量增长，这表明25 mg/kg的CYP剂量在模拟IC/BPS的排尿功能和炎症反应的同时，对SD大鼠造成的损害较小，不影响其生理功能(图 1F)。
2.3. 大鼠尿动力学指标评估
在进行尿动力学评估时发现(图 2)，与d组相比，a组和b组的最大膀胱容量显著减少(P < 0.05，图 2A)，a组和c组的膀胱顺应性也显著降低(P < 0.05，图 2C)。
图 2.
各组大鼠造模后膀胱功能
Bladder function of rats in each group after modeling
A, comparison of maximum bladder capacity among groups; B, comparison of maximum detrusor pressure among groups; C, comparison of bladder compliance among groups; D, comparison of baseline bladder pressure among groups. a, group a (25 mg/kg CYP); b, group b (75 mg/kg CYP); c, group c (125 mg/kg CYP); d, group d (control group). * P < 0.05, **P < 0.01, compared with control group.
4组大鼠在最大逼尿肌压以及尿动力学检查前的基线膀胱压力方面差异无统计学意义(图 2B、C)。
2.4. 组织学评估
对SD大鼠膀胱组织进行了HE染色，光学显微镜观察发现，a、b、c 3组大鼠的膀胱组织存在膀胱炎症(图 3A~C)，呈现出严重的间质性水肿、明显的炎细胞浸润、固有层水肿、黏膜下层出血以及尿路上皮局灶性损伤；与此相反，d组的膀胱组织则未观察到上述改变(图 3D)。
图 3.
各组大鼠HE染色结果
Hematoxylin-eosin (HE) staining of rats in each group
A, HE staining image of group d (control group); B, HE staining image of group a (25 mg/kg CYP); C, HE staining image of group b (75 mg/kg CYP); D, HE staining image of group c (125 mg/kg CYP).
3. 讨论
IC/BPS的治疗历程充满挑战，主要受制于IC/BPS复杂的病因和尚未建立的统一诊断标准。当前治疗手段的有效性有限，迫切需要发现针对性的生物标志物和新的药理学治疗靶点，这一目标的实现，依赖于精确的动物模型作为研究基础[10]。IC/BPS作为一种主要表现为慢性膀胱疼痛和频繁排尿的慢性疾病[12]，CYP诱导的膀胱炎模型在啮齿动物中被广泛应用于研究IC/BPS相关的炎症和增高的躯体敏感性[13-15]。
本研究评估了不同剂量CYP在模拟IC/BPS症状上的效用，发现相较于更高剂量，25 mg/kg的CYP在诱发膀胱功能障碍和炎症反应方面更具优势，对大鼠生理功能的影响也更为有限。所有剂量的CYP均能够诱导膀胱炎症反应，但25 mg/kg剂量所引起的症状与IC/BPS患者的临床特征更加吻合。本实验中，25 mg/kg剂量CYP处理组的大鼠显示出与IC/BPS患者相似的膀胱顺应性降低和内脏疼痛增加，但并未显著增加排尿频率。尽管高剂量的CYP可引发膀胱功能显著变化，但并不完全代表IC/BPS的所有特征。与高剂量相比，25 mg/kg CYP不仅模拟了排尿障碍，还再现了IC/BPS的其他特征，如疼痛和炎症，这一点在尿斑和von Frey纤维触痛测试中得到了验证。
CYP模型在模拟IC/BPS的关键临床特征(如膀胱疼痛和尿频)方面非常有效。本研究表明，CYP在25 mg/kg剂量下可引起膀胱炎症和功能障碍，这与人类疾病的表现非常接近。25 mg/kg CYP模型的价值在于它不仅模拟了最初的炎症反应，还模拟了病理的后期阶段，如纤维化和膀胱壁的神经变性，这对长期疾病研究至关重要。相比之下，其他化学诱导剂，如氢氧化钾或盐酸，往往会引起更广泛的、非特异性的膀胱损伤，而不是复制IC/BPS的特定症状。低剂量的CYP对实验动物的生理影响最小，减少了不必要的全身毒副作用，像膀胱膨胀这样的机械刺激可能会引起更严重的组织损伤和应激反应，可能会模糊研究人员旨在研究的特定疾病反应[16]。使用CYP作为诱导剂是相对简单的，并能够产生可重复的结果，这体现出有价值的研究一致性。与机械刺激所需的更复杂的设备和程序相比，化学诱导剂的给药方法通常包括比较简单的膀胱注射或输注，机械刺激也可能因每次应用的强度而变化，影响实验的一致性。总之，CYP模型对人类IC/BPS的病理模拟使其成为研究CYP和开发潜在治疗方法的首选模型，能够提供可以直接支持新药开发或治疗策略的数据。
综上所述，25 mg/kg的CYP在模拟非溃疡性IC/BPS关键特征方面展现出显著的优势，概括了人类非溃疡性IC/BPS的主要关键特征[17]，这些症状包括持续性的内脏疼痛和膀胱组织的轻度炎症反应。本研究为IC/BPS的药物开发与治疗研究提供了重要的实验动物模型支撑，并为理解IC/BPS的复杂病理机制提供了新的研究基础。
Funding Statement
国家自然科学基金(81970660)和北京大学人民医院研发基金(2147000692)
Supported by the the National Natural Science Foundation of China (81970660) and Research and Development Fund of Peking University People's Hospital (2147000692)
Footnotes
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明 柯涵炜：文章撰写，实验操作，统计分析；王起：项目规划，统计分析，文章修改；许克新：统筹规划，最终把关。
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