气流辅助熔融态聚合法制备荧光碳点检测医疗废水中四环素

Abstract

对环境水样中四环素(TC)污染物的控制措施和环保管理均需要精确获得环境介质中TC污染物的浓度。碳点(CDs)是一种新兴的荧光材料,它具有易制备、低成本、低毒性及良好的生物相容性等优点,在TC检测领域广受关注。本文以丙三酸(tricarboxylic acid)与乙二胺(ethylenediamine)为前驱物,采用气流辅助熔融态聚合法合成了具有蓝色荧光的TE-CDs,并建立了基于TE-CDs的TC检测方法。对所制备的TE-CDs形貌及结构进行表征,透射电镜结果表明TE-CDs分散较好,平均直径为(2.43±0.48) nm。X射线衍射结果显示TE-CDs具有无定形碳结构。红外光谱及X射线光电子能谱结果表明TE-CDs表面富含氨基、羟基和羧基等亲水基团,说明TE-CDs具有良好的水溶性,有利于实现对医疗废水中TC的检测。TE-CDs具有激发依赖性,最大激发波长和发射波长分别为368 nm和448 nm。TC可有效地将TE-CDs的蓝色荧光淬灭,利用此性质可实现对TC的检测。另外,TE-CDs对TC响应灵敏,在较宽的pH范围内荧光强度稳定。在TC质量浓度从2 mg/L增加到200 mg/L时, TE-CDs的荧光强度呈现不同程度的降低,直至完全淬灭,淬灭机制为动态淬灭。在4~20 mg/L范围内,TC质量浓度与TE-CDs荧光淬灭程度呈现良好的线性关系(R²=0.9978),检出限为0.2 mg/L。所制备TE-CDs响应灵敏,荧光稳定性较优,选择性较好,采用该方法对医疗废水中的TC定量检测,回收率为96.5%~119.8%,相对标准偏差(RSD)为0.8%~2.6%,该方法省时简易,重复性好,具有良好的实际应用价值。

四环素(tetracycline, TC)作为一种广谱抗生素药物,常用于治疗人类和动物的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌感染^[1,2],是目前使用最广泛的治疗药物之一^[3]。但是,TC进入人体后,仅有少部分能被机体代谢或吸收,高达75%的TC以母体化合物形式通过代谢排出体外,释放到自然环境中,经水循环最终在各类水体或水生生物中积累、富集^[4]。当人类饮用或食用含有TC的水或食物时,会产生胃肠道紊乱、肝脏损伤、牙齿发育不良等危害^[5,6]。此外,自然界中TC的残留还会引起耐药菌产生等诸多问题。抗生素是医院使用的最重要的治疗药物之一。当前,由于缺乏TC等相关抗生素的排放标准,经过污水处理系统排放的废水中仍存在抗生素残留,因此,为了防止TC过量进入自然界,对医疗废水中TC的浓度变化进行密切监测十分关键^[7]。目前,已建立了多种检测TC的方法,如高效液相色谱法^[8]、高效液相色谱-质谱法^[9,10]、电化学法^[11]、酶联免疫吸附法^[12]、表面增强拉曼光谱法^[13]等。虽然这些方法具有较高的灵敏度和准确性,但由于检测成本高、周期长、操作复杂等问题导致难以建立广泛的TC监测网络。为了解决这一问题,首要任务是开发一种高效、快速且简便的TC检测方法。

荧光测定法(fluorometry)作为一种新型检测方法,在过去20年中引起了广泛关注。由于荧光测定法具有灵敏度高、预处理简单、成本低等优点,在分析检测领域得到了快速发展^[14]。在众多荧光传感材料中,碳点(carbon dots, CDs)是一种新兴的纳米荧光材料,它具有易制备、低成本、低毒性、高抗光漂白性、良好的生物相容性和可分散性等优点,因此,在基于荧光测定法的抗生素检测中崭露头角。到目前为止,基于CDs的抗生素荧光传感器多有报道^{[5,15,⇓,⇓,⇓-19]},例如Wang等^[5]以葡萄糖和乙二胺为原料通过水热法制备高发光氮掺杂CDs,用以检测3种四环素类抗生素,检出限为0.117~0.344 μmol/L;将此方法应用于血清和牛奶样品中3种四环素类抗生素的检测,回收率为96.5%~119.8%。再如Yan等^[18]在室温下以乙二醛为碳源,邻苯二胺为碳氮源简便合成了发黄绿色荧光的CDs,该方法已成功用于测定四环素片中TC的含量。此外,Nie等^[19]合成了荧光CDs并将其与铕离子(Eu³⁺)螯合,实现了对TC的定量分析,检出限低至16.4 nmol/L,将该CDs用于实际环境水样中TC的分析,其回收率为95.7%~109.8%。然而,大多数报道中CDs制备过程相对复杂,产率低,不利于CDs作为荧光传感器在实际工作中的大范围应用。

本文以丙三酸(tricarboxylic acid)与乙二胺(ethylenediamine)为前驱物,采用一步气流辅助熔融态聚合法合成了具有蓝色荧光的TE-CDs。通过分散与反相沉淀,便可实现TE-CDs与杂质的快速分离与纯化。制备过程操作简单,周期短,所制备的TE-CDs具有良好的水溶性与荧光稳定性。因TE-CDs对TC响应灵敏,将此方法用于检测医疗废水中TC的残留, 结果表明该方法具有实用性,在辅助构建大范围TC监测网络领域具有较大潜力。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SRJK-2-13高温燃烧管式炉(天津市泰斯特仪器有限公司); ME104电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司); DZF-6020真空干燥箱(昆山一恒仪器有限公司); SK250H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司); F-4600荧光分光光度计(日本日立高新技术公司); TU-1901双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司); FEI Tecnai F20透射电子显微镜(美国FEI公司); INVENIO S红外光谱仪(德国布鲁克公司); X射线衍射仪(荷兰帕纳科公司); X射线光电子能谱仪(美国Thermo Scientific K-Alpha公司)。

丙三酸、四环素、磺胺噻唑(STZ)、磺胺多辛(SD)、磺胺甲噁唑(SMZ)、利奈唑胺(LZ)、氯霉素(CPL)(上海麦克林生化科技股份有限公司),乙二胺(国药集团化学试剂有限公司),甲醇、二氯甲烷(广东光华科技股份有限公司),碳酸氢钠、硫酸钠、氯化铵、氯化钙、氯化钾、葡萄糖(天津市科密欧化学试剂有限公司),乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠、氯化锌(上海阿拉丁生化科技股份有限公司),氯化镁(上海迈瑞尔生化科技有限公司),氯化铝、氯化铜、甘氨酸、组氨酸(阿法埃莎(中国)化学有限公司),所有试剂均为分析纯,使用前不进行任何处理。

1.2 TE-CDs制备

TE-CDs采用气流辅助熔融态聚合法合成。首先,称取1.76 g丙三酸,加入0.72 g乙二胺,搅拌研磨混合,将混合物转移至石英舟中,随后放入高温管式炉,以100 cm³/min的流速通入高纯N₂,保持15 min后开始升温。在230 ℃下煅烧2 h,冷却后得到固体块状的产物。将所得固体块状产物研磨成粉末,依次加入5 mL甲醇并搅拌30 min、加入5 mL二氯甲烷并搅拌30 min,过滤,使用5 mL二氯甲烷将沉淀物洗涤3次。最后在60 ℃下真空干燥6 h,即可得到纯化后的TE-CDs固体粉末(约1.73 g),产率约为70%。

1.3 TE-CDs检测TC

移取1 mL TE-CDs溶液(1 mg/mL)至比色皿中,分别添加质量浓度为0~200 mg/L的TC溶液1 mL, 反应20 s后,测其发射光谱(激发波长为368 nm),荧光强度记作F,不添加TC时记为F₀,平行测定3次取平均值,依据F/F₀与TC浓度的线性关系绘制标准曲线。

1.4 样品的收集与处理

医疗废水取自大连医科大学附属第二医院,收集后,采用定性滤纸过滤3 L废水样品以去除颗粒物,并加入15 g NaCl,利用钌钛电极在15 V的恒定电势下进行电催化氧化。取电解后的1 L废水,加入2.0202 g Na₂SO₃中和余氯。处理后的水样均在室温下储存。考虑到医疗废水中存在的金属离子会与目标抗生素螯合^[20,21],在水样中加入0.5 g/L EDTA释放目标抗生素。

2 结果与讨论

2.1 TE-CDs的制备及表征

目前,CDs的合成方法主要为自下而上的水热/溶剂热法等,如Jia等^[22]采用一锅水热法制备N-CDs的过程中,首先在高压反应釜中进行反应,随后经过过滤、透析、冷冻干燥处理最终得到N-CDs固体粉末,制备过程繁琐耗时。本研究所制备的TE-CDs采用气流辅助熔融态聚合法,即在持续通入N₂的环境中对前驱物进行熔融态聚合,即可获得TE-CDs粗产物。经过简单的共分散与沉淀,即可实现TE-CDs与杂质的快速分离纯化。TE-CDs的产率达到了70%。整个制备过程操作简单、周期短、能耗低、产率高,有利于使用TE-CDs荧光传感器建立大范围TC监测网络。

TE-CDs的透射电镜(TEM)如图1a所示,分散性较好,无明显晶格条纹,尺寸分布范围为1.6~3.2 nm,平均直径为(2.43±0.48) nm(图1b)。TE-CDs的X射线衍射(XRD)如图2a所示,在2θ=19.7°左右出现一个宽的衍射峰,表明所制备的TE-CDs具有无定形碳的结构^[23]。

图1. TE-CDs的(a)TEM图和(b)直径分布.

图2. TE-CDs的(a) XRD图和(b)红外光谱图.

红外光谱(IR)显示(图2b), TE-CDs在3368 cm^-1处呈现O-H和N-H伸缩振动峰,2934 cm^-1、3073 cm^-1处的峰值归因于C-H的振动,1705 cm^-1处的强峰归属于C=O键的伸缩振动,1676 cm^-1处的吸收峰是由C=C键的伸缩振动引起,1182 cm^-1、1105 cm^-1处分别为C-O、C-N的伸缩振动峰^[24]。

为了进一步探究TE-CDs的化学构成和表面化学性质,对TE-CDs进行X射线光电子能谱(XPS)表征。如图3a所示,TE-CDs全谱图中,C 1s、N 1s和O 1s含量分别为67.96%、12.58%、19.46%。对XPS全谱图进行分峰,TE-CDs的C 1s分峰拟合图如图3b所示,键能分别为284.80、285.79和288.04 eV,分别对应C-C/C=C、C-N/C-O及C=O/C=N。N 1s的分峰拟合图如图3c所示,键能分别为399.49、400.22 eV,分别对应C-N、N-H。O 1s的分峰拟合图如图3d所示,键能分别为531.19、532.51 eV,分别对应C-O、C=O^[25,⇓-27]。

图3. TE-CDs的(a)XPS全谱图和(b)C 1s、(c)N 1s、(d)O 1s峰拟合图.

IR与XPS结果表明,TE-CDs表面富含氨基、羟基和羧基等亲水基团,说明TE-CDs具有良好的水溶性,有利于实现对医疗废水中TC的检测。

2.2 TE-CDs的光学性质

为探究所制备TE-CDs的光学性质,分别测定了TE-CDs的紫外可见吸收光谱和荧光光谱。如图4a插图所示,TE-CDs溶液呈无色透明态,在365 nm紫外灯照射下呈现明亮的蓝色荧光。如图4a所示,质量浓度为500 mg/L的TE-CDs在紫外吸收区呈现出明显吸收峰,可归因于TE-CDs内部的π-π^*跃迁^[5,13,28,29]。当激发波长由300 nm增加至400 nm时,与大多数已报道文献类似^[1,29,30], TE-CDs发射光谱表现出激发波长依赖性。发射峰出现蓝移和红移现象且荧光强度呈现不同程度的降低,在激发波长为368 nm处荧光强度最大,发射波长为448 nm,如图4b所示,可能是由于表面缺陷及纳米颗粒尺寸变化所致^[31,32]。因此本研究选取激发波长为368 nm、发射波长为448 nm进行后续实验。此外,考察了存储时间对TE-CDs荧光稳定性的影响,如图4c所示,在室温条件下储存10天内,TE-CDs荧光强度无明显变化,显示出较优的稳定性。

图4. (a)TE-CDs的紫外-可见吸收光谱、荧光激发和发射光谱 (插图:可见光和紫外灯照射), (b)不同激发波长下TE-CDs的荧光强度,(c)TE-CDs的荧光稳定性(n=3).

2.3 TC的荧光响应

考察了响应时间与pH对TE-CDs荧光响应的影响。首先测定了TE-CDs对TC的响应时间,如图5a所示。在添加5、20、50、70 mg/L 4个水平的TC后,TE-CDs (500 mg/L)的荧光立即表现出明显淬灭,并在之后10 min内荧光强度保持稳定。为了保证检测体系的稳定性,选用20 s作为响应时间。随后考察了pH对TE-CDs荧光强度的影响,如图5b所示,在pH 3~11范围内,TE-CDs荧光强度变化较小,因此,选用pH=7进行实验。如图5c所示,在TE-CDs水溶液(500 mg/L)中加入不同质量浓度的TC(2~200 mg/L), TE-CDs荧光强度逐渐下降至完全淬灭。图5d考察了F/F₀比值与TC质量浓度的线性关系,在4~20 mg/L的TC质量浓度范围内,F/F₀比值与TC质量浓度([TC])呈良好线性,如图5d插图所示,两者的线性方程为F/F₀=-0.0199[TC]+0.9565,相关系数(R²)=0.9978。同时,基于3σ/S(σ是空白样品的标准偏差,S是工作曲线的斜率)计算,TE-CDs作为荧光传感器时TC的检出限为0.2 mg/L。

图5. (a)TE-CDs孵化时间及(b)pH对TE-CDs荧光强度 (n=3)的影响,(c)TC与TE-CDs淬灭关系图,(d)相对荧光强度与TC质量浓度线性关系(n=3).

为了测试TE-CDs是否可以用于医疗废水中TC的测定,选取实际水样中可能存在的潜在干扰物,包括SD、SMZ、STZ、LZ、CPL以及医疗废水中可能共存的 ${{\mathrm{H}\mathrm{C}\mathrm{O}}_3}^{-}$ 、 ${{\mathrm{S}\mathrm{O}}_4}^{2-}$ 、 $\mathrm{N}{{\mathrm{H}}_4}^{+}$ 、Ca²⁺、K⁺、Al³⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Na⁺、葡萄糖、组氨酸、甘氨酸。如图6所示,在TE-CDs的水溶液中加入100 mg/L的干扰物质,TE-CDs荧光强度没有发生明显变化。但在干扰物与TC共存的条件下,TE-CDs的荧光明显淬灭。这一结果表明,TE-CDs作为TC检测的荧光传感器具有良好的选择性和抗干扰性。

图6. 不同干扰物质对TC淬灭TE-CDs的影响(n=3).

另外,如表1所示,本方法的分析性能与已报道的检测方法相当,且具有制备材料成本低、制备过程简便、省时等优点,表现出应用于检测实际环境水样中TC含量的潜力。

表1.

采用不同碳点的荧光分析法对TC检测效果的对比

CDs	Preparation method and time	Linear range/ (mg/L)		LOD/ (mg/L)	Ref.
N-CQDs	hydrothermal, 52 h	0	-44	0.2	[5]
N-CQDs	hydrothermal, 6 h	0.2	-222	0.07	[6]
Cu-CDs	solvothermal, 27 h	0.9	-14	0.08	[33]
N,S-CDs	hydrothermal, 8 h	0.04	-28	0.02	[34]
TE-CDs	flow-assisted melt	4	-20	0.2	this
	polymerization, 2 h				work

N-CQDs: nitrogen-doped carbon quantum dots; Cu-CDs: copper-doped carbon quantum dots; N,S-CDs: nitrogen and sulfur co-doped carbon dots.

2.4 TE-CDs对TC响应的机制

为了明确TE-CDs对TC的响应机制,对加入TC前后TE-CDs的紫外可见吸收光谱、荧光寿命及液体核磁共振变化情况进行分析。如图7a所示,TE-CDs与TC吸收峰位置没有发生变化,仅为吸光度值叠加,表明并无新物质生成。此外,通过测量加入TC前后TE-CDs的荧光寿命,如图7b所示,TE-CDs及TE-CDs+TC的荧光寿命分别为12.60 ns和11.11 ns,表明荧光寿命发生了衰减,推测淬灭机制可能为动态淬灭。为了进一步证明这一推论,利用¹H NMR分析了TC加入前后TE-CDs中质子峰的变化情况。如图7c所示,TE-CDs中的质子信号并没有因为TC的存在而发生移动,表明TE-CDs与TC没有发生相互作用,证明TC对TE-CDs的荧光淬灭机制为动态淬灭^[6,35,36]。

图7. (a)加入TC前后TE-CDs的紫外吸收光谱、(b)荧光寿命与(c)¹H NMR对比图.

2.5 实际医疗废水中TC的检测

为了评估所建立方法的可行性,对医疗废水中的TC进行检测,结果表明在实际医疗废水中并未检测到TC。向水样中分别加入5、10、15 mg/L的TC进行加标回收测试。检测结果如表2所示,使用基于TE-CDs的荧光测定法得到的TC加标回收率为96.5%~119.8%,相对标准偏差(RSD)为0.8%~2.6%。结果表明,TE-CDs可以作为荧光传感器用于医疗废水中TC的检测,具有良好的实际应用价值。

表2.

TC在医疗废水中的加标回收率和相对标准偏差(n=3)

Spiked/ (mg/L)	Found/ (mg/L)	Recovery/%	RSD/%
0	0	-	-
5	4.8	96.5	1.1
10	11.3	113.2	2.6
15	18.0	119.8	0.8

3 结论

本文建立了基于TE-CDs的TC检测方法。以丙三酸与乙二胺为前驱物,采用气流辅助熔融态聚合法高效合成了具有蓝色荧光的TE-CDs。通过实验证明了TE-CDs作为荧光传感器对TC具有良好的选择性和传感检测能力。将该方法应用于实际医疗废水中TC的检测,结果表明所建立的TC检测方法具有简便、快速及成本低等优点,可为开发大范围TC监测体系提供新思路。