模拟微环境的肿瘤类器官在肿瘤免疫治疗基础和临床研究中的应用

Abstract

免疫治疗为抗肿瘤治疗带来了突破性进展，但肿瘤免疫治疗仍存在受益人群比例低、缺乏有效的治疗反应预测平台等临床关注的重要问题，类器官技术为此提供了一种新的解决方案。类器官是一种具有特定结构的三维组织培养物，通常来源于成体干细胞或多能干细胞，能够高度模拟原生器官的结构和生物学特性，尤其在模拟肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)上显示出了巨大潜力。肿瘤类器官可通过保留各种免疫细胞在内的内源性基质成分，或者通过添加免疫细胞、癌症相关成纤维细胞等策略，有效地模拟TME，为免疫治疗效果的预测、过继细胞治疗的评价和个体化治疗患者的选择提供了新的平台。总结模拟微环境的肿瘤类器官的构建策略，了解其在免疫治疗基础研究和临床应用中的进展，将会为肿瘤免疫治疗的发展提供新思路。

以免疫检查点阻断剂(immune checkpoint blockade，ICB)和嵌合抗原受体T细胞疗法(chimeric antigen receptor T，CAR-T)为代表的肿瘤免疫治疗为恶性肿瘤的治疗带来了革命性的改变。尽管如此，在临床实践中，仍有大量肿瘤患者对免疫治疗反应并不理想。因此，揭示免疫治疗的耐药机制、探究新的潜在免疫治疗靶点、研发新型免疫治疗药物，以及优化免疫治疗与传统治疗的联合方案是当前免疫治疗基础和临床研究的前沿和热点^[1]。

免疫治疗耐药的机制与多种因素密切相关，包括肿瘤细胞本身的基因组不稳定性、免疫治疗靶点的表达水平以及肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)的特征等。深入解析不同肿瘤的TME是理解肿瘤免疫机制和开发新型免疫疗法的关键。TME是一个由肿瘤细胞、血管和淋巴网络、成纤维细胞、免疫细胞、细胞外基质以及多种信号分子共同构成的复杂生态系统^[2]。TME中细胞之间的相互作用显著影响着肿瘤的进展和对免疫治疗药物的反应。然而，缺乏恰当的研究模型一直是深入解析TME的障碍。传统的体外细胞培养及患者来源的异种移植(patient-derived xenograft，PDX)模型难以模拟实体肿瘤TME的时空特征和细胞间相互作用。因此，迫切需要开发并建立具有临床相关性的TME研究模型。近年来，肿瘤类器官技术的出现和发展给TME和免疫学研究带来了新的希望。

类器官是在体外三维(three dimensional，3D)环境中生长和分化的细胞团，能够模拟体内器官的结构和功能。类器官中的细胞主要来源于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)、诱导产生的多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSCs)或新生儿成体干细胞(adult stem cell，ASC)^[3]。肿瘤类器官，作为类器官的一个衍生分支，现已广泛应用于肿瘤模型的建立。与传统的肿瘤二维(two dimensional，2D)细胞模型和动物模型相比，肿瘤类器官不仅能够在模型中体现患者特异性，还能维持其亲本肿瘤的关键遗传特征和表型特征，而且与肿瘤动物模型相比操作更加简便^[4]。因此，肿瘤类器官技术已在模拟信号传导、药物筛选开发和肿瘤发展机制研究等领域中得到广泛应用^[5]。作为一种新兴的体外模型，深入探讨肿瘤类器官与免疫细胞共培养模型的应用，在理论和临床层面具有深远的意义和广泛的应用前景。

1. 用于免疫治疗研究的肿瘤类器官培养技术

目前，已有多种肿瘤类器官共培养策略用来模拟肿瘤免疫微环境，从而建立“免疫-肿瘤类器官”模型(表1和图1)。

表1.

不同类器官共培养体系的特点

Table 1 Characteristics of different organoids co-culture systems

特点	直接共培养法[25-27]	微流控3D培养法[19, 28]	ALI培养法[29]
培养装置	细胞培养板	3D微流控培养装置	Transwell板
培养方式	浸没基质胶法培养类器官	将细胞-胶原混合物注入微流控装置的中央凝胶腔室，培养基被添加到两端的灌注通道中	肿瘤组织碎片与胶原蛋白混合铺于小室内，将培养基加入外培养皿中，顶部暴露在空气中
培养中保留的细胞成分	肿瘤细胞	肿瘤细胞、肿瘤浸润性髓系细胞和淋巴细胞	肿瘤细胞、天然免疫细胞(T细胞和B细胞、骨髓细胞、巨噬细胞和NK细胞)和基质成纤维细胞
共培养系统重建免疫TME的方法	先培养肿瘤类器官，再与免疫细胞共培养	免疫细胞添加到培养基中，注入 微流控装置中	原代组织的免疫微环境直接重建
优点	1)易于富集和扩增肿瘤类器官 2)可涵盖原始肿瘤的遗传和形态学改变	1)细胞有序排列，能模拟器官的生理结构 2)方便外源物质的加入，方便观察外源物质与靶细胞的相互作用	1)概括原始肿瘤的遗传和形态学改变 2)在TME中保留多种免疫细胞和成纤维细胞 3)可研究肿瘤与免疫相互作用
缺点	缺乏天然免疫和基质成分；仅能通过外源性添加TME	尺寸限制；需要专门的设备	类器官体积均一性偏低；仅限于天然肿瘤浸润免疫细胞

ALI：气液相界面；TME：肿瘤微环境；NK：自然杀伤；3D：三维。

图1.

模拟肿瘤微环境的类器官培养策略

Figure 1 Organoid culture strategies for modeling tumor microenvironment

NK: Natural killer; DC: Dendritic cells; CAF: Cancer-associated fibroblasts.

1.1. 浸没基质胶培养

浸没基质胶的类器官培养技术是目前应用最广泛的方式。这种方法可追溯至Sato等^[6]在体外成功培养小鼠肠道类器官的开创性工作。随后，浸没基质胶的类器官培养方法被用于建立患者来源的肿瘤类器官(patient-derived tumor organoids，PDTO)，包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌等多种不同类型的癌症^[7]。这种方法首先将新鲜肿瘤组织消化为单细胞悬液，随后将细胞悬液包埋在细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中，并根据不同肿瘤组织的来源，添加不同的生长因子或者通路抑制剂到培养基中。通常，培养基中需要包含Wnt3a、R-spondin、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和Noggin等成分，这些生长因子有助于具有干细胞特性的细胞维持自我更新和分化^[8-9]。尽管浸没基质胶的肿瘤类器官培养可以很好地维持其亲本肿瘤的关键遗传和表型特征，但是这种方法仅能富集上皮肿瘤细胞，无法保留肿瘤基质细胞成分^[6]。为了更真实地模拟肿瘤的免疫微环境，需要引入免疫细胞进行共培养。Chakrabarti等^[10-11]通过使用基质胶培养小鼠胃癌类器官，外源性添加从小鼠骨髓和胸腺中分离出来的树突状细胞(dendritic cell，DC)及细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)，构建共培养模型。研究^[10-11]发现Hedgehog信号通路的激活诱导了胃癌中程序性细胞死亡配体-1(programmed death ligand-1，PD-L1)的表达和肿瘤细胞的增殖。进一步在抗PD-L1抗体存在的条件下，通过电转染肿瘤抗原激活DC和CTL后，与类器官建立更复杂的共培养体系，发现激活的CTL促进胃癌类器官的凋亡^[10-11]。这些发现为研究肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用提供了一个高相关性的平台，并且为探索TME中细胞通信的机制和开发新的免疫治疗策略奠定了基础。此外，基质胶类器官培养技术在很大程度上依赖于从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的基质胶(Matrigel)，该基质胶由层粘连蛋白和胶原蛋白IV组成，已成功用于多种类器官的培养^[12]。但是，由于基质胶存在批间差异和安全性问题，研究人员正在积极探索使用合成的水凝胶作为其替代品^[13]。水凝胶是一类亲水性的交联聚合物，可构成与目标器官相似的体内生态环境，为类器官中细胞的生长和分化提供支持。目前，已有多项研究^[14-15]使用胶原蛋白水凝胶或纳米纤维水凝胶系统培养正常组织类器官及肿瘤类器官。此外，通过将生长因子和细胞因子共价结合到水凝胶网络中，可实现这些生物活性分子在特定的时间和空间内的控制性释放，从而进一步精确塑造类器官微环境^[16]。尽管如此，水凝胶系统在机械性强度和长期稳定性方面仍然有待提升。未来，需要更多的研究来优化水凝胶的特性，以实现对类器官长期培养和分化的稳定支持。

1.2. 微流控类器官芯片3D培养

在传统的浸没基质胶类器官培养系统中，营养物质和代谢废物的交换主要依赖被动扩散。然而，随着类器官体积增大，这种依赖被动扩散运输营养物质的方式显示出其局限性。相比之下，微流控技术能够解决这一问题，它能够模拟组织内的循环系统，为类器官提供恒定且充足的营养和氧气，从而提供一个更稳定的生长环境^[17]。该技术通过微纳加工的方式对微米级别的流体进行空间的控制。具体而言，它将数量有限的肿瘤细胞高密度种植在包含微孔的微流控芯片中，用以培养类器官，从而实现研究系统的微型化和集成化。这种方法可提高类器官模型的均匀性和可控性，而且展现出在高通量筛选和分析中的应用潜力。微流控芯片的制作材料主要包括聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)及水凝胶等。其中，PDMS由于具有良好的透气性，生物相容性以及易加工的特性，被广泛应用于微流控芯片的制造。

目前已开发多种微流控类器官平台，这些平台在模拟体内环境和进行药物筛选方面展示出显著的优势。Schuster等^[18]开发了一种强大且简化的自动化微流控平台。该平台由集成设备构成，包括3D培养室设备、多路复用流体控制设备、自动化的定制软件以及活细胞延时荧光显微镜，可实现在动态灌注条件下，对包括正常结肠组织、胰腺导管腺癌组织等多种类型的组织进行高通量的类器官培养。在药物敏感性检测应用中，该团队开发了一种高通量检测方法，专门用于评估化学治疗药物对胰腺导管腺癌类器官的生长和细胞凋亡的影响。与浸没基质胶培养不同，该平台可实现在单药和联合用药的情况下，按照预先设定的时间，对多个不同类器官同时进行平行对照检测，大大减少了费力的移液步骤和人为操作错误。此外，该平台还可持续进行类器官的实时成像。因此，这一微流控平台为测试数千种药物组合提供了一个很好的解决方案，在免疫治疗药物开发和个性化治疗筛选上展现出良好的应用前景。Choi等^[19]报道了一种使用软光刻技术制作的微流控装置。通过对比发现，该微流控技术培养的类器官在基因表达图谱上与浸没基质胶培养的类器官非常类似。与浸没基质胶类器官培养方法不同的是，该微流控装置仅需在培养基中添加1%的基质胶，就能保证3D球状体大小的均匀分布，以及对单个类器官进行长时间的跟踪。在进一步的实验中，研究人员使用该微流控装置，在三特异性抗体杀伤器(tri-specific killer cell engagers，TriKEs)存在的条件下，共培养自然杀伤(natural killer，NK)细胞和肿瘤类器官。使用SYTOX橙色荧光染料精准追踪肿瘤细胞的死亡，并每隔24 h测量肿瘤类器官直径的变化。结果显示：在TriKEs作用下，可有效提升NK细胞对肿瘤类器官的溶解活性。此结果说明微流控技术在免疫治疗预测中的实用性及潜在应用价值，为未来的个性化免疫治疗的发展提供了新的技术手段。

在传统基质胶类器官培养体系中，由于缺乏生物机械力(如肠道蠕动、心脏收缩、呼吸运动等)，可能会对细胞和组织的正常生长造成不利的影响。为了克服这一挑战，Fang等^[20]开发了一种创新的微流控平台。该平台由微孔列阵和一个平行的压力通道构成，在PDMS膜上培养结肠癌类器官之后，通过调节微孔周围的气道内部气压，引起微孔周期性形变，从而对孔内结肠癌类器官施加周期性收缩与舒张力，模拟肠道蠕动的效果。在给予8%的振幅机械刺激后，结肠癌类器官中富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，LGR5)及Ki67的表达水平上调。提示模拟肠道蠕动的机械刺激可能增强了结肠癌类器官的分化潜力和增殖能力。此外，这种动态培养方法为结肠癌类器官提供了力学特性可变的TME，拓展了人们对TME力学特性的理解，有望为结肠癌免疫逃逸和治疗抵抗研究提供新的思路。总而言之，微流控类器官技术通过可控地构建组织细胞微结构，塑造与生物学特征相似的免疫微环境，弥补了基质胶类器官模型相对不稳定的缺陷，为肿瘤免疫学研究提供了稳定且重复性高的临床前模型。

1.3. 气液界面培养

前2种共培养模型需要通过外源性补充免疫细胞，而气液界面(air-liquid interface，ALI)培养法可维持天然的肿瘤免疫细胞和成纤维细胞基质，无需重建，因此ALI法培养的类器官基本保留了肿瘤天然的遗传背景^[21]。2009年，一种使用ALI系统培养小鼠肠上皮类器官的方法被首次报道^[22]。ALI系统由上室和下室组成，将剪碎的组织碎片和基质胶混合后，在Transwell上室中进行培养，通过3D基质胶诱导细胞-细胞和细胞-基质的相互作用。凝胶的顶部暴露在空气中，形成关键的气液交互界面。与此同时，在下室中添加含血清的基础培养基，周围的基质细胞为类器官的生长提供了支持，无需添加其他的生长因子。这个系统能更好地模拟体内肿瘤的生存环境，并保留原始肿瘤的病理学和遗传学特征。研究^[23]使用ALI技术培养42例手术切除的肾透明细胞癌组织样本。免疫组织化学染色和RNA测序结果证实：与肿瘤组织相比，ALI培养的肿瘤类器官保留了原有复杂的组织结构和细胞(包括免疫细胞和基质细胞)组成。由此看来，ALI培养的类器官在模拟TME中具有显著优势，在免疫治疗研究中具有广阔的应用前景。另外，Finnberg等^[24]为了评估ALI法培养的类器官模拟TME的能力，对ALI法培养8 d的结肠癌类器官进行免疫细胞检测，结果发现：与培养初期相比，类器官中CD45⁺细胞含量无明显变化，但CD3⁺细胞数量显著减少。这表明ALI法可维持一个相对稳定的免疫微环境，但是某些免疫细胞可能无法长时间地维持其数量和功能。总而言之，ALI培养为类器官建模提供了一种整体的策略，尤其是在肿瘤免疫治疗预测研究中，展现出一个相对可行且临床相关的分析模型。

2. 利用肿瘤类器官重建TME的方法

2.1. 添加免疫成分

在TME中，存在多种关键的免疫细胞，主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞和树突状细胞等。目前，肿瘤类器官与免疫细胞共培养的一种主要方法是在浸没基质胶培养类器官的基础上，额外添加免疫细胞。Dijkstra等^[25]开发了1种共培养系统，该系统在白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)存在的条件下，通过每周2~3次用抗CD28和抗程序性死亡蛋白-1(programmed death-1，PD-1)抗体刺激，对外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)进行活化，可有效诱导肿瘤反应性CD8⁺ T细胞的生成，这些活化的T细胞进一步与经干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)预处理的肿瘤类器官单细胞悬浮液混合培养，建立免疫-肿瘤类器官共培养模型。Forsythe等^[30]则采用了不同的方法，他们将患者的PBMC、脾或淋巴结细胞以1꞉1至1꞉10的不同比例与肿瘤细胞混匀；然后，使用水凝胶重悬，并在96孔板中进行共培养。这一策略不仅提高了操作的灵活性，而且在培养7 d后，CD8⁺ T细胞的存活率仍有96.3%。这些研究为对免疫治疗耐药的患者提供了新的希望，通过构建复发前后的离体预测平台，能够更加精确地评估免疫治疗的效果，为个体化医疗提供强有力的工具。

另外，为了优化共培养的方法和最佳培养基，研究人员进行了广泛的探索，尝试了许多不同组合的新方法。在传统浸没式基质胶法中，类器官通常在70%的基质胶环境中生长，原则上培养基的成分可以穿透基质胶，模拟体内营养环境，被类器官所吸收。而实际上，免疫细胞很难穿过基质胶与肿瘤类器官进行互作。研究^[31]将胆管癌类器官和PBMC培养在含有10%的基质胶的培养基中，在这种环境中类器官可以保持3D形态，同时允许PBMC与类器官的聚集和相互作用。进一步优化共培养条件时发现，去除培养基中烟酰胺可减弱其对T细胞的抑制作用，而补充10%人血清有利于PBMC的培养，且对类器官的生长与活力无负面影响。这些直接通过添加免疫成分建立的免疫-肿瘤类器官共培养模型显著推进了免疫治疗效果预测的转化研究，尽管它们在临床应用方面仍面临一些挑战，例如存在培养时间较长、免疫成分类型过于单一等问题。未来还需要进一步优化这些模型，缩小与临床应用之间的差距。

另外一种类器官与免疫细胞共培养的方法是直接保留肿瘤类器官中的内源性免疫细胞。ALI培养系统凭借独特的气液界面设计，能够有效地维持天然基质和免疫成分，为在体外模拟TME提供了一个强有力的平台。这种方法可直接利用肿瘤组织中内源性免疫细胞复现TME的复杂性。该培养系统下培养的肿瘤类器官不仅包括成纤维细胞、多种免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、辅助性T细胞(T helper cell，Th)、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)、B细胞、NK细胞等，而且肿瘤上皮及其基质成分可保持长达30 d^[21]。此外，使用ALI法培养的PDTO还可以保留原始肿瘤组织的T细胞受体(T cell receptor，TCR)谱，与原代癌组织中检测到的T细胞表型类似，表明ALI法培养的PDTO能够维持肿瘤的个体化免疫特征^[21]。Dijkstra等^[25]在评估免疫细胞ALI培养的肿瘤类器官中的存活时间时发现：人肺癌和结直肠癌类器官中内源性CD45⁺细胞群可存活超过10 d，但CD3⁺细胞数量明显减少。这表明随着时间的推移，ALI法培养的类器官中的免疫细胞成分会逐渐减少。因此，尽管该模型是目前最为贴近“真实世界”的培养体系，但其免疫成分不能长时间维持的局限性仍是领域内亟待解决的瓶颈问题。未来的工作需要集中在优化培养条件，以实现免疫细胞成分的长期稳定维持。

2.2. 添加成血管成分

在类器官培养过程中，广泛的细胞死亡和过早的细胞分化是影响类器官培养成功率的重要因素。这些挑战主要源于缺乏血管系统，因为它限制了氧气、营养物质和代谢废物向类器官中心区域的有效运输^[32-33]。为了克服这一限制，向类器官模型中添加成血管成分，可有效地延长培养时间，最终提高类器官的成熟度和复杂性。目前，促进类器官血管生成的常用策略是将类器官植入富含血管的动物组织中。将人多能干细胞(human pluripotent stem cells，hPSC)来源的脑类器官移植到成年小鼠大脑中，移植类器官与宿主之间实现了血管化、功能性神经元活动以及突触连接^[34]。这揭示了宿主脉管系统能广泛浸润到类器官中。但是体内移植成本高昂，且难以实现高通量应用。研究^[35]提出了一种新的体外血管化类器官的构建思路，即通过将中胚层祖细胞(mesodermal progenitor cells，MPC)与肿瘤类器官进行共培养，诱导体外血管化类器官的形成。此外，微流控技术也为在类器官中引入血管功能提供了可行性。一种使用环烯烃共聚物(cyclo-olefin copolymer，COC)制造的微流控芯片将人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)和成纤维细胞的混合物掺入类器官周围，并通过空气注入和水凝胶的推动，实现了微流体通道的连续灌注^[36]。这一流动条件促进了间充质细胞向血管状结构的分化，为血管化类器官的制备提供了一个简单且稳定的新方法。总之，保留脉管系统对于优化免疫-肿瘤类器官共培养模型的构建至关重要，使类器官在药物筛选、新治疗靶点的验证、治疗反应预测等方面展现出巨大的应用潜力。然而，开发更加均一，且临床相关的脉管灌注系统，以更好地模拟TME，仍是当前类器官模型面临的主要挑战。

2.3. 与癌症相关成纤维细胞共培养

在模拟TME的类器官模型中，外源的基质细胞扮演着至关重要的角色。这些细胞的主要作用是维持组织结构的完整性和功能平衡。在TME中，癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)是构成基质的主要成分，对肿瘤的发生和发展起着重要作用，包括对肿瘤细胞增殖及耐药的调控^[37]。目前，CAF与肿瘤类器官的共培养模型在多种癌症类型中成功建立，成为研究肿瘤-CAF相互作用和药物耐药的重要平台。Luo等^[38]通过利用水凝胶培养结肠癌类器官，并将CAF接种到类器官培养基中，建立CAF-肿瘤类器官共培养模型。利用RNA测序技术，他们发现共培养模型可有效地激活PI3K-Akt信号通路，这为深入研究肿瘤与CAF串扰作用提供了新的平台。此外，Schuth等^[39]采用另外一种方法，他们将胰腺导管腺癌类器官解离成单细胞悬浮液，并与CAF细胞按照1꞉1的比例重悬后，共同培养于含有基质胶和胶原蛋白的混合基质中，结果发现CAF可促进肿瘤类器官细胞的增殖，并且在化学治疗药物的作用下，单独培养的胰腺导管腺癌类器官可比CAF-类器官共培养模型诱导更多的细胞死亡。这些结果进一步展示了免疫-肿瘤类器官共培养模型在个性化体外药物测试中的潜在应用价值，也为揭示肿瘤- CAF相互作用机制、抗肿瘤药物耐药机制等方面提供了广泛的应用前景。为提高模型的临床相关性和预测准确性，未来还需要进一步优化类器官和CAF共培养条件，例如，如何获得具有稳定表型的CAF等以更精准地模拟TME，并指导个体化治疗策略。

3. 模拟微环境的肿瘤类器官在肿瘤免疫学 研究中的应用

3.1. 在免疫检查点抑制剂研究中的应用

靶向PD-1/PD-L1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)的免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor，ICI)在抗肿瘤治疗中显示出良好的临床疗效，但仍然有大量的肿瘤患者对ICI表现出抵抗。因此，临床上亟须建立可靠的体外模型来预测免疫治疗效果，并优化治疗方案。肿瘤类器官已在多项研究中证明可较准确地预测患者对抗癌药物的反应。Jeong等^[27]通过微流控装置建立了黑色素瘤与淋巴结/PBMCs共培养模型。该平台维持了患者的原始免疫系统，在PD-1及CTLA-4抑制剂的作用下，T细胞得到激活并形成对肿瘤新抗原的免疫记忆。这些经过激活的T细胞对同一患者的肿瘤类器官中的肿瘤细胞展现出有效的杀伤作用。通过该平台对PD-1抑制剂的疗效进行评估，结果与85%的临床反应吻合。除评估单药ICI疗效外，类器官免疫细胞共培养系统还可用于评估ICI与常规化学治疗或靶向治疗[例如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抑制剂]的联合治疗策略，从而实现个性化地优化每个患者的治疗方案^[40]。

免疫-肿瘤类器官共培养模型在揭示免疫治疗耐受机制的研究中同样发挥着重要作用。肿瘤免疫抑制微环境的形成是多种因素共同作用的结果，例如髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)的存在也是引起ICI耐药的潜在机制之一。Chen等^[41]的研究发现使用ALI法培养的结肠癌类器官模型中，对抗PD-1抗体治疗反应良好的类器官显示出较低水平的MDSCs。此外，研究^[41]还观察到活化的T细胞通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor，TRAILR)通路诱导MDSCs凋亡，而这一过程可被T细胞释放的I型干扰素(interferon I，IFN-I)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α所抑制。这些发现指出，通过调节MDSCs和T细胞之间的相互作用，可能开发出一种新的治疗策略来提高ICI的疗效。此外，Chakrabarti等^[42]使用CTLs、MDSCs与胃癌类器官共培养，当抑制人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)的表达时，类器官中PD-L1的表达水平随之降低，同时CTL的增殖增加，对肿瘤细胞的杀伤作用增强。这些结果表明，HER-2和PD-L1的高表达可能在肿瘤免疫逃逸发挥重要作用。这些研究强调了免疫-肿瘤类器官共培养模型在多个层面的潜在应用价值，不仅有助于体外筛选免疫治疗药物，还能预测免疫治疗疗效，揭示免疫耐药机制；为个体化医疗设计出更为精准和有效的治疗方案提供了有力的工具。

3.2. 在双特异性抗体研发中的应用

双特异性抗体(bispecific antibody，BsAbs)是一类新兴的免疫治疗药物，它们具有2个不同的抗原结合位点。例如，在肿瘤治疗中，BsAbs可以选择性地将T细胞或NK细胞募集到肿瘤组织，实现对肿瘤的精准打击^[43]。然而，传统的药物评估模型在预测正常组织对药物的反应方面往往存在局限性，尤其是在评估细胞间相互作用的影响时。Kroll等^[44]创建了1个免疫浸润的肾脏类器官微流控芯片模型，该模型能在PBMCs存在的情况下，对T细胞双特异抗体(T cell bispecific antibodies，TCBs)进行靶向RMF肽的评估，RMF肽源自肿瘤抗原肾母细胞瘤1(Wilms tumor 1，WT1)，并且通过双价T细胞受体样结合域在人类白细胞抗原(human leukocyte antigens-A2，HLA-A2)上呈递。这一模型为免疫治疗的临床前研究以及探索组织与免疫系统相互作用提供了可靠的平台。最近的研究^[45]通过流式细胞术分析，发现在培养滤泡状淋巴瘤类器官模型中CD4⁺ T细胞及CD8⁺ T细胞可维持21 d。使用CD19/CD3双特异性抗体处理后，研究人员观察到B细胞的杀伤作用及效应性T细胞和调节性T细胞扩增，这证实了淋巴瘤类器官在双特异性抗体的临床前评估以及研究耐药机制方面的巨大潜力。研究^[46]利用结直肠癌类器官与CD8⁺ T细胞共培养物体系，对双特异性抗体cibisatamab的耐药性和敏感性进行了深入的分析。Cibisatamab是1种可同时靶向T细胞上的CD3和肿瘤细胞上的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)的双特异性抗体。CEA在结直肠癌中高表达，使其成为理想的治疗靶点。该研究^[46]表明结直肠癌类器官在CEA表达上呈现出异质性和可塑性，这一发现对于理解肿瘤对cibisatamab产生耐药的机制尤为重要。特别是在CEA表达较低的肿瘤细胞中，Wnt/β-catenin信号通路活性增强，这可能与肿瘤细胞逃避免疫治疗的机制有关。基于这一发现，研究人员认为，通过联合使用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂，可能增强cibisatamab治疗的效果。这一策略不仅为克服肿瘤耐药提供了新的视角，也为开发更有效的联合治疗方案奠定了基础。这些研究强调利用类器官平台在抗肿瘤治疗研究中的重要性，不仅能加深对BsAbs药物治疗效果的理解，还有助于揭示肿瘤耐药性的分子机制，为未来开发新的联合治疗方案提供有力的科学依据。

3.3. 在过继细胞疗法评价中的应用

过继细胞疗法(adoptive cell therapy，ACT)是一种前沿的癌症治疗策略，其依赖于分离、体外扩增和激活具有抗癌活性的效应淋巴细胞。将这些经过特殊处理的淋巴细胞重新移植到癌症患者体内，可增强机体抗癌能力^[47]。目前，ACT已被广泛应用于多种癌症的治疗中。根据作用机制不同，ACT分为肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)依赖型和TAA非依赖型，主要包括嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)疗法、T细胞受体疗法(T cell receptor therapy，TCR-T)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)疗法及NK细胞疗法等^[48]。

CAR-T是一种细胞工程策略，通过改造患者自身的T细胞或来自健康供体的细胞，使其表达能够特异性识别癌细胞表面抗原的受体。这种改造后的T细胞通过毒性作用识别和清除癌细胞^[49]。鉴于缺乏有效的体外模型来评价CAR-T的效果，研究人员一直在探索肿瘤类器官是否可作为评价系统。近期的研究^[50]发现，通过培养HER-2阳性的结直肠癌类器官模型，并将其与抗HER-2的CAR-T共培养，可用于评估CAR-T与细胞凋亡拮抗剂抑制剂birinapant联合治疗的效果。通过TNF依赖性方式抑制这些类器官的生长，而单独使用CAR-T对肿瘤类器官的杀伤作用则相对较小。此外还在肿瘤类器官模型中验证了NK细胞免疫疗法的潜力。在结肠原代成纤维细胞存在的条件下，使用ALI法培养转移性结直肠癌类器官，针对新抗原/表皮生长因子受体III型突变体(epidermal growth factor receptor variant type III，EGFRvIII)的特异性嵌合抗原受体修饰的NK-92细胞(chimeric antigen receptor-engineered natural killer-92 cells，CAR-NK92)可有效杀死表达EGFRvIII的肿瘤类器官，但对正常组织的类器官无效^[51]。总之，肿瘤类器官特别是包含TME的肿瘤类器官模型，为评估ACT疗效提供了一个有效的体外平台。这些模型有助于人们理解免疫治疗方法的作用机制，并为未来的临床应用提供了重要的前瞻性信息。

目前，有研究^{[25, 52]}表明可利用类器官模型在体外产生大量的具有肿瘤反应性T淋巴细胞。Dijkstra等^[25]通过将结直肠癌和非小细胞肺癌类器官与自体PBMC共培养，成功地富集了肿瘤反应性T细胞。Meng等^[52]使用胰腺癌类器官和自体PBMC共培养2周，成功地驱动了CTL扩增。TCR测序的结果表明 T细胞数量显著扩增，并且这些扩增的T细胞在消灭自体肿瘤类器官方面显示出极高的效率。这些结果表明免疫-肿瘤类器官共培养模型可能在相对较短的时间内产生肿瘤反应性T细胞，为促进ACT的发展提供了坚实的基础。此外，该模型的应用为开发新的免疫治疗策略提供了有力的证据，有助于推动个性化医疗和精准治疗的进展。

3.4. 个性化治疗和新药研发中的作用

与传统模型相比，肿瘤类器官可更好地保持原始肿瘤组织的异质性，这使得它们在筛选抗肿瘤药物等方面展现出巨大潜力^[53]。Pauli等^[54]利用子宫肉瘤及结直肠癌类器官进行高通量药物筛选，鉴定出了有效的药物组合。Xiang等^[55]通过对免疫相关分子和潜在的靶向治疗进行跨数据库的分析，鉴定出25种潜在的化合物。其中，地塞米松因其具有同时抑制PD-L1和吲哚胺2, 3-双加氧酶1(indoleamine 2, 3-dioxygenase 1，IDO1)的潜力而备受关注。使用ICI和地塞米松处理类器官与PBMC共培养模型，可募集更多的CD3⁺ T细胞及CD8⁺ T细胞。这表明地塞米松可增加ICI治疗的敏感性。这一发现为未来癌症治疗策略提供了新的视角和潜在的治疗选择。

类器官免疫共培养模型因其能较好地保留原始免疫微环境，展现出作为精准治疗预测平台的巨大潜力，用于评估癌症患者对抗癌药物的反应性。Chakrabarti等^[56]先使用肿瘤抗原刺激树突状细胞，与CD8⁺ T细胞共培养以促进这些T细胞的增殖，然后建立这些激活的T细胞与胃癌类器官共培养模型，评估不同靶向药物的治疗敏感性。肿瘤类器官在预测癌症治疗药物的个性化治疗反应方面的研究正如火如荼地开展着，预计在不远的将来，随着高水平临床试验的开展，类器官技术会进一步地完善，最终使肿瘤患者受益。

4. 结语与展望

模拟微环境的肿瘤类器官技术为我们深入理解肿瘤免疫学提供了新的视角，并为实现更有效的精准医疗及个性化医疗提供一个有前景的平台。然而，这种方法仍处于较早期研发阶段，存在诸多技术挑战。与2D传统培养模型相比，基于类器官的体外建模方法需要消耗大量的时间和资源，包括材料和试剂。此外，类器官模型的培养成功率相对较低，目前平均成功率仅为36.8%^[54]。由于肿瘤来源的类器官不再处于原发肿瘤的缺氧或者免疫环境中，这可能会影响肿瘤细胞的克隆形成，导致在体外模型中出现克隆表达与体内实际情况不符。此外，类器官模型缺乏必要的免疫细胞、基质和血管支持，这些都是目前类器官模型需要克服的挑战。为应对这一挑战，目前已开发包含免疫细胞、血管系统以及CAF的共培养类器官模型。这些模型不仅能模拟TME中的肿瘤浸润和外周免疫细胞群，还能与来自PBMC或淋巴结的免疫细胞共培养，从而模拟肿瘤免疫过程，包括T细胞的增殖、激活以及对肿瘤细胞的识别和杀伤。这无疑加快了类器官在免疫学方面研究的脚步。然而，免疫-肿瘤类器官共培养模型中的异质性以及基质成分的维持需要进一步的优化和研究。

尽管存在诸多挑战，免疫-肿瘤类器官共培养模型在免疫治疗中的基础研究以及临床应用中展现出巨大的潜力，预示其有望成为个性化免疫治疗的重要工具，在未来肿瘤免疫治疗领域发挥关键作用。

基金资助

国家自然科学基金重点项目(82030087)；国家生物药技术创新中心“揭榜挂帅”技术攻关项目(NCTIB2022HS02007)；湖南省自然科学基金重大项目(2021JC0002)。This work was supported by the Key Project of National Natural Science Foundation (82030087), the Scientific and Technological Project “Open Bidding” of National Center of Technology Innovation for Biopharmaceutics (NCTIB2022HS02007), and the Major Project of Natural Science Foundation of Hunan Province (2021JC0002), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

李艺正 论文撰写与修改；孙仑泉 论文指导与修改；廖伟华 论文审阅。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2024081316.pdf