Abstract
目的
基于宏基因组学第二代测序（mNGS）技术, 分析烧伤脓毒症患者感染病原体的特征。
方法
该研究为回顾性观察性研究。2021年7月—2023年12月, 郑州市第一人民医院烧伤科收治109例符合入选标准的烧伤脓毒症患者, 其中男68例, 年龄57~92岁；女41例, 年龄48~83岁。采集患者住院期间的血液、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、痰液或其他液体标本, 分别进行微生物培养（86例患者）和mNGS技术检测（109例患者）。统计采用mNGS技术检测的送检标本类型及检出病原体的情况, 同时将患者分为入住重症监护病房（ICU）的ICU组（78例）和未入住ICU的非ICU组（31例）, 并对2组患者感染的病原体进行分析。另对同时进行mNGS技术检测和微生物培养检测的86例患者标本的病原体检出情况进行分析。
结果
采用mNGS技术检测的109份标本中, 血液标本42份、支气管肺泡灌洗液标本17份、痰液标本4份、脑脊液标本6份、脓液标本16份、组织液标本24份；共检测出39种病原体, 其中细菌13种、真菌12种、病毒10种、寄生虫2种、支原体2种；检出病原体的总体阳性率为88.99%（97/109）。检出率排前3位的革兰阴性菌依次是肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、假单胞菌, 排前3位的革兰阳性菌依次是肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌；检出率排前3位的病毒依次是人类疱疹病毒、巨细胞病毒、细环病毒；检出率排前3位的真菌依次是烟曲霉菌、白色念珠菌、黄曲霉菌。27例患者感染1种病原体, 45例患者感染2种病原体, 25例患者感染≥3种病原体。与非ICU组相比, ICU组患者检出的肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、假单胞菌、肺炎链球菌、烟曲霉菌、巨细胞病毒的占比均明显升高（χ2值分别为8.62、7.93、3.93、5.48、4.28、5.58, P < 0.05）。mNGS技术和微生物培养法检出的病原体中, 最常见细菌的是肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌, 最常见的真菌是曲霉菌属菌株和念珠菌属菌株。只能通过mNGS技术检测到的病原体有19种, 如分枝横梗霉菌、耶氏肺孢子菌、结核分枝杆菌、病毒等；无采用微生物培养法检测到而采用mNGS技术检测不到的病原体。与采用微生物培养法相比, 采用mNGS技术检出病原体的总体阳性率、细菌阳性率、真菌阳性率均显著升高（χ2值分别为45.52、5.88、4.94, P < 0.05）。采用2种检测方法同时报告阳性结果的患者占27.91%（24/86）, 采用mNGS技术检测结果为阳性而采用微生物培养法检测结果为阴性的患者占72.09%（62/86）。2种检测方法所得结果的一致性检验显示, 差异无统计学意义（κ=0.02, P > 0.05）。
结论
采用mNGS技术检测标本中病原体的阳性率高于采用常规微生物培养法, 且能检测到后者不能检出的病原体, 如分枝横梗霉菌、耶氏肺孢子菌、结核分枝杆菌、病毒等。采用mNGS技术检测有助于明确烧伤脓毒症患者感染病原体的种类, 为临床用药提供依据和指导。
Keywords: 烧伤, 感染, 脓毒症, 宏基因组学, 病原体
Abstract
Objective
To analyze the characteristics of infectious pathogens in burn patients with sepsis based on metagenomic next-generation sequencing (mNGS) technology.
Methods
This study was a retrospective observational study. From July 2021 to December 2023, 109 burn patients with sepsis who met the inclusion criteria were admitted to the Department of Burns of the First People's Hospital of Zhengzhou, including 68 males aged 57 to 92 years and 41 females aged 48 to 83 years. Blood, bronchoalveolar lavage fluid, cerebrospinal fluid, sputum, or other fluid specimens were collected from the patients during their hospital stay for microbiological culture (86 patients) and mNGS technology detection (109 patients). The types of specimens and pathogens detected by mNGS technology were counted. Patients were divided into intensive care unit (ICU) group (78 cases) who were admitted to the ICU and non-ICU group (31 cases) who were not admitted to the ICU, and the pathogens for infection in the two groups of patients were analyzed. In addition, the detection of pathogens in the specimens of 86 patients who underwent both mNGS technology detection and microbiological culture detection was analyzed.
Results
Among the 109 specimens detected by mNGS technology, there were 42 blood specimens, 17 bronchoalveolar lavage fluid specimens, 4 sputum specimens, 6 cerebrospinal fluid specimens, 16 pus specimens, and 24 tissue fluid specimens; a total of 39 pathogens were detected, including 13 bacteria, 12 fungi, 10 viruses, 2 parasites, and 2 mycoplasmas. The overall positive rate of pathogen detection was 88.99% (97/109). Ranked by the detection rate, the top three Gram-negative bacteria were Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Pseudomonas spp, the top three Gram-positive bacteria were Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, and Enterococcus faecalis; the top three viruses were human herpesvirus, cytomegalovirus, and circovirus; the top three fungi were Aspergillus fumigatus, Candida albicans, and Aspergillus flavus. Twenty-seven patients were infected with one pathogen, 45 patients with two pathogens, and 25 patients with three or more pathogens. Compared with those in non-ICU group, the proportions of Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas spp, Streptococcus pneumoniae, Aspergillus fumigatus, and cytomegalovirus detected in the patients in ICU group were significantly higher (with χ2 values of 8.62, 7.93, 3.93, 5.48, 4.28, and 5.58, respectively, P < 0.05). In the pathogens detected by mNGS technology and microbiological culture method, the most common bacteria were Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumannii, and the most common fungi were strains of Aspergillus and Candida. There were 19 pathogens those could only be detected by mNGS technology, such as Lichtheimia ramosa, Pneumocystis jirovecii, Mycobacterium tuberculosis, viruses, etc.; there were no pathogens detected by microbiological culture method that couldn't be detected by mNGS technology. Compared with those detected by microbiological culture method, the overall positive rate, bacterial positive rate, and fungal positive rate detected by mNGS technology were significantly increased (with χ2 values of 45.52, 5.88, and 4.94, respectively, P < 0.05). The 27.91% (24/86) of patients were detected positive by both methods, and 72.09% (62/86) of the patients were detected positive by mNGS technology but negative by microbiological culture method. The consistency test of the results obtained by the two detection methods showed that the difference was not statistically significant (κ=0.02, P > 0.05).
Conclusions
The positive rate of pathogen detection in specimens using mNGS technology is higher than that detected by using conventional microbiological culture method, and it can detect pathogens those cannot be detected by the latter, such as Lichtheimia ramosa, Pneumocystis jirovidii, Mycobacterium tuberculosis, viruses, etc. Detection using mNGS technology can help clarify the types of infectious pathogens in burns patients with sepsis, and provide basis and guidance for clinical medication.
Keywords: Burns, Infection, Sepsis, Metagenomics, Pathogen
烧伤是指因各种热力因素（火焰、电击、蒸汽或化学物质等）引起的组织损伤。危重烧伤会引起剧烈的炎症反应, 不仅影响皮肤的完整性, 也会对各脏器系统造成损害, 常伴随着休克、出血、SIRS、MODS等严重并发症, 给患者及其家庭乃至社会造成极大负担[1]。大面积烧伤患者由于体表防御屏障受损、全身免疫功能异常、坏死组织广泛存在以及外界菌群侵袭或自身菌群移位等, 导致其存在较高的感染率, 甚至较高的脓毒症发病率。因此, 脓毒症是大面积烧伤救治过程中最常见的并发症和主要的死亡原因之一[2]。研究表明, 烧伤后脓毒症在全世界范围内的年发生人数大概是1 800万, 国内脓毒症患者病死率高达33%, 已成为入住ICU患者的除心血管疾病外导致死亡的主要因素[3]。脓毒症治疗困难且费用高, 若得不到及时有效控制, 将会造成机体多系统脏器的损害, 甚至在短时间内发展为脓毒性休克。因此, 及时准确地诊断烧伤脓毒症患者感染病原体的种类并给予相应的治疗, 对大面积烧伤患者的预后至关重要。
目前, 血液标本微生物培养仍是脓毒症病原学诊断的“金标准”, 但存在培养时间较长、无法检测到特殊或罕见病原体、检测结果容易受抗生素使用影响等不足, 一定程度上会造成脓毒症的漏诊、误诊, 甚至错过最佳治疗时机。宏基因组学第二代测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）技术, 在2014年被应用并检测到脑脊液中感染钩端螺旋体之后, 被引入重症疾病病原学领域, 且被证实在病原学检测方面具有全面性、敏感性、准确性与时效性等优势[4-6]。多项研究显示, mNGS可用于脓毒症和脓毒性休克患者的病原学诊断[7-9], 但尚无基于mNGS技术检测结果探讨烧伤脓毒症患者病原体特征的研究。基于此, 本研究采用mNGS技术检测109例烧伤脓毒症患者的病原体, 旨在构建所检出病原体的谱系并分析其特征, 为该类患者初始经验性抗感染策略的制订提供依据。
1. 对象与方法
本回顾性观察性研究通过郑州市第一人民医院（以下简称本院）伦理委员会批准, 批号：2024-013。所有患者数据的采集均符合该伦理原则。
1.1. 入选标准
纳入标准：年龄≥18岁；烧伤总面积 > 50%TBSA或Ⅲ度烧伤面积 > 20%TBSA或存在烧伤性休克；继发脓毒症, 符合《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南（2018）》的诊断标准[10]；患者临床资料完善, 且均进行了mNGS技术检测。排除标准：合并恶性肿瘤者；合并急慢性传染疾病者；合并血液系统疾病者；长期使用激素或抗凝剂者。
1.2. 临床资料及标本收集
2021年7月—2023年12月, 本院烧伤科收治109例符合入选标准的烧伤脓毒症患者, 其中男68例, 年龄57~92[73（69, 75）]岁；女41例, 年龄48~83[62（58, 64）]岁。78例患者入住ICU, 69例患者接受有创机械通气治疗, 62例患者接受血管活性药物治疗, 43例患者接受糖皮质激素治疗, 73例患者接受血液制品治疗。13例患者入院28 d内死亡, 病死率为11.93%（13/109）。
根据感染情况, 采集患者住院期间的血液、支气管肺泡灌洗液、痰液或其他液体标本。其他液体包括采用穿刺取出的组织液（如胸腹水、关节液）等。109例患者中, 86例患者采集2份标本, 一份在本院检验科进行微生物培养及鉴定, 一份送往院外医学检验中心采用mNGS技术进行病原体检测；23例患者的标本因取材或其他原因仅采集1份, 同前进行mNGS技术检测。
1.3. 微生物分离培养及鉴定
取标本, 按常规方法进行微生物分离培养, 使用VITEK-Compact 30全自动微生物自动鉴定仪进行病原体鉴定, 参照美国临床和实验室标准协会2019年规定的标准进行试验和结果判读。
1.4. mNGS技术检测流程
使用自动化工作站的试剂盒对所采集的标本进行核酸提取及片段化、核酸末端修复及腺苷化、测序引物连接和纯化。对提取的DNA进行质量评估, 然后加载到illumina NextSeq CN500平台进行测序。首先通过前述平台内置的生物信息学分析软件过滤原始序列中的低质量和低复杂性、重复性、可能污染、 < 50 bp和人类基因组序列, 然后进行人工智能化分析以精准识别病原体的核酸序列, 再由权威临床微生物专家和临床相关学科专家结合长期实践经验和全球临床检验标准设定数据库权重, 最后根据美国国家生物技术信息中心的标准对测序结果进行分析、解读、研判[11-14]。
1.5. 分析指标
统计采用mNGS技术检测的送检标本类型及检出病原体的情况；同时根据是否入住ICU, 将患者分为ICU组（78例）及非ICU组（31例）并对2组患者感染的病原体进行分析。另对同时进行mNGS技术检测和微生物培养检测的86例患者标本的病原体检出情况进行分析。
1.6. 统计学处理
采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。非正态分布的计量资料数据以M（Q1, Q3）表示。计数资料数据用频数和/或百分率表示, 组间比较采用χ2检验。mNGS技术和微生物培养法2种检测结果的比较及其Kappa一致性分析, 均采用配对McNemar检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. mNGS技术检测的送检标本类型及检出病原体的情况
109份标本中, 血液标本42份、支气管肺泡灌洗液标本17份、痰液标本4份、脑脊液标本6份、脓液标本16份及组织液标本24份, 其中血液标本、组织液标本的阳性检出率分别为90.48%（38/42）、91.67%（22/24）, 支气管肺泡灌洗液、痰液、脑脊液、脓液的阳性检出比例分别为16/17、3/4、4/6、14/16。
共检测出39种病原体, 其中细菌13种、真菌12种、病毒10种、寄生虫2种、支原体2种, 分别占33.33%、30.77%、25.64%、5.13%、5.13%。检出病原体的总体阳性率为88.99%（97/109）, 其中细菌的占比为54.64%（53/97）、真菌的占比为38.14%（37/97）、病毒的占比为32.99%（32/97）、寄生虫的占比为2.06%（2/97）、支原体的占比为2.06%（2/97）。检出的细菌中, 革兰阴性菌占69.81%（37/53）、革兰阳性菌占54.72%（29/53）, 检出2种细菌的患者占24.53%（13/53）。检出率排前3位的革兰阴性菌依次是肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、假单胞菌, 排前3位的革兰阳性菌依次是肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌；检出率排前3位的病毒依次是人类疱疹病毒、巨细胞病毒、细环病毒；检出率排前3位的真菌依次是烟曲霉菌、白色念珠菌、黄曲霉菌。见表 1。
表 1.
采用宏基因组学第二代测序技术检测烧伤脓毒症患者的不同类型标本感染病原体的情况（株）
Detection of pathogens in different types of specimens from burn patients with sepsis using metagenomic next-generation sequencing technology
| 病原体类型与种类 | 血液 | 支气管肺泡灌洗液 | 痰液 | 脑脊液 | 脓液 | 组织液 | 合计 |
| 革兰阴性菌 | |||||||
| 肺炎克雷伯菌 | 15 | 6 | 2 | 0 | 2 | 0 | 25 |
| 鲍曼不动杆菌 | 13 | 0 | 0 | 3 | 0 | 6 | 22 |
| 假单胞菌 | 7 | 5 | 2 | 2 | 2 | 2 | 20 |
| 铜绿假单胞菌 | 7 | 0 | 0 | 0 | 2 | 3 | 12 |
| 大肠埃希菌 | 4 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 6 |
| 产气克雷伯菌 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 2 | 3 |
| 革兰阳性菌 | |||||||
| 肺炎链球菌 | 6 | 6 | 4 | 0 | 0 | 0 | 16 |
| 金黄色葡萄球菌 | 0 | 0 | 3 | 0 | 4 | 3 | 10 |
| 粪肠球菌 | 0 | 2 | 2 | 0 | 2 | 1 | 7 |
| 结核分枝杆菌 | 0 | 4 | 2 | 0 | 0 | 0 | 6 |
| 屎肠球菌 | 0 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 鸟肠球菌 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 溶血葡萄球菌 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 病毒 | |||||||
| 巨细胞病毒 | 12 | 2 | 1 | 0 | 2 | 0 | 17 |
| 人类疱疹病毒 | 11 | 0 | 0 | 0 | 7 | 0 | 18 |
| 细环病毒 | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 9 |
| 乙型肝炎病毒 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 |
| 单纯疱疹病毒 | 4 | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 | 6 |
| 小细环病毒6型 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 人呼吸道病毒 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 默克尔细胞多瘤病毒 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| 庚型肝炎病毒 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 人多瘤病毒 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 真菌 | |||||||
| 烟曲霉菌 | 4 | 5 | 2 | 1 | 0 | 3 | 15 |
| 白色念珠菌 | 3 | 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 13 |
| 黄曲霉菌 | 7 | 3 | 0 | 1 | 1 | 0 | 12 |
| 卷枝毛霉菌 | 2 | 2 | 2 | 0 | 1 | 2 | 9 |
| 耶氏肺孢子菌 | 1 | 5 | 1 | 0 | 0 | 0 | 7 |
| 热带念珠菌 | 2 | 2 | 1 | 0 | 0 | 1 | 6 |
| 德氏根霉菌 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 |
| 近平滑念珠菌 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 |
| 分枝横梗霉菌 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 2 |
| 黑曲霉菌 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 2 |
| 匍枝根霉菌 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| 阿萨希毛孢子菌 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 其他病原体 | |||||||
| 寄生虫/支原体 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 4 |
| 合计 | 118 | 53 | 27 | 12 | 28 | 33 | 271 |
本组病例中, 27例患者感染1种病原体, 45例患者感染2种病原体, 25例患者感染≥3种病原体。
2.2. mNGS技术检出2组患者感染病原体谱系
ICU组和非ICU组患者中均检出的常见革兰阴性菌是肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和假单胞菌, 常见革兰阳性菌是肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌；检出的常见真菌是烟曲霉菌；检出的常见病毒是巨细胞病毒。与非ICU组相比, ICU组患者检出的肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、假单胞菌、肺炎链球菌、巨细胞病毒、烟曲霉菌的占比均明显升高（χ2值分别为8.62、7.93、3.93、5.48、4.28、5.58, P值分别为0.021、0.035、0.043、0.024、0.035、0.031）。见表 2。
表 2.
采用宏基因组学第二代测序技术检测2组烧伤脓毒症患者的病原体情况（株）
Detection of pathogens in the two groups of burn patients with sepsis using metagenomic next-generation sequencing technology
| 组别 | 样本数 | 肺炎克雷伯菌 | 鲍曼不动杆菌 | 假单胞菌 | 铜绿假单胞菌 | 大肠埃希菌 | 肺炎链球菌 | 金黄色葡萄球菌 | 粪肠球菌 | 结核分枝杆菌 | 屎肠球菌 |
| 注：ICU指重症监护病房；其他包括产气克雷伯菌、鸟肠球菌、溶血葡萄球菌、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、小细环病毒6型、人呼吸道病毒、默克尔细胞多瘤病毒、庚型肝炎病毒、人多瘤病毒、卷枝毛霉菌、热带念珠菌、德氏根霉菌、近平滑念珠菌、分枝横梗霉菌、匍枝根霉菌、阿萨希毛孢子菌、班氏血丝虫、疟原虫、人型支原体、解脲支原体；与非ICU组比较, aP < 0.05 | |||||||||||
| 非ICU组 | 31 | 8 | 6 | 8 | 4 | 2 | 5 | 2 | 2 | 1 | 1 |
| ICU组 | 78 | 17a | 16a | 12a | 8 | 4 | 11a | 8 | 4 | 5 | 2 |
| 组别 | 样本数 | 巨细胞病毒 | 人类疱疹病毒 | 细环病毒 | 烟曲霉菌 | 白色念珠菌 | 黄曲霉菌 | 耶氏肺孢子菌 | 黑曲霉菌 | 其他 | 合计 |
| 非ICU组 | 31 | 5 | 6 | 3 | 5 | 2 | 4 | 3 | 0 | 16 | 83 |
| ICU组 | 78 | 12a | 12 | 6 | 10a | 9 | 8 | 4 | 2 | 38 | 188 |
2.3. 2种检测方法检出病原体情况
mNGS技术和微生物培养法检出的病原体中, 最常见细菌的是肺炎克雷伯菌（29株）和鲍曼不动杆菌（26株）, 最常见的真菌是曲霉菌属菌株（30株）和念珠菌属菌株（19株）。只能通过mNGS技术检测到的病原体有19种, 如分枝横梗霉菌、耶氏肺孢子菌、结核分枝杆菌、病毒等；无采用微生物培养法检测到而采用mNGS技术检测不到的病原体。采用mNGS技术检出病原体的总体阳性率、细菌阳性率、真菌阳性率分别为91.86%（79/86）、51.16%（44/86）、33.72%（29/86）, 均较采用微生物培养法检出的32.56%（28/86）、29.07%（25/86）、3.49%（3/86）显著升高（χ2值分别为45.52、5.88、4.94, P < 0.001）。见表 3。
表 3.
采用2种方法检出烧伤脓毒症患者的病原体情况（株）
Detection of pathogens in burn patients with sepsis using two methods
| 检测方法 | 样本数 | 肺炎克雷伯菌 | 鲍曼不动杆菌 | 假单胞菌 | 铜绿假单胞菌 | 大肠埃希菌 | 肺炎链球菌 | 金黄色葡萄球菌 | 粪肠球菌 | 结核分枝杆菌 | 屎肠球菌 | 溶血葡萄球菌 |
| 注：mNGS指宏基因组学第二代测序；其他包括产气克雷伯菌、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、小细环病毒6型、人呼吸道病毒、默克尔细胞多瘤病毒、班氏血丝虫、疟原虫、人型支原体、解脲支原体等, 曲霉菌属包括黄曲霉菌、烟曲霉菌、黑曲霉菌, 念珠菌属包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌, 毛霉属包括卷枝毛霉菌、分枝横梗霉菌, 孢子菌属包括耶氏肺孢子菌、阿萨希毛孢子菌, 根霉属包括匍枝根霉菌、德氏根霉菌 | ||||||||||||
| mNGS技术 | 86 | 25 | 22 | 20 | 12 | 6 | 16 | 10 | 7 | 6 | 4 | 2 |
| 微生物培养 | 86 | 4 | 4 | 2 | 1 | 3 | 3 | 2 | 1 | 0 | 2 | 1 |
| 检测方法 | 样本数 | 巨细胞病毒 | 人类疱疹病毒 | 细环病毒 | 曲霉菌属真菌 | 念珠菌属真菌 | 毛霉属真菌 | 孢子菌属真菌 | 根霉属真菌 | 其他 | 合计 | |
| mNGS技术 | 86 | 17 | 18 | 9 | 27 | 19 | 11 | 8 | 4 | 12 | 255 | |
| 微生物培养 | 86 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 28 | |
采用2种检测方法同时报告阳性结果的患者占27.91%（24/86）, 采用mNGS技术检测结果为阳性而采用微生物培养法检测结果为阴性的患者占72.09%（62/86）。2种检测方法所得结果的一致性检验显示, 差异无统计学意义（κ=0.02, P=0.713）。
3. 讨论
mNGS技术是借助二代测序平台快速测序获得样品中的核酸序列, 并进一步与各个物种的基因组序列对比, 从而得到样品中微生物的种类和比例的技术。该技术因灵敏度高、特异度强、检测时间短的特点, 已成为感染性疾病病原学诊断的有力手段, 尤其是在检测免疫功能低下患者严重感染、罕见和新型病原体感染以及混合感染的病原体中具有重要作用[15-20]。伴随mNGS技术在重症感染临床应用的多项专家共识发表, 对急危重症感染患者进行mNGS技术检测的应用原则、注意事项和报告解读流程逐步明确, 必将大范围、较大程度推进mNGS技术在临床上的应用。常规的微生物培养法存在阳性率低、报告结果时间长、无法鉴定未知病原体等不足, 且微生物培养法需要在使用抗生素前采集标本, 导致其结果的特异度低、灵敏度低。与微生物培养法相比较, mNGS技术在细菌检测方面有着明显优势[21-24]。mNGS技术除了可以在短时间内进行大范围的病原体核酸检测外, 还能够覆盖到微生物培养法难以检测到的病原体, 并进行耐药基因测序检测。由于烧伤脓毒症患者的病原体种类多样, 如果临床无法快速确诊病原体则不能精准用药。mNGS技术可以通过高通量二代测序技术对标本中的所有微生物基因进行测序检测, 一次性获取待检样品中可能存在的多种病原体基因组序列。mNGS技术检测尤其是在重症感染后腹水、胸水以及近期抗生素暴露、反复培养未能找到病原体的罕见微生物感染患者中具有极大优势。基于此, 本研究利用mNGS技术分析烧伤脓毒症患者感染病原体谱系的特征。
感染被认为是烧伤患者病死率升高的首要因素, 烧伤程度越深, 病原体进入循环系统引起菌血症或脓毒症的可能性就越大。烧伤患者感染的常见病原菌为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等, 近年来有报道显示鲍曼不动杆菌检出率在不断上升, 金黄色葡萄球菌检出率则呈下降趋势[25], 且在烧伤后的不同时间, 常见的病原菌种类亦不同, 早期以革兰阳性菌居多, 晚期则可见革兰阴性菌呈逐渐增加趋势[26]。本研究显示, 烧伤脓毒症患者的细菌检出率最高, 其中革兰阴性菌较革兰阳性菌高, 肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和假单胞菌排在前3位。常规微生物培养法检测结果也得出相似结果。革兰阴性菌感染而引发的一系列炎症损伤往往更为严重、剧烈, 可进一步加重血管内皮损伤, 因此及时明确致病菌有利于感染的早期控制[27]。由于重视程度的提高、检测方法的改进等, 在临床上观察到越来越多的烧伤真菌感染。虽然微生物培养法被视为真菌感染的诊断金标准, 但大多数真菌培养的时间较长, 临床医师往往无法及时得到精准快速的检测结果[28-30], 以致可能延误重症烧伤患者的治疗时机。本研究也显示, 真菌的检出率已位居烧伤脓毒症患者病原体的第2位, 此外烟曲霉菌、白色念珠菌和黄曲霉菌感染较多见。本研究中, 相较于微生物培养法, mNGS技术检测到真菌, 如曲霉菌属和毛霉属菌株、耶氏肺孢子菌等的阳性率更高。而耶氏肺孢子菌作为机会致病菌, 是导致免疫功能低下人群发生脓毒症和死亡的一个重要因素[31], 故mNGS技术在辅助制订烧伤脓毒症患者的早期抗感染治疗方案中具有较高价值。本研究团队通过对不同状态下患者的病原体特征进行分析, 观察到采用mNGS技术检测不仅提高了ICU患者常见病原体的检出率, 还检测到了采用微生物培养法检出率较低的病原体, 如鸟肠球菌和黑曲霉菌等。
由于感染原因复杂, 即使病原体丰度低, 在宿主免疫功能低下等某些情况下也仍应考虑各种病原体的致病性[32-33]。另外, mNGS技术的检测结果也可能由于某些因素, 如环境污染、微生物及定植微生物等导致真正的病原体可能隐藏在疑似背景微生物中等而存在假阳性[34]。在致病病原体丰度较低的标本中, 精准辨别致病性微生物与疑似背景微生物十分困难, 经验性抗生素的应用还需结合临床医师的经验。本组109例患者中, 有95例（87.16%）患者根据mNGS技术检测结果明确了诊断, 其中45例（41.28%）患者调整抗生素但不降级, 23例（21.10%）患者进行抗生素降级治疗, 27例（24.77%）患者明确病原体后维持原方案治疗, 提示mNGS技术检测对临床选择抗感染用药具有一定的指导作用。值得注意的是, 越来越多混合病原体的感染给临床经验性用药增加了难度, 因此及时准确的病原学诊断显得尤为重要[35-36]。
综上, 本研究基于mNGS技术的优势, 系统分析了烧伤脓毒症患者的病原学特征, 对临床选择抗感染用药具有一定的指导作用。但本研究仅分析了mNGS技术结果对临床抗生素使用方案的影响, 未对患者转归与mNGS技术检测的相关性进行深入分析；同时还存在单中心研究、标本量有限等局限性, 未来将纳入更多的患者, 进行深入研究。
Funding Statement
河南省中青年卫生健康科技创新优秀青年人才培养项目（YXKC2020060）；河南省医学科技攻关计划项目（LHGJ20230754）
Young and Middle-Aged Health Science and Technology Innovation Talent Project of Henan Province of China (YXKC2020060); Medical science and technology research project of Henan Province of China (LHGJ20230754)
本文亮点
(1) 采用宏基因组学第二代测序（mNGS）技术检出标本中病原体的阳性率高于采用常规微生物培养法，且能检测到后者不能检出的病原体，如分枝横梗霉菌、耶氏肺孢子菌、结核分枝杆菌、病毒等。
(2) 采用mNGS技术检测109例烧伤脓毒症患者感染病原体的结果显示，27例患者感染1种病原体，45例患者感染2种病原体，25例患者感染≥3种病原体，病原体的阳性检出率高。
Highlights
(1) The positive rate of pathogens detection using metagenomic next-generation sequencing (mNGS) technology was higher than that by conventional microbiological culture method, and it could detect pathogens that couldn't be detected by the latter, such as Lichtheimia ramosa, Pneumocystis jirovidii, Mycobacterium tuberculosis, viruses, and so on.
(2) The results showed that of the 109 burn patients with sepsis examined using mNGS, 27 patients were infected with 1 pathogen, 45 patients were infected with 2 pathogens, and 25 patients were infected with ≥3 pathogens. The positive detection rate of pathogens was high.
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明 史继静：研究设计、实施及文章撰写；赵靓、张群：数据收集及统计；李晓亮、夏成德：文章审阅及修改；马超：研究设计指导、文章审阅及修改、经费支持
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