Abstract
目的
探讨自体脂肪干细胞基质胶对兔耳全层皮肤缺损创面愈合及瘢痕增生的影响, 并分析其相关机制。
方法
采用实验研究方法。切取42只2~3个月龄雄性新西兰大白兔背部完整脂肪垫, 制备脂肪干细胞基质胶, 并于每只兔双耳腹侧制备全层皮肤缺损创面, 将左耳创面纳入脂肪干细胞基质胶组（以下简称基质胶组）、右耳创面纳入磷酸盐缓冲液（PBS）组, 分别注入自体脂肪干细胞基质胶和PBS。计算伤后7、14、21 d创面愈合率, 并于创面愈合后1、2、3、4个月行创面形成瘢痕组织（以下简称瘢痕组织）温哥华瘢痕量表（VSS）评分；行苏木精-伊红染色观测伤后7、14、21 d创面组织病理学改变和创面愈合后1、2、3、4个月瘢痕组织真皮厚度；行Masson染色观察伤后7、14、21 d创面组织和创面愈合后1、2、3、4个月瘢痕组织中胶原排布, 并计算胶原容积分数（CVF）；采用免疫组织化学法观测伤后7、14、21 d创面组织中微血管计数（MVC）与创面愈合后1、2、3、4个月瘢痕组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达, 并行基质胶组瘢痕组织中α-SMA与TGF-β1表达相关性分析；采用酶联免疫吸附测定法检测伤后7、14、21 d创面组织中血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子（EGF）的表达。各组各时间点样本数均为6。对数据行重复测量方差分析、析因设计方差分析、配对样本t检验、LSD检验与Pearson相关性分析。
结果
伤后7 d, 基质胶组创面愈合率为（10.3±1.7）%, 与PBS组的（8.5±2.1）%接近（P > 0.05）；伤后14、21 d, 基质胶组创面愈合率分别为（75.5±7.0）%、（98.7±0.8）%, 均明显高于PBS组的（52.7±6.7）%、（90.5±1.7）%（t值分别为5.79、10.37, P < 0.05）。创面愈合后1、2、3、4个月, 基质胶组瘢痕组织VSS评分均明显低于PBS组（t值分别为-5.00、-2.86、-3.31、-4.45, P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 除基质胶组创面愈合后4个月（P > 0.05）外, 2组创面愈合后各时间点瘢痕组织VSS评分均明显升高（P < 0.05）。伤后7 d, 2组创面肉芽组织再生与上皮化程度接近；伤后14、21 d, 基质胶组创面组织中成纤维细胞、毛细血管、上皮细胞层数明显多于PBS组。创面愈合后1、2、3、4个月, 基质胶组瘢痕组织真皮厚度均明显薄于PBS组（t值分别为-4.08、-5.52、-6.18、-6.30, P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 2组创面愈合后各时间点瘢痕组织真皮厚度均明显增厚（P < 0.05）。与PBS组比较, 基质胶组伤后14、21 d创面组织中胶原排布更规则且CVF均明显升高（t值分别为3.98、3.19, P < 0.05）, 创面愈合后1、2、3、4个月瘢痕组织中胶原排布也更规则但CVF均明显降低（t值分别为-7.38、-4.20、-4.10、-4.65, P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 除基质胶组创面愈合后1个月（P > 0.05）外, 2组创面伤后各时间点创面组织与创面愈合后各时间点瘢痕组织中CVF均明显升高（P < 0.05）。伤后14、21 d, 基质胶组创面组织中MVC均明显高于PBS组（t值分别为4.33、10.10, P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 除PBS组伤后21 d（P > 0.05）外, 2组创面伤后各时间点MVC均明显升高（P < 0.05）。创面愈合后1、2、3、4个月, 基质胶组瘢痕组织中TGF-β1和α-SMA的表达均明显低于PBS组（t值分别为-2.83、-5.46、-5.61、-8.63, -10.11、-5.79、-8.08、-11.96, P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 除基质胶组创面愈合后4个月α-SMA表达（P > 0.05）外, 2组创面愈合后各时间点瘢痕组织中TGF-β1与α-SMA表达均明显升高（P < 0.05）。基质胶组瘢痕组织中α-SMA与TGF-β1表达之间呈显著正相关（r=0.92, P < 0.05）。伤后14、21 d, 基质胶组创面组织中VEGF（t值分别为6.14、6.75, P < 0.05）和EGF（t值分别为8.17、5.85, P < 0.05）的表达均明显高于PBS组。与组内前一时间点比较, 2组创面伤后各时间点VEGF表达均明显增高（P < 0.05）, EGF表达均明显下降（P < 0.05）。
结论
脂肪干细胞基质胶可能通过促进创面组织中胶原沉积和VEGF、EGF的表达从而显著促进兔耳全层皮肤缺损创面愈合, 还可能通过抑制瘢痕组织中胶原沉积和TGF-β1、α-SMA的表达进一步抑制创面愈合后瘢痕增生。
Keywords: 瘢痕, 血管内皮生长因子类, 表皮生长因子, 转化生长因子β1, 脂肪干细胞基质胶, 创面愈合, α平滑肌肌动蛋白
Abstract
Objective
To investigate the influence of autologous adipose stem cell matrix gel on wound healing and scar hyperplasia of full-thickness skin defects in rabbit ears, and to analyze the related mechanism.
Methods
Experimental research methods were adopted. The complete fat pads on the back of 42 male New Zealand white rabbits aged 2 to 3 months were cut to prepare adipose stem cell matrix gel, and a full-thickness skin defect wound was established on the ventral side of each ear of each rabbit. The left ear wounds were included in adipose stem cell matrix gel group (hereinafter referred to as matrix gel group), and the right ear wounds were included in phosphate buffer solution (PBS) group, which were injected with autologous adipose stem cell matrix gel and PBS, respectively. The wound healing rate was calculated on post injury day (PID) 7, 14, and 21, and the Vancouver scar scale (VSS) scoring of scar tissue formed on the wound (hereinafter referred to as scar tissue) was performed in post wound healing month (PWHM) 1, 2, 3, and 4. Hematoxylin-eosin staining was performed to observe and measure the histopathological changes of wound on PID 7, 14, and 21 and the dermal thickness of scar tissue in PWHM 1, 2, 3, and 4. Masson staining was performed to observe the collagen distribution in wound tissue on PID 7, 14, and 21 and scar tissue in PWHM 1, 2, 3, and 4, and the collagen volume fraction (CVF) was calculated. The microvessel count (MVC) in wound tissue on PID 7, 14, and 21 and the expressions of transforming growth factor β1 (TGF-β1) and α smooth muscle actin (α-SMA) in scar tissue in PWHM 1, 2, 3, and 4 were detected by immunohistochemical method, and the correlation between the expression of α-SMA and that of TGF-β1 in scar tissue in matrix gel group was analyzed. The expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and epidermal growth factor (EGF) in wound tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay on PID 7, 14, and 21. The number of samples at each time point in each group was 6. Data were statistically analyzed with analysis of variance for repeated measurement, analysis of variance for factorial design, paired sample t test, least significant difference test, and Pearson correlation analysis.
Results
On PID 7, the wound healing rate in matrix gel group was (10.3±1.7)%, which was close to (8.5±2.1)% in PBS group (P > 0.05). On PID 14 and 21, the wound healing rates in matrix gel group were (75.5±7.0)% and (98.7±0.8)%, respectively, which were significantly higher than (52.7±6.7)% and (90.5±1.7)% in PBS group (with t values of 5.79 and 10.37, respectively, P < 0.05). In PWHM 1, 2, 3, and 4, the VSS score of scar tissue in matrix gel group was significantly lower than that in PBS group (with t values of -5.00, -2.86, -3.31, and -4.45, respectively, P < 0.05). Compared with the previous time point within the group, the VSS score of scar tissue at each time point after wound healing in the two groups was significantly increased (P < 0.05), except for PWHM 4 in matrix gel group (P > 0.05). On PID 7, the granulation tissue regeneration and epithelialization degree of the wounds between the two groups were similar. On PID 14 and 21, the numbers of fibroblasts, capillaries, and epithelial cell layers in wound tissue of matrix gel group were significantly more than those in PBS group. In PWHM 1, 2, 3, and 4, the dermal thickness of scar tissue in matrix gel group was significantly thinner than that in PBS group (with t values of -4.08, -5.52, -6.18, and -6.30, respectively, P < 0.05). Compared with the previous time point within the group, the dermal thickness of scar tissue in the two groups thickened significantly at each time point after wound healing (P < 0.05). Compared with those in PBS group, the collagen distribution in wound tissue in matrix gel group was more regular and the CVF was significantly increased on PID 14 and 21 (with t values of 3.98 and 3.19, respectively, P < 0.05), and the collagen distribution in scar tissue was also more regular in PWHM 1, 2, 3, and 4, but the CVF was significantly decreased (with t values of -7.38, -4.20, -4.10, and -4.65, respectively, P < 0.05). Compared with the previous time point within the group, the CVFs in wound tissue at each time point after injury and scar tissue at each time point after wound healing in the two groups were significantly increased (P < 0.05), except for PWHM 1 in matrix gel group (P > 0.05). On PID 14 and 21, the MVC in wound tissue in matrix gel group was significantly higher than that in PBS group (with t values of 4.33 and 10.10, respectively, P < 0.05). Compared with the previous time point within the group, the MVC of wound at each time point after injury in the two groups was increased significantly (P < 0.05), except for PID 21 in PBS group (P > 0.05). In PWHM 1, 2, 3, and 4, the expressions of TGF-β1 and α-SMA in scar tissue in matrix gel group were significantly lower than those in PBS group (with t values of -2.83, -5.46, -5.61, -8.63, -10.11, -5.79, -8.08, and -11.96, respectively, P < 0.05). Compared with the previous time point within the group, the expressions of TGF-β1 and α-SMA in scar tissue in the two groups were increased significantly at each time point after wound healing (P < 0.05), except for the α-SMA expression in matrix gel group in PWHM 4 (P > 0.05). There was a significantly positive correlation between the expression of α-SMA and that of TGF-β1 in scar tissue in matrix gel group (r=0.92, P < 0.05). On PID 14 and 21, the expressions of VEGF (with t values of 6.14 and 6.75, respectively, P < 0.05) and EGF (with t values of 8.17 and 5.85, respectively, P < 0.05) in wound tissue in matrix gel group were significantly higher than those in PBS group. Compared with the previous time point within the group, the expression of VEGF of wound at each time point after injury in the two groups was increased significantly (P < 0.05), and the expression of EGF was decreased significantly (P < 0.05).
Conclusions
Adipose stem cell matrix gel may significantly promote the wound healing of full-thickness skin defects in rabbit ears by promoting collagen deposition and expressions of VEGF and EGF in wound tissue, and may further inhibit the scar hyperplasia after wound healing by inhibiting collagen deposition and expressions of TGF-β1 and α-SMA in scar tissue.
Keywords: Cicatrix, Vascular endothelial growth factors, Epidermal growth factor, Transforming growth factor beta1, Adipose stem cell matrix gel, Wound healing, α smooth muscle actin
创面修复是目前世界范围内的一大难题, 随着人口老龄化日趋严重, 各类创面的发生率也呈上升趋势[1-2]。目前针对创面的疗法众多, 但疗效均不够理想[3], 创面愈合后常会遗留增生性瘢痕[4]。近年来研究显示, 间充质干细胞可明显加速创面再上皮化, 改善组织及器官纤维化, 减轻创面愈合后瘢痕增生[5-9]。而脂肪干细胞因含量丰富、易于获取等优点, 成为近几年干细胞领域研究的热点[9], 并且众多基础和临床研究均证实脂肪干细胞可以加速创面愈合[10-12]。但是脂肪干细胞的分离流程复杂, 并且移植后保留率不稳定[13-14], 上述弊端使得临床应用脂肪干细胞的细胞疗法受到限制。
脂肪干细胞基质胶是通过纯物理方法获得的含有生物活性ECM和脂肪干细胞的胶冻样脂肪浓缩提取物, 该提取物的制备方法简单、使用安全, 移植后远期保存率高[10], 其在创面修复与瘢痕增生中的作用逐渐被印证[11-13]。然而创面修复与瘢痕增生是组织损伤后的序贯性过程, 目前尚缺乏对脂肪干细胞基质胶在同一动物模型创面愈合与瘢痕增生过程中作用的连续性研究。因此本课题组对脂肪干细胞基质胶在此序贯过程中的作用进行观察并探讨相关机制, 拟为采用脂肪干细胞基质胶治疗创面和瘢痕提供理论依据。
1. 材料与方法
本实验研究遵循临沂市人民医院动物实验伦理委员会和国家有关实验动物管理和使用的相关规定。
1.1. 动物及主要试剂与仪器来源
42只健康无特殊病原体级雄性新西兰大白兔, 2~3个月龄, 体重3~4 kg, 购自济南金丰实验动物有限公司, 许可证号：SCXK（鲁）20180006。兔源性CD34、TGF-β1、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司, 即用型辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物购自北京中杉金桥生物技术有限公司, VEGF、EGF的ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司, HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。SpectraMax M2型酶标仪购自美国Molecular Devices公司, CX23型光学显微镜购自日本Olympus公司。
1.2. 兔自体脂肪干细胞基质胶的制备
根据文献[10]方法制备兔自体脂肪干细胞基质胶。取42只兔, 常规麻醉, 无菌条件下切取每只兔背部完整脂肪垫（体积约5 cm3）。冲洗去除红细胞、小血管及纤维组织, 剪成1 mm3大小颗粒。以1 200×g离心3 min, 将上层脂肪组织转至鲁尔注射器推注至絮凝状态。再次以2 000×g离心3 min, 底层的凝胶样黏性物即为脂肪干细胞基质胶[10]。对背部切口行止血、冲洗后缝合, 创面隔日换药至愈合。
1.3. 动物实验
1.3.1. 模型建立与分组处理
取1.2中切取脂肪垫后的42只兔, 分别于双耳腹侧、沿长轴设计切取5.0 cm×1.5 cm全层皮肤, 剥离软骨膜, 制成全层皮肤缺损创面模型。伤后即刻, 将左耳创面纳入脂肪干细胞基质胶组（以下简称基质胶组）、右耳创面纳入PBS组, 分别注入自体脂肪干细胞基质胶和PBS各0.5 mL。
1.3.2. 创面愈合情况观察
取6只兔, 观察伤后7、14、21 d创面愈合（以完全上皮化为愈合判定标准）情况并拍照, 计算创面愈合率[14]。创面愈合率=（伤后即刻创面面积-伤后各时间点创面面积）÷伤后即刻创面面积×100%。
1.3.3. 创面形成瘢痕组织（以下简称瘢痕组织）评分
取1.3.2中行创面观察后的6只兔, 于创面愈合后1、2、3、4个月, 对瘢痕组织从色泽、厚度、血管分布和柔软度方面进行温哥华瘢痕量表（VSS）评分（总分15分）, 评分越高表示瘢痕增生越严重[15-16]。
1.3.4. 创面组织病理学改变与瘢痕组织真皮厚度及2种组织中胶原情况观测
分别于伤后7、14、21 d及创面愈合后1、2、3、4个月各取6只兔（最后1个时间点兔为1.3.3完成VSS评分后兔）, 采用空气栓塞法处死, 完整切取前3个时间点创面组织与后4个时间点瘢痕组织, 部分组织用40 g/L多聚甲醛固定48 h后, 常规石蜡包埋, 取部分包块切片（厚度为5 μm）。取每个时间点每个样本1张切片, 行HE染色后, 于200倍光学显微镜下观察创面肉芽组织再生及上皮化程度, 于100倍光学显微镜下用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）测量瘢痕组织真皮厚度。另取每个时间点每个样本1张切片, 行Masson染色后, 于400倍光学显微镜下观察胶原排列情况, 并用ImageJ软件计算胶原容积分数（CVF）对胶原进行定量分析, CVF=（胶原面积÷整个图像总面积）×100%。
1.3.5. 创面组织中微血管计数（MVC）及瘢痕组织中TGF-β1与α-SMA表达观测
取1.3.4中剩余部分组织, 冰冻后切片（厚度为5 μm）, 行免疫组织化学染色。一抗为兔源性CD34、α-SMA单克隆抗体（稀释比均为1∶2 000）、兔源性TGF-β1单克隆抗体（稀释比为1∶500）, 二抗为即用型HRP标记的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物。取伤后7、14、21 d每个样本1张切片, 于200倍光学显微镜下观察创面组织中CD34的阳性表达（棕色, 指示微血管）, 并拍摄3个视野, 行MVC, 结果取均值。取创面愈合后1、2、3、4个月每个样本1张切片, 于200倍光学显微镜下观察瘢痕组织中TGF-β1和α-SMA的阳性表达（均为棕色）, 并拍摄3个视野, 应用Image Pro Plus 6.0软件（美国国立卫生研究院）行染色吸光度值分析, 结果取均值。
1.3.6. 创面组织中VEGF和EGF表达检测
取1.3.5取材后剩余伤后7、14、21 d创面组织（每个时间点每只兔500 mg）, 采用ELISA法检测VEGF和EGF的表达。均用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值, 根据样品的吸光度值计算出VEGF和EGF浓度。
1.4. 统计学处理
采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布, 以x±s表示, 2组间多个时间点总体比较采用重复测量方差分析或析因设计方差分析, 组间两两比较采用配对样本t检验, 组内两两比较选用LSD检验（软件自动略去该统计量值）；对基质胶组瘢痕组织中TGF-β1和α-SMA表达的相关性行Pearson相关性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 创面愈合情况
2组创面均逐渐愈合。伤后7 d, 2组创面愈合率差异无统计学意义（P > 0.05）；伤后14、21 d, 基质胶组创面愈合率均明显高于PBS组（P < 0.05）。见图 1与表 1。
图 1.
2组兔耳全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合情况。1A、1B、1C和1D、1E、1F.分别为磷酸盐缓冲液组和脂肪干细胞基质胶组伤后7、14、21 d创面, 图 1D与图 1A创面大小接近, 图 1E较图 1B创面明显缩小, 图 1F较图 1C创面明显缩小且创面未结痂
表 1.
2组兔耳全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合率比较(%, x±s)
| 组别 | 样本数 | 7 d | 14 d | 21 d |
| 注：处理因素主效应, F=55.49, P < 0.001；时间因素主效应, F=1 361.95, P < 0.001；二者交互作用, F=21.41, P < 0.001 | ||||
| 磷酸盐缓冲液组 | 6 | 8.5±2.1 | 52.7±6.7 | 90.5±1.7 |
| 脂肪干细胞基质胶组 | 6 | 10.3±1.7 | 75.5±7.0 | 98.7±0.8 |
| t值 | 1.57 | 5.79 | 10.37 | |
| P值 | 0.147 | < 0.001 | < 0.001 | |
2.2. 瘢痕组织评分
创面愈合后1、2、3、4个月, 基质胶组瘢痕组织VSS评分均明显低于PBS组（P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 除基质胶组创面愈合后4个月（P > 0.05）外, 2组创面愈合后各时间点瘢痕组织VSS评分均明显升高（P < 0.05）。见图 2与表 2。
图 2.
2组兔耳全层皮肤缺损创面愈合后各时间点创面形成瘢痕组织增生情况。2A、2B、2C、2D和2E、2F、2G、2H.分别为磷酸盐缓冲液组与脂肪干细胞基质胶组创面愈合后1、2、3、4个月瘢痕组织, 图 2E、2F、2G、2H分别较图 2A、2B、2C、2D瘢痕情况好, 表现为颜色更浅、厚度更薄、血管分布更少
表 2.
2组兔耳全层皮肤缺损创面愈合后各时间点创面形成瘢痕组织温哥华瘢痕量表评分比较(分, x±s)
| 组别 | 样本数 | 1个月 | 2个月 | 3个月 | 4个月 |
| 注：处理因素主效应, F=32.75, P < 0.001；时间因素主效应, F=130.78, P < 0.001；二者交互作用, F=5.24, P=0.005；t值、P值为组间比较所得, P1值、P2值分别为磷酸盐缓冲液组、脂肪干细胞基质胶组组内各时间点与前一时间点比较所得；“—”表示无此项 | |||||
| 磷酸盐缓冲液组 | 6 | 6.0±0 | 8.2±0.8 | 10.3±1.0 | 12.2±1.5 |
| 脂肪干细胞基质胶组 | 6 | 5.2±0.4 | 7.2±0.4 | 8.8±0.4 | 9.3±0.5 |
| t值 | -5.00 | -2.86 | -3.31 | -4.45 | |
| P值 | 0.004 | 0.017 | 0.008 | 0.004 | |
| P1值 | — | 0.001 | 0.001 | 0.004 | |
| P2值 | — | < 0.001 | < 0.001 | 0.062 | |
2.3. 创面组织病理学改变及瘢痕组织真皮厚度
伤后7 d, 2组创面肉芽组织再生与上皮化程度接近；伤后14 d, 与PBS组比较, 基质胶组创面组织中Fb及毛细血管数量明显增多, 上皮细胞呈多层结构, 排列更加规则有序；伤后21 d, 2组创面间上述差异仍持续存在, 且基质胶组较PBS组上皮脚和钉突结构增多。
创面愈合后1、2、3、4个月, 基质胶组瘢痕组织真皮厚度均明显薄于PBS组（P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 2组创面愈合后各时间点瘢痕组织真皮厚度均明显增厚（P < 0.05）。见表 3。
表 3.
2组兔耳全层皮肤缺损创面愈合后各时间点创面形成瘢痕组织真皮厚度比较(mm, x±s)
| 组别 | 样本数 | 1个月 | 2个月 | 3个月 | 4个月 |
| 注：处理因素主效应, F=124.17, P < 0.001；时间因素主效应, F=685.85, P < 0.001；二者交互作用, F=2.85, P=0.049；t值、P值为组间比较所得, P1值、P2值分别为磷酸盐缓冲液组、脂肪干细胞基质胶组组内各时间点与前一时间点比较所得；“—”表示无此项 | |||||
| 磷酸盐缓冲液组 | 6 | 0.98±0.05 | 1.45±0.07 | 1.88±0.09 | 2.20±0.09 |
| 脂肪干细胞基质胶组 | 6 | 0.85±0.06 | 1.26±0.05 | 1.61±0.05 | 1.94±0.04 |
| t值 | -4.08 | -5.52 | -6.18 | -6.30 | |
| P值 | 0.002 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| P1值 | — | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| P2值 | — | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
2.4. 创面和瘢痕组织中胶原情况
伤后7 d, 2组创面组织中胶原排布均紊乱, CVF差异无统计学意义（P > 0.05）；伤后14、21 d, 与PBS组比较, 基质胶组创面组织中胶原排布更规则, 间隙更小, CVF均明显升高（P < 0.05）。创面愈合后1、2、3、4个月, 与PBS组比较, 基质胶组瘢痕组织中胶原排布更规则有序, 排列疏松, CVF均明显降低（P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 除基质胶组创面愈合后1个月（P > 0.05）外, 2组创面伤后各时间点创面组织与创面愈合后各时间点瘢痕组织中CVF均明显升高（P < 0.05）。见表 4。
表 4.
2组兔耳全层皮肤缺损创面伤后各时间点创面组织与愈合后各时间点创面形成瘢痕组织中胶原容积分数比较(%, x±s)
| 组别 | 样本数 | 伤后7 d | 伤后14 d | 伤后21 d | 愈合后1个月 | 愈合后2个月 | 愈合后3个月 | 愈合后4个月 |
| 注：处理因素主效应, F=36.07, P < 0.001；时间因素主效应, F=325.73, P < 0.001；二者交互作用, F=17.60, P < 0.001；t值、P值为组间比较所得, P1值、P2值分别为磷酸盐缓冲液组、脂肪干细胞基质胶组组内各时间点与前一时间点比较所得；“—”表示无此项 | ||||||||
| 磷酸盐缓冲液组 | 6 | 51.9±0.6 | 55.1±1.2 | 59.4±1.1 | 67.5±1.1 | 70.7±1.5 | 73.5±1.0 | 76.8±1.9 |
| 脂肪干细胞基质胶组 | 6 | 52.2±1.1 | 58.1±1.4 | 61.7±1.3 | 62.2±1.4 | 66.5±1.9 | 68.8±2.6 | 71.3±2.2 |
| t值 | 0.54 | 3.98 | 3.19 | -7.38 | -4.20 | -4.10 | -4.65 | |
| P值 | 0.605 | 0.003 | 0.010 | < 0.001 | 0.002 | 0.006 | 0.001 | |
| P1值 | — | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | 0.001 | < 0.001 | |
| P2值 | — | < 0.001 | < 0.001 | 0.599 | < 0.001 | 0.027 | 0.020 | |
2.5. 创面组织中MVC及瘢痕组织中TGF-β1与α-SMA表达
2.5.1. 创面组织中MVC
伤后7 d, 2组创面组织中MVC接近（P > 0.05）；伤后14、21 d, 基质胶组创面组织中MVC均明显高于PBS组（P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 除PBS组伤后21 d（P > 0.05）外, 2组创面伤后各时间点MVC均明显升高（P < 0.05）。见图 3与表 5。
图 3.
2组兔耳全层皮肤缺损创面伤后各时间点创面组织中CD34阳性微血管（棕色）情况 二氨基联苯胺×200。3A、3B、3C和3D、3E、3F.分别为磷酸盐缓冲液组和脂肪干细胞基质胶组伤后7、14、21 d创面组织, 图 3A和3D创面基底有少量新生微血管, 图 3B、3C、3E、3F创面基底有大量新生微血管, 且图 3E、3F微血管数量分别多于图 3B、3C, 图 3F微血管数量多于图 3E, 图 3B、3C微血管数量接近
表 5.
2组兔耳全层皮肤缺损创面伤后各时间点200倍视野下微血管计数比较（个, x±s）
| 组别 | 样本数 | 7 d | 14 d | 21 d |
| 注：处理因素主效应, F=82.79, P < 0.001；时间因素主效应, F=140.71, P < 0.001；二者交互作用, F=22.17, P < 0.001；t值、P值为组间比较所得, P1值、P2值分别为磷酸盐缓冲液组、脂肪干细胞基质胶组组内各时间点与前一时间点比较所得；“—”表示无此项 | ||||
| 磷酸盐缓冲液组 | 6 | 6.8±1.5 | 15.7±2.9 | 17.5±1.8 |
| 脂肪干细胞基质胶组 | 6 | 7.3±1.1 | 25.0±4.4 | 32.6±3.2 |
| t值 | 0.53 | 4.33 | 10.10 | |
| P值 | 0.610 | 0.001 | < 0.001 | |
| P1值 | — | < 0.001 | 0.167 | |
| P2值 | — | < 0.001 | < 0.001 | |
2.5.2. 瘢痕组织中TGF-β1与α-SMA表达
创面愈合后1、2、3、4个月, 基质胶组瘢痕组织中TGF-β1与α-SMA表达均明显低于PBS组（P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 除基质胶组创面愈合后4个月α-SMA表达（P > 0.05）外, 2组创面愈合后各时间点瘢痕组织中TGF-β1与α-SMA表达均明显升高（P < 0.05）。见图 4与表 6。基质胶组瘢痕组织中α-SMA与TGF-β1表达之间呈显著正相关（r=0.92, P < 0.001）。
图 4.
2组兔耳全层皮肤缺损创面愈合后4个月创面形成瘢痕组织中转化生长因子β1（TGF-β1）与α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达（均为棕色）情况 二氨基联苯胺×200。4A、4B.分别为磷酸盐缓冲液（PBS）组、脂肪干细胞基质胶组TGF-β1表达, 均较多, 图 4B中TGF-β1表达少于图 4A；4C、4D.分别为PBS组、脂肪干细胞基质胶组α-SMA表达, 均较多, 图 4D中α-SMA表达少于图 4C
表 6.
2组兔耳全层皮肤缺损创面愈合后各时间点创面形成瘢痕组织中TGF-β1与α-SMA表达比较（x±s）
| 组别 | 样本数 | TGF-β1 | α-SMA | |||||||
| 1个月 | 2个月 | 3个月 | 4个月 | 1个月 | 2个月 | 3个月 | 4个月 | |||
| 注：转化生长因子-β1（TGF-β1）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）处理因素主效应, F值分别为124.98、272.26, P值均 < 0.001；时间因素主效应, F值分别为151.80、386.57, P值均 < 0.001；二者交互作用, F值分别为7.10、8.05, P值分别为0.001、 < 0.001；t值、P值为组间比较所得, P1值、P2值分别为磷酸盐缓冲液组、脂肪干细胞基质胶组组内各时间点与前一时间点比较所得；“—”表示无此项 | ||||||||||
| 磷酸盐缓冲液组 | 6 | 0.050±0.006 | 0.065±0.003 | 0.089±0.008 | 0.103±0.006 | 0.078±0.004 | 0.112±0.009 | 0.157±0.008 | 0.170±0.008 | |
| 脂肪干细胞基质胶组 | 6 | 0.041±0.005 | 0.052±0.005 | 0.068±0.005 | 0.075±0.005 | 0.059±0.003 | 0.086±0.007 | 0.121±0.008 | 0.127±0.008 | |
| t值 | -2.83 | -5.46 | -5.61 | -8.63 | -10.11 | -5.79 | -8.08 | -11.96 | ||
| P值 | 0.018 | < 0.001 | < 0.001 | 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | ||
| P1值 | — | < 0.001 | < 0.001 | 0.001 | — | < 0.001 | < 0.001 | 0.007 | ||
| P2值 | — | 0.001 | < 0.001 | 0.027 | — | < 0.001 | < 0.001 | 0.080 | ||
2.6. 创面组织中VEGF和EGF表达
伤后7、14、21 d, 2组创面组织中VEGF表达均呈上升趋势, EGF表达均呈下降趋势。伤后7 d, 2组创面组织中VEGF和EGF的表达均接近（P > 0.05）；伤后14、21 d, 基质胶组创面组织中VEGF和EGF的表达均明显高于PBS组（P < 0.05）。与组内前一时间点比较, 2组创面伤后各时间点VEGF表达均明显增高（P < 0.05）, EGF表达均明显下降（P < 0.05）。见表 7。
表 7.
2组兔耳全层皮肤缺损创面伤后各时间点组织中VEGF和EGF表达比较（μg/L, x±s）
| 组别 | 样本数 | VEGF | EGF | |||||
| 7 d | 14 d | 21 d | 7 d | 14 d | 21 d | |||
| 注：血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）处理因素主效应, F值分别为74.46、76.16, P值均 < 0.001；时间因素主效应, F值分别为196.95、456.15, P值均 < 0.001；二者交互作用, F值分别为10.17、10.20, P值均 < 0.001；t值、P值为组间比较所得, P1值、P2值分别为磷酸盐缓冲液组、脂肪干细胞基质胶组组内各时间点与前一时间点比较所得；“—”表示无此项 | ||||||||
| 磷酸盐缓冲液组 | 6 | 296±22 | 395±18 | 443±21 | 260±9 | 183±10 | 118±11 | |
| 脂肪干细胞基质胶组 | 6 | 320±23 | 465±21 | 556±35 | 269±11 | 226±8 | 156±12 | |
| t值 | 1.89 | 6.14 | 6.75 | 1.39 | 8.17 | 5.85 | ||
| P值 | 0.088 | < 0.001 | < 0.001 | 0.194 | < 0.001 | < 0.001 | ||
| P1值 | — | < 0.001 | 0.001 | — | < 0.001 | < 0.001 | ||
| P2值 | — | < 0.001 | < 0.001 | — | < 0.001 | < 0.001 | ||
3. 讨论
脂肪干细胞基质胶作为一种新型脂肪干细胞产品, 在创面修复及抗纤维化方面均表现出良好的效果[11-13], 本研究在此基础上对其在创面愈合和瘢痕增生过程中的影响及相关机制进行了进一步探索。实验结果显示, 与PBS相比, 脂肪干细胞基质胶能够明显加速兔耳创面愈合。本研究中, 与PBS组比较, 基质胶组在创面愈合中后期肉芽组织再生及上皮化程度更好, MVC明显增多, 胶原间隙更小, 排布相对规则。有文献报道, 脂肪干细胞基质胶中的主要成分脂肪干细胞可以刺激VEGF表达, 而VEGF可以直接或间接作用于血管生成过程, 促进血管新生[17-19]。本实验同样检测到伤后14、21 d基质胶组创面组织中VEGF表达较PBS组明显升高, 表明植入的脂肪干细胞基质胶可以不断刺激创面分泌VEGF, 促进血管新生, 改善创面组织的缺血状态。与伤后14 d比较, 伤后21 d基质胶组创面组织中MVC明显升高, PBS组MVC则无明显增加, 这与张锐等[20]的研究结果一致。然而有学者指出创面愈合过程中的血管生成在初始炎症期增加, 组织增生期持续升高, 重塑期则会逐渐消退[21], 与本研究创面愈合后期MVC的变化趋势不一致。这一差异的产生, 可能与脂肪干细胞基质胶刺激创面VEGF的持续分泌有关；此外EGF可以作为血管内皮细胞的有丝分裂原, 诱导血管内皮细胞的分化, 加速血管新生[22], 结合本研究结果中伤后14、21 d基质胶组创面组织中EGF表达的明显升高, 推测这也可能是该组创面愈合后期MVC持续增加的原因之一。另外有研究指出, EGF可以在创面愈合中后期通过激活Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶促进表皮细胞、Fb等多种细胞的增殖和迁移, 并能使缺损区上皮KC及上皮钉突数量增多, 加速皮肤再生, 促进创面修复[23-26]。本课题组在伤后14、21 d观察到, 与PBS组比较, 基质胶组创面组织中上皮细胞层数明显增多, 排列整齐, 上皮真皮交界处可见更多的上皮脚和钉突结构, 提示脂肪干细胞基质胶可能通过刺激创面内源性表达EGF, 促进创面修复过程的细胞增殖与分化, 加速肉芽组织再生及上皮化, 推动创面愈合的进程。
本研究显示, 在创面愈合后, 与PBS相比, 脂肪干细胞基质胶能够明显抑制瘢痕增生。创面愈合后1、2、3、4个月, 与PBS组比较, 基质胶组瘢痕组织VSS评分更低, 瘢痕组织真皮厚度更薄, 胶原排列更稀疏, 规则有序, CVF更低。值得注意的是, 在创面修复和瘢痕增生阶段, 与PBS组比较, 基质胶组胶原沉积情况表现出不同的变化, 创面修复期胶原分泌增多、排列致密、规则有序, 瘢痕增生阶段胶原分泌减少且相对稀疏。本课题组推测, 在创面修复阶段, 脂肪干细胞基质胶能够促进胶原合成, 抑制胶原降解, 从而加速创面愈合；而在瘢痕增生阶段, 为防止瘢痕组织过度纤维化, 脂肪干细胞基质胶可以调节相关细胞因子的分泌, 进而抑制胶原纤维含量的持续大量增加。并且, 在伤后21 d至创面愈合后1个月, 基质胶组创面组织中胶原含量并无明显变化, 而PBS组创面组织中胶原含量则显著增加, 说明脂肪干细胞基质胶对胶原纤维的表达的抑制作用可能在瘢痕增生初期即发生。此前有研究表明, 脂肪干细胞干预后瘢痕增生受到抑制的机制可能与TGF-β1表达下调有关[27-28]；此外, TGF-β1还能诱导Fb高表达α-SMA, 从而导致创面收缩及瘢痕挛缩[29-30], 且TGF-β1对α-SMA的诱导作用呈浓度依赖性[31]。因此, 本研究对脂肪干细胞基质胶诱导创面愈合后TGF-β1、α-SMA的表达进行检测。研究显示基质胶组干预后瘢痕组织中TGF-β1和α-SMA的表达均较PBS组明显降低, 且基质胶组瘢痕组织中TGF-β1和α-SMA表达呈显著正相关, 说明脂肪干细胞基质胶对瘢痕组织中TGF-β1、α-SMA的表达有抑制作用, 且对α-SMA的抑制作用可能与TGF-β1表达降低有关。值得关注的是, 在创面愈合后4个月, 基质胶组α-SMA表达不再继续明显增加, 而PBS组α-SMA含量仍明显上升。由此推测脂肪干细胞基质胶的作用可能使兔耳瘢痕提前进入消退期, 此阶段2组瘢痕外观的变化差异同样印证了这一猜想；然而此时的CVF及瘢痕真皮厚度却并没有表现出相同趋势, 出现这一差异的原因是需要继续研究的课题。
本研究证实受伤早期进行脂肪干细胞基质胶干预, 不仅可以缩短创面愈合时间, 提升创面修复效果, 还能抑制创面愈合后的瘢痕增生情况。其可能机制分别与脂肪干细胞基质胶在创面修复期增加胶原沉积并促进VEGF、EGF的分泌, 在瘢痕增生期减少胶原沉积并抑制TGF-β1、α-SMA的表达有关。因此, 不论是促进创面修复还是抑制瘢痕增生, 脂肪干细胞基质胶移植都是一种有潜能的治疗手段, 本研究也为其今后的临床推广提供了参考。
Funding Statement
山东省自然科学基金面上项目（ZR2021MH338）；山东省中医药科技项目面上项目（2020M170）
General Program of Shandong Natural Science Foundation (ZR2021MH338); General Program of Shandong Traditional Chinese Medicine Science and Technology Project (2020M170)
本文亮点
(1) 证实脂肪干细胞基质胶既能促进兔耳全层皮肤缺损创面愈合, 又能抑制创面愈合后瘢痕增生。
(2) 证实前述促进创面愈合的机制可能与刺激VEGF和EGF的表达有关, 抑制瘢痕增生的机制可能与抑制TGF-β1和α平滑肌肌动蛋白的表达有关, 为采用脂肪干细胞基质胶治疗创面和瘢痕提供了理论依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明 李梁：实验设计、实验操作、数据分析及论文撰写；白南、付妍婕：技术和材料支持；吴灿、张玉姣：实验操作、数据分析；陈远征：研究指导、经费支持、论文修改
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