口腔黏膜干细胞促进创面愈合的机制研究进展

Abstract

Wound healing is a complex process that requires the participation of multiple cells and cytokines. During the process of wound healing, abnormality in any stage of the process may lead to the development of a chronic refractory wound. Research has confirmed that various stem cells can promote wound healing, but some stem cells are limited in clinical application due to difficulties in isolation, susceptibility to apoptosis, ethical and legal issues. Oral mucosal stem cells (OMSCs) can avoid the above problems. This type of stem cells has the characteristics of embryonic stem cells, immune regulatory ability, and strong homogeneity. It plays an important role in the process of scarless oral wound healing, and has become a research hotspot in promoting wound healing and reducing scar formation. This article reviews the research on the mechanism, clinical application prospects, and current problems of OMSCs in promoting wound healing.

皮肤是人体重要的保护屏障。皮肤创面愈合过程复杂微妙, 任何一个环节出现异常均可导致创面不愈合, 形成慢性溃疡。慢性创面形成会直接导致患者生活质量下降, 同时其昂贵的治疗费用将给患者家庭带来沉重经济负担。因此, 寻求快速有效治疗慢性创面的方法是目前的研究热点。

干细胞可作为持续且有效的细胞因子、外泌体载体, 同时还具有分化为创面愈合所需细胞的能力, 是目前研究的热点。干细胞的种类较多, 其中有关胚胎干细胞（ESC）、骨髓干细胞（BMSC）、脂肪干细胞（ASC）^[1]、口腔黏膜干细胞（OMSC）及其他成体干细胞等的研究较多。相对于BMSC、ASC及ESC, OMSC获取容易、不易凋亡、同质性强、提取及处理过程不涉及伦理及法律问题。同时OMSC与皮肤均起源于外胚层, 在促进皮肤创面愈合方面相较由中胚层来源的ASC及BMSC具有明显优势^[2]。BMSC、ASC及ESC等具有潜在致瘤性, 而OMSC可表达抑瘤基因, 可规避应用于慢性创面致瘤的可能性^[3]。同时, OMSC可分化成为上皮细胞且分泌多种生长因子, 加速创面愈合, 在慢性创面愈合方面极具研究价值。因此本文将从OMSC促进创面愈合的机制、潜在的应用范围以及目前存在的问题等方面进行综述。

1. OMSC促进创面愈合的机制研究

1.1. OMSC具有胚胎干细胞特性

具有胚胎干细胞特性的细胞的分化能力强（多能性）, 增殖能力持久。OMSC是起源于神经嵴的成体干细胞, 神经嵴是神经发育过程中在神经管和神经基板之间短暂存在的胚胎细胞群^[4]。OMSC通过分泌多能性转录因子性别决定区Y框蛋白2（SOX2）和Nanog维持自身干细胞特性、自我更新, 并在维持组织稳态等方面发挥关键作用。研究证实, SOX2通过调节Hippo信号通路效应器Yes关联蛋白1使OMSC具有较强的增殖能力及多向分化潜能^[5]。OMSC可向间充质谱系（中胚层）分化, 分化为骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等；其还具有神经干细胞（外胚层）的属性, 在无血清培养基中可分化为神经球、神经元及神经胶质细胞^[6]。目前已有研究者将OMSC应用于各种动物模型中进行细胞治疗, 如在小鼠皮肤辐射综合征模型中, 使用人OMSC可促进皮肤创面愈合；将人OMSC与纤维蛋白支架结合植入scid小鼠（免疫缺陷小鼠）骨骼部位能够发育成矿化组织^[7], 用于治疗小鼠牙周缺损；用含有小鼠OMSC的生物膜片覆盖小鼠放射性溃疡创面, 结果显示OMSC不仅保持原有的生长速度和分裂增殖能力, 还降低了创面溃疡复发率, 与此同时, 局部创面形成了丰富的微血管化结构, 这与OMSC的干细胞特性相关^[8]。

1.2. OMSC的免疫调节和抗炎作用

创面愈合过程中伴随着巨噬细胞集聚、ECM沉积和促炎及抗炎的转化——M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。创面形成初期为促炎阶段, 在该阶段, 巨噬细胞表现为M1型, 分泌IL-1β、IL-12和TNF-α等细胞因子, 吞噬创面的细胞碎片和病原体, 避免感染的发生。在创面愈合后期, 巨噬细胞出现极性改变, 转变为抗炎M2型巨噬细胞, 分泌IL-10、TGF-β等细胞因子抑制炎症反应, 此时组织开始修复。M1型巨噬细胞/M2型巨噬细胞转化在创面愈合及炎症控制中发挥关键作用^[9]。M1型巨噬细胞是Th1细胞因子（γ干扰素）诱导激活的效应细胞, M2型巨噬细胞是Th2细胞因子（IL-4、IL-10）诱导激活的效应细胞。

OMSC通过激活Th调节创面的炎症反应。研究证实, 大鼠OMSC通过吲哚胺2, 3双加氧酶（IDO）刺激大鼠Th增殖和活化^[10]。大鼠OMSC和Th共培养研究显示, Th激活表现为Th1型分泌的促炎性细胞因子γ干扰素和TGF-β₁诱导M1型巨噬细胞活化反应；在γ干扰素刺激下, OMSC表达IDO和IL-10水平升高, 使Th表现为Th2型, 从而诱导M2型巨噬细胞活化抑制炎症反应^[10]。研究证实, 在大鼠口腔黏膜炎模型中, 人OMSC可促使IL-6表达增多, 从而将大鼠口腔局部创面中巨噬细胞极化为M2表型；OMSC可根据创面微环境改变, 调整巨噬细胞极化, 从而缩短创面愈合时间^[11]。

OMSC可分泌前列腺素E2（PGE2）, 对先天性免疫细胞, 尤其是树突状细胞（DC）具有一定调节作用。DC活化后可呈递抗原给T细胞, 进而激活炎症反应。OMSC通过环氧合酶2-PGE2途径减少DC成熟细胞标志物CD11c及CD80表达, 从而抑制DC成熟活化^[12]。OMSC的免疫调节作用及抗炎作用可有效促进创面愈合。

1.3. OMSC分泌的细胞生长因子促进创面愈合

1.3.1. OMSC分泌FGF-2

FGF-2是OMSC分泌的主要细胞生长因子之一。在创面愈合过程中, KC可从极化的立方形态转变为具有迁移能力的梭形细胞形态, 以便快速迁移以闭合创面, 这被称为上皮-间质转化（EMT）。OMSC分泌的FGF-2不仅可促进KC的EMT, 还可激活中胚层衍生细胞如血管内皮细胞, 促进新血管的形成, 调节胶原蛋白和基质沉积, 从而加速慢性和急性创面闭合。OMSC分泌的FGF-2还具有抗纤维化作用, 通过降低平滑肌肌动蛋白（SMA）及纤维连接蛋白的表达水平, 进而拮抗肌Fb分化及抑制纤维化。对大鼠全层皮肤缺损及切口疝创面模型的研究表明, 相对于空白对照组, 使用肝素-纤维蛋白复合基质释放的FGF-2增加了Fb增殖和胶原蛋白密度, 减少了创面周边皮瓣坏死的区域^[13]。另有大鼠切口疝实验显示, FGF-2可增强组织愈合强度且降低切口疝的复发率^[14]。临床研究证实, FGF-2可促进Ⅱ度烧伤和慢性溃疡的创面愈合^[15]。在小鼠全层皮肤缺损创面中使用FGF-2, 可提高创面愈合强度和速度^[16]。OMSC可持续有效地释放FGF-2, 作为FGF-2合适载体之一作用于创面, 可有效促进创面愈合。

1.3.2. OMSC分泌EGF和VEGF

有学者将OMSC应用于小鼠糖尿病溃疡创面, 观测到创面炎症细胞因子TGF-α通过p38/MAPK通路刺激OMSC分泌表达EGF及VEGF, 使创面处肉芽组织增厚及再上皮化^[17]。OMSC分泌表达的EGF作为已知促血管生成因子, 可促进创面血管床再生, 加速创面愈合。一项前瞻性、开放性试验显示, 含重组人EGF的喷雾或软膏可缩短糖尿病足患者创面愈合时间并降低截肢风险^[18]。使用小鼠EGF治疗敲除核因子κB p50亚基小鼠糖尿病创面后, 其创面闭合率相对于未敲除基因小鼠显著降低。EGF可通过调节细胞核因子κB控制CCCTC结合因子的激活, 是促进上皮细胞迁移重要的基因调节剂^[19]。EGF可诱导VEGF-A的产生, 促进人乳腺癌细胞中肿瘤血管的生成, 同时诱导KC的迁移和糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面再次上皮化^[17]。VEGF负责调节胚胎及成人发育中血管和淋巴管生成, 在维持血管通透性及血管舒张中发挥重要作用, 在创面愈合过程中可促进血管生长^[20]。研究证实, 在小鼠全层皮肤缺损模型中, VEGF通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B及胞外信号调节激酶途径促进血管增生^[21]。VEGF可局部上调人全层皮肤缺损创面中血小板衍生生长因子b和FGF-2, 同时招募内皮祖细胞, 调整创面微环境, 加速创面愈合及组织重塑^[21]。小鼠放射性溃疡创面局部EGF增多可反作用于OMSC, 促使其分化为上皮细胞^[22]。

1.3.3. OMSC作为细胞因子载体的优势

慢性创面具有循环差、低氧、高pH值, 以及活性氧、蛋白水解酶与促炎性细胞因子水平高等特点, 修复过程需要多种细胞、细胞因子及外泌体等参与。为创面补充生长因子及外泌体的方法如下：（1）将细胞因子或外泌体直接外用于创面。该方法操作简单、成本低, 但细胞因子或外泌体稳定性差、易失活、半衰期短, 效果较差^[23]。（2）使用富含生长因子或外泌体的敷料, 包括藻酸盐、壳聚糖、羧甲基纤维素钠凝胶及纳米材料等生物材料^[24]覆盖创面。敷料中的生长因子可以被持续释放, 其半衰期高于直接将生长因子应用于创面上, 且操作简单；若创面渗出较多, 则需频繁更换敷料, 价格升高, 性价比降低。（3）使用干细胞载体。干细胞作为细胞因子的有效载体, 可表达分泌多种趋化因子, 诱导其他细胞迁移增殖。干细胞胚胎起源不一, 成体干细胞的分化发育能力及方向不一^[25]。骨髓及脂肪来源的间充质干细胞（BMSC及ASC）起源于中胚层, 较易向中胚层分化, 可修复骨、软骨、肌肉等由中胚层发育而来的组织缺损。BMSC提取困难, 产量低, 异质性高, 免疫抑制能力差。ASC的提取较BMSC容易, 产量高, 异质性中等, 但易凋亡^[26]。OMSC较中胚层来源的干细胞更容易分化为外胚层组织（皮肤、皮肤附属器、口鼻黏膜上皮等）, 在创面修复过程中具有先天的优势^[27]。研究证实, 同时提取胎鼠BMSC和OMSC进行培养, 24 h内BMSC活力高于OMSC, 48 h时两者活力差距不大, 96 h时OMSC的活力是BMSC的1.5倍^[28]。有研究者报道BMSC需要碱性FGF（bFGF）的刺激才可以持续增殖, 而OMSC的增殖不依赖任何外源性的生长因子的刺激辅助^[29]。

临床所用细胞因子大多为重组蛋白, 半衰期短, 稳定性较内源性细胞因子差, 且其免疫原性会造成一定的不良反应。而创面愈合的不同阶段所需细胞因子的种类及剂量不同^[30], 直接使用或以敷料方式外用无法精准满足创面愈合需求。然而, 以干细胞为细胞因子的载体, 可根据创面微环境的改变分泌不同种类及剂量的内源性细胞因子, 同时避免了细胞因子的免疫原性。OMSC作为细胞因子载体在促进创面愈合方面, 可用于扩张皮瓣后期或者游离皮瓣移植术后促进血管再生及皮瓣成活, 以实现组织修复重建；还可种植于支架, 以进行组织缺损修复重建等^[31]。

2. OMSC抑制瘢痕生成

Isaac等^[32]证实, OMSC促进创面无瘢痕愈合的特性与其胚胎起源有关。OMSC具有较强的增殖能力、分化能力、迁移能力, 可以缩短创面愈合时间, 降低创面愈合过程中瘢痕增生的概率。有研究者通过比较人全层皮肤缺损及牙周病导致牙龈溃疡愈合过程显示, OMSC的αvβ6整合素的持续表达以及较高水平的TGF-β₃在创面无瘢痕愈合中发挥着主要作用^[33]。

OMSC还可通过以下机制抑制瘢痕增生：（1）肌Fb是参与瘢痕形成的细胞之一, 其阳性标志物是α-SMA。在小鼠糖尿病溃疡创面模型中, 使用OMSC后早期虽然创面大小变化不明显, 但α-SMA表达明显减少, 表明肌Fb数量减少^[34]。OMSC可通过抑制TGF-β/Smad2途径, 使人肌Fb形成显著减少^[33], 进而抑制瘢痕增生。（2）瘢痕组织伴有肥大细胞的浸润, 而肥大细胞可分泌多种活性因子如P物质及血管活性肽, 这些因子可促进Fb增殖和胶原分泌, 是调节瘢痕形成的重要物质。在小鼠全层皮肤缺损模型中, OMSC可通过抑制肥大细胞旁分泌作用抑制瘢痕增生^[35]。OMSC通过调整创面炎症反应及免疫反应, 抑制Fb的活性, 促进创面愈合、组织再生及抑制瘢痕形成。（3）基质金属蛋白酶（MMP）是炎症的重要调节剂, 可抑制或激活趋化因子、细胞因子和生长因子。胎儿创面的无瘢痕愈合研究显示, 创面MMP表达明显增加^[36]。OMSC中MMP的mRNA和蛋白水平高于其他成体干细胞, 可通过MMP降解重塑ECM, 对创面后期瘢痕形成有一定的调控作用^[36]。

3. OMSC的其他优势及应用范围

有研究者报道, 人BMSC在体外培养2代或3代方出现均匀同质, 在第8~10代时表现出典型的Hayflick现象, 如细胞增大、形态异常、干细胞标志物表达下降等, 出现细胞老化并失去其干细胞特性；培养过程中使用的bFGF可降低BMSC的CD44表达, 抑制BMSC归巢^[37]。干细胞归巢到炎症部位是其主要的应用特点, 在炎症区可激活并分泌具有生物活性的介质^[37]。OMSC原代细胞既均匀同质又可在短时间内增殖出大量的干细胞, 在后期传代过程中也能保持这个状态；培养过程中无须额外使用生长因子, 避免了外源性生长因子导致的归巢能力下降^[32]。

创面愈合微环境与肿瘤发展的微环境有共同之处。间充质干细胞应用于创面可促进创面愈合, 同时亦可营造肿瘤生长微环境及促进肿瘤进展。长期的慢性创面易发展为皮肤癌, 在性质不明确的慢性创面上, 间充质干细胞的不当应用可能会导致肿瘤发生和进展。有研究者阐述人OMSC在体外培养的过程中稳定性高, 可长期保持正常核型和端粒酶的活性且不致瘤；且OMSC所分泌的SOX2和八聚体结合转录因子4具有肿瘤抑制效应^[37], 也规避了该类细胞在创面应用时致瘤的可能性。

目前, 有关OMSC的研究范围广泛。将OMSC注射于小鼠糖尿病溃疡创面下方可显著加速创面愈合^[38]。在构建的结肠炎小鼠模型中, 静脉输注OMSC可显著改善结肠透壁炎症, 促进肠道恢复正常。因OMSC起源于神经嵴, 故其外泌体可促进神经再生, 改善神经退行性疾病^[39]。OMSC具有高增殖和高分化能力, 同时表达不同成体干细胞及上皮细胞特异性标志物, 可促进大鼠角膜上皮的重建^[40]。将人OMSC植于特定支架上并给予EGF刺激, 可使OMSC分化为骨细胞修复小鼠骨缺损^[41]。

4. 总结与展望

OMSC作为目前新兴治疗创面的细胞之一, 提取容易且具有较强的增殖分化能力, 在创面愈合、肠道炎症修复、神经再生、角膜缘干细胞缺乏症及骨修复等热点领域中发挥重要的作用, 具有广泛的临床应用前景。我国对于OMSC及其衍生物的研究较少, 处于起步阶段, 无对应的临床产品。目前, 只能从口腔黏膜及牙龈黏膜中提取OMSC, 供区面积小, 单次细胞提取量受限, 提取术后需注意饮食及特殊口腔护理。或可根据OMSC的特性找到合适诱导因子进而产生具有OMSC特性的诱导多能干细胞, 解决细胞来源受限问题, 扩大其临床应用范围。目前关于OMSC促进创面愈合的研究较少, 其具体作用机制还需要进一步研究证实, 且其在创面长期应用的效果及不良反应还未明确。此外, 将OMSC开发用作药物载体或制成生物制剂或有广泛前景, 但需要临床和实验研究进一步评估其安全性及有效性。

Funding Statement

河南省2022年科技发展计划项目（222102310188）

Science and Technology Development Plan Program of Henan Province of China (222102310188)