核转录因子红系2相关因子2在创面愈合中的作用研究进展

Abstract

Wound healing is one of the common pathophysiological processes in the body. How to improve the condition of wound healing to promote rapid wound healing has always been a hotspot in research. Oxidative stress is one of the important factors affecting wound healing. Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) is a classic antioxidant stress factor as well as a factor with great potential in facilitating wound healing. The activation of Nrf2 can regulate the downstream antioxidant stress elements and play roles of anti-apoptosis and cell homeostasis maintaining, which improves wound healing environment and promotes wound repair. This paper summarized the common agonists and inhibitors of Nrf2 and reviewed the roles of Nrf2 in promoting skin wound healing including diabetic ulcers, radiation injury, and ischemia-reperfusion injury, etc.

皮肤是直接与外界接触的器官, 可以通过其屏障功能保护机体免于各类刺激的损伤。皮肤组织受损后形成创面, 创面不能愈合将导致机体脱水、感染甚至死亡^[1]。创面愈合, 即皮肤组织从缺损或离断到修复愈合的过程, 是机体常见的病理生理过程之一^[2]。我国每年需要进行各种创面处理的患者多达1亿多人次^[3], 由此产生的高额治疗费用给个人及公共卫生系统造成沉重的负担。

创面愈合是一个精细又复杂的过程, 而氧化应激、炎症反应、血液循环供应不良、胶原蛋白的合成减少等多种因素均可使创面愈合延迟^[4]。其中, 氧化应激在创面愈合不良中扮演的角色尤其引人注目。在氧化应激状态下, 皮肤组织中活性氧大量生成^[5], 加剧了炎症反应和细胞凋亡, 干扰了ECM的生成和组织重塑等, 使创面的愈合环境恶化^[6]。研究表明, 改善创面氧化应激能有效缩短创面的愈合时间, 促进创面愈合^[7]。核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）是一种经典的抗氧化因子, 激活或上调Nrf2的表达可以有效缓解氧化应激对创面愈合的不利影响。本文将围绕Nrf2在创面愈合中的作用及其机制进行文献综述。

1. Nrf2的分子结构和调控

Nrf2是一种转录因子^[8], 于1994年首次被发现^[9], 属于Cap'n'Collar（CNC）转录因子家族^[10]。Nrf2是CNC转录因子家族中具有调节氧化应激功能的因子, 含有7个Nrf2-环氧氯丙烷同源（Nrf2-epichlorohydrin homology, Neh）结构域^[11], 每个结构域具有不同的功能。Neh1结构域与小Maf蛋白结合形成异二聚体, 该结构域能识别抗氧化响应元件（ARE）基因上特定的序列, 具有高度的保守性。Neh2结构域与Nrf2负调控因子Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）相互作用, 有助于Nrf2泛素化及蛋白酶体的降解^[12]。Neh3、Neh4、Neh5结构域具有反转录功能, 参与靶基因Nrf2的转录^[13]。Neh6是一个富含丝氨酸的结构域, 可以不依赖Keap1负性调控Nrf2^[14]。Neh7和视黄醛X受体α的结合对Nrf2转录活性发挥抑制作用^[15]。生理状态下, Nrf2的Neh2结构域和Keap1相结合, 使Nrf2持续性泛素化和降解, 因此, 在无外界刺激时, Nrf2的基础含量维持在较低的水平。当机体处于氧化应激环境中时, Keap1在活性半胱氨酸残基处被氧化后与Nrf2分离, 使得Nrf2处于稳定状态并易位至细胞核, 之后与下游的ARE等抗氧化应激元件进一步反应, 并诱导醌氧化还原酶1（NQO1）、谷胱甘肽硫转移酶、血红素加氧酶1（HO-1）、谷氨酰半胱氨酸连接酶等一系列细胞保护应激因子表达^[16], 发挥抗氧化应激作用。

2. Nrf2激动剂和抑制剂

皮肤组织Nrf2含量的高低对创面愈合具有重要影响。Nrf2激动剂和抑制剂, 是研究者探索Nrf2在创面愈合中作用的重要工具, 也是新药研发的重要参考。近年来研究显示, 越来越多的药物或因子可作为Nrf2激动剂或抑制剂, 在创面愈合过程中使用这些药物干预, 可通过调节Nrf2的活性加快或延迟创面愈合。

目前报道的Nrf2激动剂包括萝卜硫素、肉桂醛、富马酸二甲酯（DMF）、非瑟酮、芍药苷、川穹嗪、咖啡酸苯乙酯（CAPE）、异甘草素、芒果苷、辅酶Q10、白藜芦醇、5,7-二羟基色酮、奥马索酮、黄柏酮、马来酸二乙酯^[17-20]等, Nrf2抑制剂包括ML385^[21]、布鲁沙醇^[22]、氧化槐果碱^[23]。随着研究的深入, 未来可能会有更多的Nrf2的调节因子或药物问世。

3. Nrf2在不同类型创面愈合中的作用

临床上, 创面愈合受多种因素的干扰, 部分创面难以愈合甚至不愈合, 造成严重后果。现有研究显示, Nrf2在多种类型的创面愈合过程中发挥重要作用。

3.1. 促进糖尿病创面愈合

糖尿病创面是临床上常见的创面类型之一。流行病学调查显示, 650万慢性创面患者中, 35.3%是糖尿病患者^[24]。高糖环境下DNA氧化损伤严重, 氧化应激加剧了炎症反应^[25-26], 导致细胞凋亡增加、血流供应难以恢复、新生上皮生成受阻^[27], 以上病理因素导致糖尿病创面愈合非常困难。

已有研究证明, 高糖环境下Nrf2的表达被抑制, 而通过激动剂上调Nrf2表达可以有效促进创面愈合^[28]。有研究显示, 敲除了Nrf2基因的糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合时间较野生型糖尿病小鼠明显延长；腹腔注射Nrf2激动剂肉桂醛治疗敲除了Nrf2基因的糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面7 d后, 创面中Nrf2及其下游的ARE被激活, 利于创面组织增生和重塑的TGF-β₁上调, 创面愈合速度较未经治疗的同型对照明显加快^[7]。为了进一步验证Nrf2的作用机制, 研究者在高糖条件下培养人永生化KC（HaCaT）, 观察到HaCaT中Nrf2表达降低, 活性氧水平升高, 细胞增殖、迁移能力减弱；使用Nrf2激动剂干预48 h后, HaCaT中活性氧水平显著下降, 细胞增殖、迁移能力增强^[20]。研究者利用糖尿病大鼠构建Ⅲ度烧伤创面模型, 研究显示, 与未经治疗同型对照比较, 腹腔注射了Nrf2激动剂DMF的大鼠伤后第6天创面中Nrf2表达提高, 下游的抗氧化基因HO-1、NQO1等被激活, IL-1β、IL-6的表达降低了约87%, 活性氧生成减少, 氧化应激现象改善；与仅注射玉米油载体的同型对照比较, 腹腔注射了Nrf2激动剂DMF的大鼠创面愈合的时间明显缩短；相反, 经Nrf2抑制剂化合物ML385干预12 d后的大鼠创面中IL-1β、IL-6的表达较未经治疗同型对照增加了3.7倍, 创面愈合时间较经DMF治疗的大鼠延长^[28]。研究者对高糖环境下培养的大鼠腹膜巨噬细胞分别予以Nrf2激动剂和抑制剂干预5 d后, 观察到Nrf2激动剂提高了巨噬细胞中Nrf2的表达, 抑制了细胞的氧化应激水平, 而Nrf2抑制剂则加剧了细胞的氧化应激^[28]。

除了使用Nrf2激动剂, 通过沉默Keap1基因, 也可以提高Nrf2的表达, 促进糖尿病创面愈合^[29]。前文已述, 生理情况下Keap1与Nrf2结合并使Nrf2降解, Keap1的失活可以使Nrf2发挥其抗氧化作用^[16]。基于此原理, 研究者利用糖尿病小鼠构建背部全层皮肤缺损创面模型, 并将小鼠分为2组, 使用搭载了Keap1-小干扰RNA（siRNA）的新型脂质脂蛋白复合物液体治疗实验组创面, 使用搭载了空白对照siRNA的脂蛋白复合物液体治疗对照组创面, 10 d后观察到相较于对照组小鼠, 实验组小鼠创面中Nrf2表达提高, VEGF、TGF表达增加, 活性氧含量降低；此外, 实验组小鼠创面愈合时间较对照组缩短了11 d^[29]。

以上研究表明, Nrf2可以通过抗氧化应激作用加快创面愈合的速度。Nrf2还可能通过增加皮肤新生血管生成促进创面愈合。研究显示, 与仅注射生理盐水的同型对照比较, 腹腔注射Nrf2激动剂木犀草素的糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面伤后7~14 d的VEGF表达升高, 血管再生能力明显提高, 肉芽组织和血管生成增多, 创面愈合时间缩短^[30]。

3.2. 减轻辐射造成的皮肤损伤

辐射是指发射源发出的电磁波或粒子向远处传播扩散的现象^[31]。紫外线辐射是日常生活中最常见的辐射之一, 人体皮肤长期暴露于紫外线之下会出现水肿、红斑、色素沉着、松弛老化等^[32]。除此以外, 紫外线还能诱发真皮炎症和皮肤癌^[33]。

有研究者认为, 紫外线损伤皮肤的机制可能与皮肤局部活性氧的蓄积有关^[34]。作为经典的抗氧化因子, Nrf2在减轻紫外线损伤中的作用引起了人们的关注。研究者将无毛BALB/c小鼠暴露于紫外线下10周, 观察到所有被照射的小鼠背部皮肤均出现了水分丢失、老化、红肿和皮肤炎, 皮肤中活性氧、IL-6和核因子κB表达上升, Nrf2的表达降低；使用Nrf2激动剂非瑟酮干预治疗6周后, 皮肤中胶原蛋白、水通道蛋白合成增加, 水分丢失程度降低, 活性氧、环氧合酶2、IL-6和核因子κB表达降低, 红肿消退, 皱纹减少^[32]。研究者将人皮肤KC暴露于紫外线下48 h, 观察到与照射前比较, 细胞凋亡数量增多, 活性氧含量明显上升, DNA受损；使用Gremlin蛋白干预细胞8 h后, Nrf2表达增加且程度与Gremlin蛋白剂量呈正相关, 细胞的凋亡数量减少, 活性氧含量显著下降, DNA损伤程度降低^[28]。为了进一步验证Nrf2对细胞的保护作用, 研究者使用Nrf2-短发夹RNA沉默细胞中Nrf2的表达, 观察到细胞凋亡数量增多, 活性氧含量上升, DNA损伤加重, Gremlin蛋白在紫外线下对细胞的保护能力基本消失^[35]。上述实验表明, 使用激动剂上调Nrf2表达, 可以减轻紫外线辐射诱导的皮肤氧化应激, 保护皮肤细胞。

3.3. 提高移植皮瓣的存活率

皮瓣由皮肤以及皮下脂肪组织构成, 常用于覆盖外科手术中的软组织缺损。目前皮瓣移植是外科创伤修复常用的方法之一^[36], 但皮瓣在临床应用中存在远端血管供血不足的情况, 由此导致的缺血坏死使皮瓣的实际存活率较低。皮瓣的缺血坏死可能与氧化应激导致的细胞凋亡有关^[37]。Nrf2作为重要的抗氧化因子, 在提高皮瓣存活率中发挥着重要的作用^[21]。

Jiang等^[21]在SD大鼠背部制作了面积为9 cm×3 cm、与筋膜完全分离的皮瓣, 并将皮瓣缝合到供体床上, 在第3天观察到皮瓣远端区域逐渐出现水肿和坏死, 给予Nrf2激动剂芍药苷干预治疗, 7 d后观察到皮瓣中抗氧化因子HO-1表达增加, 新生血管数量、血流强度明显增加, 皮瓣坏死和水肿状况好转；而在给予Nrf2抑制剂ML385干预7 d后, 大鼠皮瓣的水肿和坏死进一步加重, 血管生成数量减少, 皮瓣存活面积减小。为了进一步明确芍药苷保护皮瓣的作用机制, 研究者在体外利用过氧化氢叔丁醇诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）产生氧化应激, 干预24 h后观察到与干预前比较, HUVEC凋亡数量明显减少, 抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）表达水平上升, 促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达水平下调, 细胞中活性氧含量减少, Nrf2及下游抗氧化元件HO-1表达增加；使用Nrf2-siRNA沉默了Nrf2表达后, 几乎完全逆转了芍药苷对细胞的保护作用, 活性氧含量增加, 促凋亡蛋白Bax表达水平提高, 细胞凋亡数量增加^[21]。另有研究者在SD大鼠背部皮肤实施皮瓣手术, 将皮瓣与筋膜完全分离并抬高, 仅留下2条血管对皮瓣供血, 给予其中部分大鼠皮瓣Nrf2激动剂川穹嗪干预治疗, 在治疗第7天可观察到Nrf2、Nrf2上游信号分子蛋白激酶B（Akt）表达增加, 促凋亡蛋白Bax表达水平显著下调, 抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著上升, 皮肤水肿程度减轻, 新生血管数量增多, 皮瓣存活面积明显增加；而在经川芎嗪治疗的皮瓣上使用Akt抑制剂LY294002, 可观察到Nrf2表达被抑制, 皮瓣水肿和坏死进一步加重, 抑制了川穹嗪对皮瓣的保护作用^[38]。

上述研究说明, 提高Nrf2的表达可以降低皮瓣组织的氧化应激水平, 有利于新生血管生成, 从而改善皮瓣水肿坏死, 提高移植皮瓣的存活率。

3.4. 改善皮肤缺血再灌注损伤

长期卧床患者的局部皮肤组织因受到长时间的压迫, 容易形成慢性皮肤病变——压疮^[39]。目前的研究认为, 缺血再灌注损伤是压疮形成的重要因素之一^[40]。具体而言, 压迫使皮肤局部血液循环受阻, 随着患者体位改变, 压迫的部位再次得到血流灌注, 这个过程反反复复, 会诱导大量活性氧和炎症细胞蓄积^[41], 直至损伤局部皮肤组织。

Schanuel等^[42]利用一对钕磁片夹起小鼠皮肤使其缺血, 数小时后再释放, 反复多次, 模拟机体缺血再灌注过程, 造成小鼠背部2块对称的圆形溃疡, 之后予以橄榄油饲料或者普通饲料。结果显示, 与进食普通饲料的小鼠比较, 经橄榄油饲料喂养的小鼠在进食后第7天即出现创面中Nrf2表达增加、中性粒细胞等炎症细胞数量减少、活性氧含量降低、胶原蛋白合成增多、创面收缩率增加等现象。另有研究者利用磁板周期性夹闭小鼠背部皮肤构建皮肤缺血再灌注模型后, 给予对照组腹腔注射生理盐水、实验组腹腔注射Nrf2激动剂CAPE干预, 结果显示, 与对照组比较, 实验组小鼠创面中TNF-α、核因子κB等促炎性细胞因子水平以及炎症细胞数量均在模型建立7 d后明显降低, 胶原蛋白表达水平在模型建立后3~12 d持续升高, 模型建立7 d后上皮细胞增殖数量、Fb密度增加, 创面再上皮化速度明显加快^[43]。

上述研究表明, 通过不同手段增加Nrf2的表达水平, 可以有效降低炎症水平, 改善氧化应激, 促进缺血再灌注损伤创面的愈合。

4. 总结

作为一个经典的抗氧化应激因子, Nrf2不仅可以促进糖尿病皮肤创面愈合, 减轻辐射造成的皮肤损伤, 而且能提高移植皮瓣的存活率, 改善皮肤缺血再灌注损伤, 在多种类型的创面愈合过程中扮演着重要角色。Nrf2被激活后与Keap1因子分离, 易位至细胞核与ARE结合, 激活下游HO-1、NQO1等抗氧化因子, 从而减轻创面中氧化应激及炎症反应造成的细胞损伤和凋亡, 同时Nrf2可加快新生血管的形成, 通过以上效应促进创面胶原蛋白合成、恢复局部血液供应、促进再上皮化等。Nrf2可被激动剂激活发挥效应, 沉默Keap1基因则能解除Keap1对Nrf2的负性调节作用, 促进创面愈合。

然而, 目前有关Nrf2在创面愈合中的有益作用研究多数局限于动物实验和体外研究, 尚缺乏将Nrf2应用于人体的高质量随机对照研究。鉴于创面不愈合给患者个人、家庭及社会卫生医疗体系带来的沉重负担, Nrf2在创面愈合领域的临床研究是一个重要的方向。在未来的研究中, 深入探讨Nrf2作用的分子机制, 寻找新的Nrf2抑制剂或激动剂, 将是研究者不懈努力的方向。

Funding Statement

湖北省自然科学基金（2020CFB574）；湖北省卫生健康科研基金重点支撑项目（WJ2021Z010）

Natural Science Foundation of Hubei Province of China (2020CFB574); Key Supporting Projects of Hubei Provincial Health Research Fund (WJ2021Z010)